基因工程复习资料
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基因工程复习资料1.基因工程操作的主要对象是2.正丁醇在氯化铯－溴化乙锭连续梯度离心法纯化DNA中的作用3.溴化乙锭是很强的诱变剂，含溴化乙锭的废物可以如何处理后不再有危害性？4.通过凝胶电泳回收的DNA样品，因检测需要而含有的溴化乙锭对后续DNA操作有什么影响？5.在一个DNA分子中，若T所占的摩尔比是28.2%，则C所占的摩尔比为6.有氨基酸对应的密码子有几个？7.终止密码子有哪三个？8.起始密码子是9.高温导致DNA双链解链成单链从面引起变性的原因10.DNA变性的过程与特点？11.几种DNA分子的表示方法12.通常DNA右手双螺旋构象的表示是13.RNA和DNA在碱基组成上的区别14.乙醇在提取DNA过程中的作用？15.复性温度取决于什么条件？16.在何种情况下互补的两条DNA单链会结合成双链17.提取质粒DNA时为了使其与其它染色体DNA分开，细胞裂解液pH值应达到多少？18.碱性SDS法提取质粒DNA的原理与步骤19.碱法提取质粒DNA时，为了去除RNA常采用水解RNA的酶是20.提取大肠杆菌质粒DNA之前要培养菌体，在培养基中加入适量抗菌素的目的是什么？21.限制性内切酶作用的底物是什么？22.限制性核酸内切酶切割哪一类型DNA分子时效率最高23.限制酶的命名原则?24.影响限制性核酸内切酶的催化效率的因素有哪些？25.限制性核酸内切酶切割DNA后在其5’和3’端各自产生什么样的末端？26.大多数限制性核酸内切酶的最适反应温度是27.Ⅱ类限制性核酸内切酶的识别序列特点是什么？28.对一克隆的DNA片段做酶切图谱分析，需要用到哪种酶？29.已知某一内切酶在一个环状 DNA 上有 4个切点，当用此酶切割该环状 DNA ，可以得到的片段数是30.在对目的基因和载体DNA进行同聚物加尾时，需采用哪种酶？31.Pω0 DNA 聚合酶比Taq DNA聚合酶准确是因为它具有什么样的酶活性？32.内切酶产生星号活性的主要原因有哪些？33.限制性核酸内切酶是由细菌产生的. 其生理意义是什么？34.重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶是35. E.coli DNA连接酶反应系统中必须的辅助因子是36. E.coli DNA连接酶可以连接哪两种DNA片段？37.T4-DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是什么？38.TaqDNA聚合酶可以不需要模板，在双链DNA的末端加一个碱基，主要是加39.以mRNA为模板，催化cDNA合成的酶是40.cDNA第一链合成通常所需的引物是41. E.col i连接酶的功能?42.S1核酸酶的功能?43.碱性磷酸酯酶的作用是44.DNA片段5′端脱磷酸化的目的是什么？45.在PCR的引物中，引物的3′端不应有46.进行PCR设计引物时，引物的核苷酸序列必须与模板链的哪一段核苷酸序列互补？47.PCR的原理与反应过程48.PCR 提前进入平台期原因有哪些？49.PCR反应中的复性温度取决于哪些因素？50.如果要扩增10-20kb的DNA片段，需要使用什么类型的PCR？51.琼脂糖凝胶中琼脂糖的浓度取决于c Z′基因在克隆子筛选中的作用53.在显色互补筛选法中，阳性转化子的颜色是54.常用的报告基因有哪些？55.若某质粒带有 lacZ’标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入56.TA质粒克隆载体可以用来直接克隆PCR产物的原理？57.各种克隆载体能克隆外源DNA片段的长度是多少？58.质粒概念及特点描述59.如果要将某植物抗病基因转入十字花科植物中，应选择哪种克隆载体60.质粒克隆载体有哪些？61.基因工程载体应具备哪些主要条件？62.基因治疗的临床实施中，一般多选用的基因载体是63.Cos位点是哪种克隆载体的序列64.λ噬菌体线性 DNA 分子的两端各有一个天然黏性末端，该末端包含的碱基数是65.酵母人工克隆载体是由哪几个部分组成的？66.应用于克隆和分离单链外源DNA片段的克隆载体是67.pUC18 与 pUC19 的区别是什么？68.串联启动子表达载体的目的是什么？69.穿梭克隆载体的组成与特点70.Ep克隆载体可以酵母作为宿主，这是因为它含有哪个质粒的复制起始位点？71.在构建cDNA基因文库时应选择哪种克隆载体？72.构建基因组文库时，第一步是对基因组DNA进行随机切割，其方法有哪些？73.质粒被选为基因运载体的理由有哪些？74.质粒克隆载体中MCS是指75.pBR322是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自哪种质粒？76.Pribnow框是指序列77.真核生物结构基因的组成？78.原核生物结构基因的组成？79.基因的化学合成步骤80.根据已知基因序列分离目的基因有哪些方法？81.首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌转化的科学家是82.重组DNA分子导入植物细胞的方法有哪些？83.mRNA分子在结构上的显著特征有哪些？84.核酸或蛋白质标记中常用的放射性标记有哪些？