分子生物学研究技术

分子生物学研究技术

Modul e 1:分子生物学研究技术

cDNA文库

cDNA文库，代表了生物体某一器官或组织mRNA中所有的或绝大部分的遗传信息。其构建过程总共有5个步骤（5项技术）：1、总RNA 的提取；2、mRNA的纯化；3、cDNA的合成；

4、cDNA文库构建；

5、基因文库筛选。

详细：

1、总RNA的提取：目前常用的提取方法是异硫氰酸胍-苯酚提取法（Trizol提取法），提取步骤：（1）首先用液氮研磨材料成匀浆，加入Trizol试剂，进一步破碎并溶解细胞；（2）加入氯仿抽提，离心，收集含有RNA的水相；（3）用异丙醇沉淀，初步纯化RNA，获得样品用于下一步mRNA的纯化；（PS：实验中还常将含有RNA的细胞破碎物液通过硅胶膜纯化柱后，再通过低盐浓度下从硅胶膜上直接洗脱RNA，获得纯度较高的总RNA）；

总RNA的浓度、纯度测定：通过分光光度计测其OD260和OD280值，OD260为1时相当于RNA

总量为40μg/ml；而OD260/OD280的比值如果在

1.8~

2.0之间，则表示所提取的RNA纯度较好。

2、mRNA的纯化：纯化原理，将真核细胞的mRNA分子具有5‘端帽子（m7G）和3’端poly （A）尾巴的特征结构，作为提取时的选择性标记。纯化提取方法：常用寡-纤维素柱层析法获，该方法利用mRNA3‘末端的poly（A）尾巴的特点，当RNA流经寡-纤维柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA或特异性结合到柱子上，之后再用低盐溶液洗脱mRNA，经过两次层析后可获得较高纯度的mRNA。

3、cDNA的合成：利用RT-PCR技术，常以oligo（dT）为引物，甲基化的dCTP（保证新合成的cDNA链被甲基化，防止构架克隆时被限制性内切酶切割）。合成基本过程：以mRNA为模板链，在逆转录酶的催化下以甲基化dCTP为原料合成第一条cDNA链；之后再以第一条cDNA 链为模板，在DNA聚合酶催化下合成第二条cDNA（常用RNase H切割mRNA-cDNA杂链中的mRNA序列所产生的小片段为引物合成的第二条cDNA片段，再同过连接酶的作用连接成完整的DNA链。（PS：最后，cDNA两端应加上

不同内切酶所识别的接头序列，保证所获得的cDNA具有方向性）

4、cDNA文库的构建：由于cDNA的长度一般为0.5~8Kb，所以常用质粒载体和噬菌体类的载体便能用于承载cDNA。基本过程：将合成的cDNA连接到特定的载体上，然后将载体转入宿主细胞（一般为大肠杆菌），然后筛选阳性克隆，最终获得cDNA文库。

PS：一般而言，cDNA文库的载体选择要根据文库的用途来确定，例如Uni-zap XR载体是一种噬菌粒载体，具备噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0~10kbDNA片段插入。

5、基因文库筛选：是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需要的重组DNA分子的特定克隆的过程。目前主要的筛选方法有：核酸杂交法、PCR筛选法和免疫筛选法。

核酸杂交法（最常用的筛选方法之一）：（1）将圆形硝酸纤维素膜放在含有琼脂培养基的培养皿表面，将待筛选的菌落从其生长的平板上转移到硝酸纤维素膜上，后进行适当的温育（同时保留原菌板作为对照。）（2）取出已长有菌落的硝

酸纤维素膜，用碱液处理，裂解细菌并使DNA 变性；（3）接着用蛋白酶K处理硝酸纤维素膜上的蛋白质，形成菌落DNA印迹；（4）80℃烘烤滤膜，将DNA固定在膜上；（5）将滤膜与放射性同位素标记的DNA或RNA探针杂交，通过放射自显影显示杂交结果。（X射线底片上显黑色斑点的就是试验中寻找的目的克隆）（6）通过比对显影的结果，可在对应的原菌板上获得相对应的克隆。

PCR筛选法：使用前提，已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。基本过程：（a）将整个文库（以质粒或菌落的形式均可）保存到多孔培养板上；（b）用设计好的目的基因探针对每个样孔进行PCR筛选，鉴定出阳性孔；（c）把每个阳性孔中的克隆在稀释到次级多孔板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定出于目的基因对应的单个克隆为止。

免疫筛选法：基本步骤与核酸杂交检测类似，主要过程：先将菌落或噬菌斑影印到硝酸纤维素膜上，再原位溶解菌落释放抗原蛋白，后用抗体与固定了抗原的膜杂交，抗原抗体结合后，再用标记好的二抗与之反应，最后通过对标记物的检测

便可找到阳性克隆。

基因组DNA文库的构建

基因组DNA文库：是指把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体结合后导入微生物细胞，所形成的所有DNA序列的克隆汇总。应用：1、分离特定的基因片段；2、分析特定的基因结构；3、研究基因表达调控；4、构建全基因组物理图谱和全基因组序列测定。

主要过程：

1、提取样品DNA，将所提取的DNA制备成大小适合的随机DNA片段

2、体外将这些DNA片段与适当的载体连接成重组子

3、将重组子转化到大肠杆菌或其他受体细胞

4、从转化克隆群中筛选出含有靶基因的阳性克隆。

基因组文库的基本要求：必须具有一定的代表性和随机性，以保证能从文库中筛选到某个特定基因。

提高基因组文库代表性的策略：1、用机械切割法或限制性内切核酸酶切割法随机断裂DNA，保证克隆的随机性；2、增加文库重组克隆的数

目，以提高覆盖基因组的倍数。

实例：一般常用限制性内切酶部分消化法和ƛ噬菌体载体来构建基因文库，具体：

①提取真核基因组DNA，用可识别4个核苷酸的限制性内切核酸酶Sau3A 部分消化基因组DNA，②消化的产物经过琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心，收集15~20kb范围的片段；④同时用BamH I消化噬菌体载体（Sau3A和BamH I是同尾酶，前者产生的片段可插入后者切割的缺口）；⑤用T4连接酶将载体与DNA片段相连接，形成重组子；⑥体外包装后用重组噬菌体侵染大肠杆菌受体细胞；产生噬菌斑，组成包含该真核生物基因组绝大部分序列的DNA文库。

酵母杂交系统

1、酵母单杂交系统：

原理：将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）的上游，把报告基因连接到Pmin下游；然后将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活域（AD）融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子使报告基因表达。