85.真核生物受体菌的细胞有哪些?86.转化大肠杆菌的方法有哪些？其中转化效率最高的是哪个？87.大肠杆菌作为受体菌的优缺点各有哪些？88.植物细胞作为受体细胞有哪些优点及缺点？89.酵母作为受体细胞有哪些优点及缺点？90.哪一种金属离子常用于诱导大肠杆菌感受态细胞91.提取大肠杆菌质粒DNA之前要培养菌体，在培养基中加入适量抗菌素的目的是什么？92.mRNA差别显示技术的技术特点及步骤93.在cDNA技术中，所形成的发夹环可用酶切除？94.cDNA-RDA的技术特点及步骤95.DNA接头在基因工程中的主要作用是96.启动子具有哪些特征97.Southern印迹杂交作用的对象是98.Northern印迹杂交作用的对象是99.1976年，美国联邦政府授权国立卫生研究院就制定了世界上第一个实验室基因工程法规是100.法国于1997年就明确要求从美国进口的农产品必须标示GMO或非GMO的区别，这里的GMO指的是101.有利于基因的蛋白质产物分泌的元件是102.融合蛋白的特性103.可用于蛋白质进一步分离纯化的方法有哪些？104.基因芯片中所采用样品的标记方法有哪些？105.基因芯片的应用范围106.原核生物基因SD区是指107.哺乳动物乳腺生物反应器的优缺点各有哪些？108.干扰素的主要生理作用表现有哪些？109.DNA达到50％变性的温度称为。
基因工程复习资料（已修改）
基因工程复习资料（已修改）基因工程复习资料一、基因工程：概念：基因工程是指采用类似于工程设计的方法，根据人们事先设计的蓝图，人为地在体外将外源目的基因插入质粒、病毒或其他载体中，构成遗传物质的新组合即重组载体DNA分子，并将这种含有目的基因的重组载体分子转移到原先没有这类目的基因的受体细胞中去扩增和表达，从而使受体或受体细胞获得新的遗传特性，或形成新的基因产物。
基本流程：（1）目的基因的分离、获取与制备（2）目的基因与载体连接构建成为重组载体分子（3）重组DNA分子导入到受体细胞（4）外源目的基因阳性克隆的鉴定和筛选（5）外源目的基因的表达二、基因工程的发展简史1、基因工程诞生的背景：（1）发现了生物的遗传物质DNA而不是蛋白质。
（2）明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机制。
（3）遗传密码子的破译。
2、技术上的三大发明：（1）利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶体外切割和连接DNA 片段。
（2）质粒改造成载体以携带DNA片段克隆。
（3）逆转录酶的使用打开真核生物基因工程的一条道路。
3、基因工程的诞生标志（P4）三、工具酶1、限制性核酸内切酶常见的类型：BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、HindⅡ、PstⅠ、SalⅠ、SamⅠ。
2、DNA连接酶常用的类型：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。
3、DNA聚合酶类4、碱性磷酸酶5、末端脱氧核苷酸转移酶6、其他工具酶四、限制性核酸内切酶依来源分类1、同位酶：即识别相同的序列但切割位点不一样。
2、同尾酶：即识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。
3、同裂酶：即识别位点和切割位点均相同的酶。
五、影响限制性核酸内切酶酶切的反应条件1、温度：大部分限制性核酸内切酶最适反应温度为37°C，但也有例外，如SamⅠ的反应温度为25°C.降低最适反应温度，会导致只产生切口，而不是切断双链DNA。
2、盐离子浓度：不同的限制性核酸内切酶对盐离子强度有不同的要求，一般按离子浓度不同分为低（0mmol/L）、中（50mmol/L）、高盐（100mmol/L）三类。
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第一章绪论1.基因工程（genetic engineering）按照人们预先设计的蓝图，将一种生物的遗传物质绕过有性生殖导入另一种生物中去，使其获得新的遗传性状，形成新的生物类型的基因操作（genetic manipulation）。
2.基因工程诞生的基础理论上的三大发现：DNA是遗传物质、DNA双螺旋模型和半保留复制机理、遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。
技术上的三大发明：限制性核酸内切酶的发现与 DNA 的切割、DNA 连接酶的发现与 DNA 片段的连接、基因工程载体的研究和应用3.基因工程研究的主要内容基础研究：基础研究、克隆载体研究、受体系统的研究、目的基因的研究、生物基因组学的研究、应用研究4.基因工程的基本操作程序✓分离获得目的基因✓限制性核酸内切酶将切割源 DNA 和载体✓DNA 连接酶将外源 DNA 和载体连接，组成重组 DNA 分子。
✓将重组 DNA 分子引入受体细胞✓带有重组体的细胞培养扩增，获得大量的细胞繁殖群体✓筛选和鉴定转化细胞✓进一步研究分析，实现功能蛋白的表达第二章工具酶根据工具酶催化的反应类型分为四大类：①核酸酶，用于切割或降解核酸分子：②连接酶，可以把核酸分子连接起来：③聚合酶，用于核酸分子的扩增或拷贝：④修饰酶，能够给核酸分子添增或除去核甘酸或某些化学基团。
常用基因工程工具酶：限制性内切酶、甲基化酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、磷酸激酶和磷酸酶、核酸酶、核酶。
一、限制性内切酶1.R-M 系统：细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。
细菌 R-M 系统的限制酶可以降解 DNA，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身 DNA，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。
2. 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割的一种酶。
高考生物专题复习《基因工程》含答案
高考生物专题复习《基因工程》一、单选题1．（2023·山东青岛·高三期末）自然界中很少出现蓝色的花，天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。
我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）构建基因表达载体（如下图），通过农杆菌转化法导入白玫瑰中，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
下列叙述错误的是（）A．上述获得蓝色玫瑰的方案中需要转入能调控液泡pH的基因B．将idgS基因插入Ti质粒时使用的限制酶是SpeI和SacIC．sfp和idgS基因具有各自的启动子，前者调控后者的表达D．农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上【答案】A【详解】A、分析题意，用农杆菌转化法将链霉菌的靛蓝合成酶基因（idgS）及其激活基因（sfp）导入白玫瑰后，在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝，所以无需转入能调控pH的基因，A错误；B、分析题图可知，将idgS基因插入Ti质粒时可用SpeI和SacI以避免产生的黏性末端环化，增加构建成功的概率，B正确；C、分析题图可知，sfp和idgS基因具有各自的启动子，sfp可激活idgS的表达，C正确；D、将目的基因导入植物细胞可用农杆菌转化法，故农杆菌可将Ti质粒上的T—DNA整合到白玫瑰染色体DNA上，D正确。
故选A。
2．（2023春·江苏徐州·高二统考期中）土壤农杆菌侵染植物细胞时，Ti质粒上的T-DNA片段转入植物的基因组。
利用农杆菌以Ti质粒作为载体进行转基因，下列相关叙述正确的是（）A．T-DNA片段有利于介导外源DNA整合到植物的染色体DNA上B．用Ca2+处理农杆菌，以利于其侵染植物细胞C．Ti质粒是一种环状DNA分子，属于细菌的拟核DNAD．目的基因应插入T-DNA片段外，以防止破坏T-DNA【答案】A【详解】A、Ti质粒上的T-DNA片段能转入植物的基因组中，因此T-DNA片段利于介导外源DNA整合到植物的染色体，A正确；B、农杆菌转化法中不需要用Ca2+处理农杆菌，应直接利用土壤农杆菌感染植物细胞，B错误；C、Ti质粒是一种环状DNA分子，是存在于细菌细胞质中的DNA，C错误；D、在农杆菌转化法中，需要将目的基因插入到T﹣DNA片段上，D错误。
第3章 基因工程 期末复习知识点总结【新教材】人教版高中生物选择性必修三
第3章基因工程1、什么是基因工程：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
2、基因工程的诞生（三个理论和三个技术）：基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科基础上发展起来的，正是这些学科的基础理论和相关技术的发展催生了基因工程，具体有三大理论发现和三个技术突破。
1)理论基础：DNA是遗传物质；DNA分子的双螺旋结构和半保留复制；遗传密码的通用性和遗传信息传递的方式；2)技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割；DNA连接酶的发现与DNA片段的连接；基因工程载体的构建与应用●理论上的三大发现⑴、发现了遗传物质——DNA1944年，艾弗里（O.T.Avery）的肺炎双球菌转化实验⑵、揭示了遗传物质的分子机制：DNA分子的双螺旋结构和半保留复制1953年，沃森（J.D.Watson）和克里克（F.Crick）的DNA双螺旋结构模型、半保留复制图，获1958年诺贝尔奖。
⑶、确立了遗传信息的传递方式：以密码形式传递1963年，美国尼伦伯格（M.W.Nirenberg）和马太（H.Matthaei）确立了遗传信息以密码形式传递，破译了编码氨基酸的遗传密码(3个核苷酸=1个密码子=1个aa)。
●技术上的三大突破⑴、世界上第一个重组DNA实验：实现不同来源DNA的体外重组1972年斯坦福大学化学家伯格（P.Berg）借助内切酶和连接酶将猴病毒SV40的DNA 和大肠杆菌λ噬菌体的DNA在试管中连接在了一起，第一次成功地实现了DNA的体外重组。
⑵、第一个基因克隆实验：重组DNA表达实验，是世界上第一个基因工程实验1973年美国斯坦福大学医学院遗传学家科恩（S.Cohen）将体外构建的含有四环素和卡那霉素抗性基因的重组质粒导入大肠杆菌，获得了具有双抗性的大肠杆菌转化子，成功完成了第一个基因克隆实验。
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第一章绪论1 •基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA）,转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
2•基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现3 •基因工程的基本步骤（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将冃的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞川。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
4 •基因工程的意义（1）基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。
（2）基因工程在工业中的应用：1）纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素來生产葡萄糖，发酵成酒。
2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。
或用酿酒酵母生产蛋白质等。
（3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物；用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂-疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。
（4）基因工程在环境保护中的作用：1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌〃分解油（烷怪类）、有机农药污染。
（5）基因工程商业化的发展第二章基因工程主要技术原理1. 质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么质粒的提取和纯化方法最常用的为碱抽提法：原理：闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离，复性快。
染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起, 在离心的时候沉淀下去。
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第一章一．名词解释1、基因工程：按工程学原理，将外源基因切割，及载体结合，导入受体细胞，使其稳定表达的过程。
2、目的基因：开发人们特殊需要的基因产物或及优良性状相关的基因。
3、工具酶：体外进行合成、切割、连接、修饰等过程需要的酶。
4、药物：在受体细胞内表达产物有药理作用或通过定位整合直接抑制致病基因的。
二．基因工程理论依据（1）基因具有相同的物质基础（2）基因可以切割（3）基因可以转移（4）基因及多肽有对应关系（5）基因的密码是通用的（6）基因可以通过复制遗传给下一代三．基因工程研究内容（1）克隆载体的研究（2）受体的研究（3）工具酶的研究（4）目的基因的研究（5）新技术的研究第二章一．名词解释1、变性：在较高温下，双链间氢键断开，形成单链的过程。
2、复性：变性的，降温时恢复为双链的过程。
3、解链温度：让达到50%变性的温度。
4、复制子：从复制起点开始复制出一个分子或片段的核苷酸序列。
5、启动子：不转录，是聚合酶的识别结合位点。
6、转录区：能转录相应，包括编码区和终止子。
7、操纵子：原核生物中两个以上基共用一个启动子。
8、内含子：真核生物转录区中的非编码间隔序列。
9、限制性核酸内切酶：使一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸酶。
10、稀切酶：有较长的识别序列和富含或的识别序列的限制性核酸内切酶。
11、同裂酶：不同的酶有相同的识别序列。
12、同尾酶：切割不同识别序列产生相同末端的不同酶。
13、黏性末端：两条链断开位置是交错的，叫黏性末端。
14、平末端：两条链断开位置是平齐的，叫平末端。
15、位点偏爱：某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。
16、酶活单位：限制酶最适条件下60分钟切割1所需的酶活性。
17、容积活性：1酶活单位所具有的酶活性。
18、限制酶的活性：一些特定条件下，可以切断及原来识别序列不同的碱基序列，这个现象叫活性。
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基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内切核酸酶是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列（识别序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内切核酸酶一般是以第一次提取到这类酶的生物的属名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.DNA连接酶：定义：DNA连接酶也称DNA黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接DNA链3‘-OH末端和，另一DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌DNA连接酶、T4DNA连接酶、TscDNA连接酶、真核生物细胞发现的连接酶，如酶Ⅰ、酶Ⅱ、酶Ⅲ等多种类型。
4.DNA片段的连接方法：①具互补黏性末端DNA片段之间的连接：可用E?coli DNA连接酶，也可用T4 DNA连接酶。
②具平末端DNA片段之间的连接：只能用T4 DNA连接酶，并且必须增加酶的用量。
③DNA片段末端修饰后进行连接：DNA片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；DNA片段5′端脱磷酸化后进行连接；DNA片段加连杆或衔接头后连接。
5.DNA聚合酶：①定义：DNA聚合酶是指以DNA单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化合成一条与模板链序列互补的DNA新链的酶。
基因工程复习(含答案)
基因工程复习题一、名词解释: （10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交: 将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上, 然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术, 该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。
粘性末端: 双链DNA被限制性内切酶切割后, 形成得两条链错开几个碱基, 而不就是平齐得末端。
Northern印迹杂交: 将RNA进行变性电泳后, 再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术, 可用于检测目得基因得转录水平。
转位: 一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。
基因工程: 在体外, 用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA, 继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞, 最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程, 又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。
目得基因：基因工程中, 那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。
连接器: 人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段, 连接到目得基因得两端, 便于基因重组中得切割与连接。
转化: 受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。
停滞效应: PCR中后期, 随着目得DNA扩展产物逐渐积累, 酶得催化反应趋于饱与, DNA扩增产物得增加减慢, 进入相对稳定状态, 即为停滞效应, 又称平台期。
逆转录PCR: 以mRNA为原始模板进行得PCR反应。
PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板, 引物, 4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下, 特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。
α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中, 插入了lac 启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽）, 该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。
基因工程期末复习资料
一、基因工程的三大关键要素（元件）基因：目的基因（Vs用途,interesting/targetgene）、外源基因（Vs宿主,foreigngene）载体：能将外源基因带入受体细胞，并能维持的DNA分子。
受体：宿主，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）二、基因工程的基本过程依据定义，基因工程的整个过程由工程菌(细胞)的设计构建和基因产物的生产两大部分组成，基本过程如下：(1)从供体细胞分离出基因组dna。
用限制性核酸内切酶分别将外源dNA(包括外源基因或目的基因)和载体分子切开(简称“切”)：(2)用dna连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，形成dna重组分子(简称“接”)。
(3)借助细胞转化手段将DNA重组分子导人受体细胞中(简称转”)。
(4)短时间培养转化细胞．以扩增dna重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中(简称增”)。
（5）筛选和鉴定经转化处理的细胞。
获得外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞（简称检）由此此可见．基因工程的上游操作过程可简化为；切、接、转、增、检：三、质粒载体pBR322系列有哪些特征？BR322质粒载体优点主要表现在以下几个方面：第一，具有较小的分子量。
pBR322质粒DNA分子为4363bp。
第二，具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。
pBR322DNA分子内具有多个限制酶识别位点，外源DNA的插入某些位点会导致抗菌素抗性基因失活，利用质粒DNA编码的抗菌素抗性基因的插入失活效应（图4-15），可以有效的检测重组体质粒。
第三，具较高的拷贝数，通常有大约15个左右的拷贝，在氯霉素存在下，每个细胞中可累积1000～3000个拷贝。
这就为重组DNA的制备提供了极大的方便四、M13系列载体具有哪些优缺点?答：M13克隆系统具有很多优点：(1)克隆的片段大：M13噬菌体的DNA在包装时不受体积的限制，所以容载能力大。
有报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体DNA长6～7倍的DNA(插入片段可达40kb)。
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基因工程复习资料克隆：是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上相同的DNA 分子、细胞或者个体所构成的特殊的生命群体载体：携带外源DNA进入宿主细胞的工具。
化学本质：DNA 1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或者整合能力3.为外源基因的扩增或者表达提供条件。
基因工程的含义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对一种生物（供体）的遗传物质（DNA ）直接进行体外重组操作与改造，并转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
黏性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来DNA连杆，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸构成的、具有一个或者数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。
DNA接头它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。
当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。
载体：携带外源DNA进入宿主细胞，并为其提供复制与功能基因表达调控系统的工具。
目的基因：基因工程中克隆的目标DNA分子SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序，它能够与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补，形成氢键结合，有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始启动子：DNA分子与RNA聚合酶特异结合的部位，也是转录开始的部位基因组文库：某种生物的基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一个受体菌的群体之中，这个群体即为该生物的基因组文库。
cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各类cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称之cDNA文库。
转化：受体菌直接汲取供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。
转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。
感受态：指受体细胞最易同意外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。
转染：将重组λDNA分子直接导入受体细胞的过程。
转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程重组子的筛选：通过各类方法将外源DNA分子导入受体，获得所需目的重组子的过程选择：转化子的初步筛选：通过某种外加压力（如：抗生素）的辨别作用，呈现具有重组DNA分子的特定克隆子的一种方法。
筛选：进一步检测目的重组子：通过某种特定的方法，从受体细胞群体或者基因文库中，鉴定出目的重组子的过程。
启动子：DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列SD序列：核糖体结合位点终止子：在一个基因的3’端或者是一个操纵子的3 ’ 端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称之转录终止子融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或者其他DNA序列编码，C端由真核DNA 的完整序列编码。
转染：将重组λDNA分子直接导入受体细胞的过程。
转导：通过λ噬菌体颗粒感染宿主细胞的途径把外源DNA分子转移到受体细胞内的过程重组子：含有重组DNA分子的转化子转化子：导入外源DNA分子后稳固存在的受体细胞供体、受体、载体是DNA重组技术的三大基本元件DNA体外重组的基本步骤1.目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，通过酶切消化或者PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
2.重组体的制备：将目的基因的DNA 片断插入到能自我复制并带有选择性标记的载体分子上。
3.重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
4.克隆鉴定：筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
基因工程的基本操作步骤：1. 目的基因的获取从复杂的生物基因组中，通过酶切消化或者PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
2. 重组体的制备将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记。
3.重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
4.克隆鉴定筛选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）5.目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物载体应具备的条件： 1.具有对受体细胞的可转移 2.具有与特定受体细胞相习惯的复制位点或者整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记。
限制性内切酶的命名原则前3个字母代表来源的生物,随后1个字母或者阿拉伯数字代表菌株,最后1个罗马字母代表发现或者鉴定的次序star activity高浓度的酶（>100U/g）、高浓度的甘油（>5%）、低离子强度（<25mM）、极端pH值(>pH8.0)等，会使一些核酸内切酶的识别与切割序列发生低特异性，即所谓的star activity现象.抑制star activity的措施①减少酶的用量，避免过量酶切，减少甘油浓度②保证反应体系中无有机溶济或者乙醇③提高离子强度到100～150mM ④降低反应pH至pH7.0 ⑤使用Mg2+作为二价阳离子DNA连接酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，与在另一条DNA 链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用。
体外连接DNA片段的方式黏性末端同种内切酶产生的黏性末端的连接，同尾酶产生的黏性末端的连接，不一致黏性末端的连接。
平末端的直接连接，末端修饰后的连接，加上连杆（linker ），使之形成黏性末端后，再用DNA连接酶连接，DNA接头(adapter)连接法。
平末端DNA片段的连接（1）直接用T4DNA连接酶连接；（2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接；（3）用连杆连接平末端DNA分子；（4）DNA接头连接法。
载体应具备的条件1. 具有针对受体细胞的亲缘性或者亲与性2. 具有与特定受体细胞相习惯的复制位点或者整合位点3. 具有多种单一的酶切位点4. 具有合适的选择性标记自我复制表达，外源基因的插入不影响其功能的发挥，易于从宿主细胞分离出来5. 分子量尽可能小，以提高其载装能力质粒DNA的复制类型严谨型质粒松弛型质粒天然质粒的缺陷（1）分子量大，拷贝数低（2）筛选标志不理想构建质粒克隆载体的基本策略1能在受体中进行有效的复制（有复制起始位点）。
2含多克隆位点3含有供选择克隆子的标记基因，如：常用的标记基因：Apr，Kmr，Smr，Tcr基因等4 DNA分子尽可能小与较高的拷贝数。
5根据特殊需要，组装各类“元件”，构建不一致用途的质粒克隆载体。
质粒克隆载体的构建1选择合适的出发质粒2正确获得构建质粒克隆载体的元件3组装合适的选择标记基因4选用合适的启动子5构建过程力求简单DNA插入而导致基因失活的现象，称之为插入失活效应。
蓝白斑筛选Ampicillin 抗性与lacZ的肽互补（蓝白斑）相结合。
-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖与一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝Ti质粒介导转化的过程①根癌农杆菌对植物细胞的识别与附着②根癌农杆菌对植物信号物质的感受③根癌农杆菌Ti质粒上的vir基因与染色体上操纵子的活化④vir区基因被激活，virD基因编码的核酸内切酶分别将T-DNA的RB序列与LB序列切出单链切口，释放出T-DNA的单链线性拷贝，T-DNA复合体的产生⑤T-DNA复合体在RB序列的引导下定向地穿过农杆菌的细胞膜、细胞壁、进入植物细胞壁并整合到植物的染色体基因组中TA克隆的优点不需使用含限制酶序列的引物，不需把PCR产物做平端处理，不需在PCR 扩增产物上加接头，即可直接进行克隆。
TA克隆注意事项1. 要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。
2. PCR产物在TA克隆前要通过纯化。
3. 在PCR产物回收、纯化过程中防止外来DNA污染。
真核生物的启动子：真核生物有三种类型的RNA聚合酶，每一种都有对应的启动子。
1.RNA聚合酶I只转录rRNA，故只有一种启动子。
2.RNA聚合酶II转录mRNA，其启动子最为复杂；3.RNA聚合酶III转录tRNA与5S rRNA，其启动子大都是位于转录的DNA序列之内，称之下游启动子。
目的基因的获得:直接分离法;PCR扩增;构建基因组文库法;构建cDNA文库法;化学合成法直接分离法:限制酶酶切法(DNA分子已测序/目的基因已定位)基因组文库的构建(DNA未测序或者未定位)：使用限制酶切割构建基因组文库筛选目的基因克隆基因文库构建的通常步骤：（1）染色体DNA大片段的制备①酶切法②物理切割法（2）载体与基因组DNA大片段的连接①粘性末端直接连接②人工接头法（3）转导受体（4）筛选重组子cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。
cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各类cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称之cDNA文库。
cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库是有的时候效性的。
cDNA文库的特点优点：分离的目的基因可直接用于表达；比DNA文库小的多，容易构建缺点：只与编码序列有关；不能反映内含子；不能反映启动子、终止子与与核糖体识别的序列构建cDNA文库的通常步骤：（1）总RNA（total RNA）提取（2）mRNA的分离纯化①原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。
②mRNA的分离纯化Column（柱）（3）cDNA的合成①cDNA第一链合成②降解mRNA模板③cDNA第二链合成（cDNA 第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法与引物－衔接头合成法。
）（4）cDNA与载体连接：（5）噬菌体颗粒的包装及转染或者质粒的转化（导入宿主中繁殖）基因的化学合成：寡核苷酸单链的化学合成；探针的化学合成；连接子与接头的合成；基因的半合成；全长基因化学合成目的基因的分离：目的序列已知：通常使用PCR技术或者分子杂交技术分离克隆目的基因目的序列未知：差异表达序列；无差异表达的目的序列，可使用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法基因克隆的方法：一、目的基因的功能克隆二、序列克隆法三、差别杂交法四、减法杂交技术五、mRNA差别显示技术功能克隆：根据已知基因的产物推断出其相应核苷酸序列，再根据此序列合成寡核苷酸探针，从cDNA文库或者基因组文库中调取目的基因表型克隆：如差异筛选法、差减杂交（SH）、mRNA差别显示技术（DDRT-PCR）、代表性差异分析（RAD）、抑制型差减杂交（SSH）等无基因序列及表达功能信息，但具有基因遗传图，转座子标签等条件，常用图位克隆与转座子标签法克隆目的基因的功能克隆：在纯化相应的编码蛋白后构建cDNA文库或者基因组文库，然后从文库中筛选目的基因1、根据特异蛋白分离目的基因分离、纯化目的蛋白测定特异的氨基酸顺序推测编码该蛋白的核苷酸序列人工合成一段寡核苷酸探针从cDNA文库或者基因组文库中筛选编码基因分离、纯化目的蛋白目的蛋白免疫动物，制备抗体从cDNA表达文库中筛选目的基因根据特异蛋白分离目的基因局限性：特异蛋白已鉴定并分离纯化某些基因产物，难以分离纯化非所有基因有蛋白质产物遗传密码的简并性2、功能互补法克隆基因：利用被克隆的外源片段与宿主细胞染色体DNA具有功能互补。