构建载体心得和体会
建构活动教研感悟
建构活动教研感悟
作为一名老师，一直以来我都非常关注于如何提高学生的研究效果和兴趣。
最近，我参与了一场建构活动教研，从中获得了许多宝贵的经验和感悟。
首先，建构活动是一种高度参与性的研究方式。
通过参与建构活动，学生能够更主动地参与到研究过程中，积极思考和合作解决问题。
这种研究方式能够激发学生的研究兴趣，提高他们的研究动力。
其次，建构活动能够促进学生的创造思维和解决问题的能力。
在建构活动中，学生需要根据自己的理解和想法，自主设计和创建产品。
这要求学生具备创新和解决问题的能力，培养了他们的创造力和自信心。
此外，建构活动还能够提高学生的团队合作和沟通能力。
在建构活动中，学生需要与其他同学一起合作，共同完成任务。
这种合作过程能够培养学生的团队合作和沟通技巧，提高他们的合作意识和能力。
通过参与建构活动教研，我深刻意识到建构活动对学生研究的积极影响。
作为一名老师，我将更加积极地运用建构活动教学法，帮助学生培养创新思维、解决问题的能力，促进他们的团队合作和沟通技巧。
总之，建构活动是一种高度参与性的研究方式，能够提高学生的研究效果和兴趣。
通过参与建构活动教研，我深刻体会到了其积极的影响，将会在今后的教学中更加广泛地应用这种教学方式。
以上是我在建构活动教研中的一些感悟和经验。
希望这些对于教学实践有所启示和帮助。
建构活动教研体会
建构活动教研体会
在这次建构活动教研中，我认为学生们从中获益良多。
以下是我对此次教研的一些体会和总结。
首先，建构活动极大地激发了学生们的创造力和想象力。
通过参与建构活动，学生们有机会将自己的想法和概念转化为实际的作品。
这不仅加强了他们在空间感知和手眼协调方面的能力，还培养了他们的创新思维和解决问题的能力。
其次，建构活动鼓励学生们进行团队合作。
在建构过程中，学生们需要相互合作、协调和交流，以确保他们共同完成一个作品。
通过与同伴合作，学生们学会了倾听和尊重他人的意见，同时也学会了如何有效地与他人合作，这对他们今后的研究和工作中都非常重要。
此外，通过参与建构活动，学生们还能够锻炼他们的问题解决能力。
在建构过程中，学生们会遇到各种挑战和难题，需要运用他们的智力和创造力来解决。
这种锻炼能够提高他们的逻辑思维能力和独立解决问题的能力。
最后，建构活动还可以激发学生们对学科的兴趣和热情。
通过亲身参与到学科实践中，学生们可以更加深入地理解和体验学科的知识和技能。
这不仅能够提高学生们对学科的研究动力，还有助于他们将学科中的理论知识与实际应用相结合。
综上所述，建构活动教研对学生们的发展起到了积极的促进作用。
它不仅培养了学生们的创造力、合作能力和问题解决能力，还激发了学生们对学科的兴趣和热情。
希望在今后的教学中能够继续推广和开展建构活动，以促进学生们的全面发展。
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主题教育载体建设心得体会
主题教育载体建设心得体会近年来，中国共产党高度重视主题教育工作，将其视为推动党员干部学思践悟、锤炼忠诚担当、提升工作能力的重要途径。
在推进主题教育过程中，构建有效的主题教育载体显得尤为重要。
本文旨在总结和分享在主题教育载体建设方面的心得体会。
I. 加强组织领导确保落地实施主题教育是全面从严治党的一项重大决策部署，在开展这一工作时，各级党委和纪委领导必须承担起责任并加强对主题教育的组织领导。
制定明确的任务分工和时间节点，并派出专门机构或团队负责具体执行和监督工作的进展。
只有坚持“集中统一领导，分级负责具体实施”的原则，才能确保主题教育取得真正成效。
II. 打造多样化的宣传平台引导广泛参与为了让更多党员干部参与到主题教育中来，我们应该打造各种多样化的宣传平台，以引导广泛参与。
可以通过党内刊物、电视台、广播以及网络等方式，发布党的主题教育相关政策文件和会议精神，并邀请专家学者撰写解读文章进行深入解析。
此外，还可开展线上线下互动交流活动，为党员干部提供学习交流的机会。
III. 打破原有思维模式创新载体形式在主题教育工作中，我们应该打破过去单一模式的思维定势，积极探索创新主题教育载体的形式。
可以根据不同领域、不同级别制定特色载体方案，在企事业单位设置调研基地或实践基地，为党员干部提供实践锻炼和交流学习的平台。
同时也可以通过组织巡回报告、征集心得等方式丰富主题教育形式。
IV. 推进网络化建设提高覆盖面随着信息技术的快速发展，网络已经成为我们获取信息和进行交流学习的重要渠道之一。
在主题教育中，推进网络化建设是必不可少的步骤。
构建一个覆盖全员、便于交流的网络平台，为党员干部提供海量学习资源和交流互动的机会。
同时，我们还应该注重培养党员干部正确使用网络的技能，以防止信息泄露和不良影响。
V. 加强评估与监督确保主题教育质量有效的评估与监督是主题教育工作中必不可少的环节。
通过设立专门委员会或者给各级纪检机关赋予更多权力来监督主题教育工作的实施情况。
主题教育活动载体设计心得体会
主题教育活动载体设计心得体会在参与和组织主题教育活动过程中，设计合适的活动载体至关重要。
通过合理选择和设计活动载体，可以更好地促进学习、交流和反思，提高主题教育的效果。
以下是我对主题教育活动载体设计心得体会的分享。
一. 活动形式创新1. 主题讲座与研讨会相结合在主题教育活动中，举办专题讲座是常见的方式。
但单纯的传统讲座容易导致被动接受信息，缺乏互动性和实践性。
因此，在进行讲座形式的教育活动时，可以与研讨会相结合。
在专家引导下，参与者可以分组进行讨论、交流和分享经验，从而深入探讨主题内容，并将知识应用于实践中。
2. 现场模拟演练针对某些特定主题（如危机管理、突发事件处置等），通过现场模拟演练能够更直观地感受到工作环境、压力和责任。
为此，可以邀请专业人士带领演练，设置真实情景，并利用角色扮演的方式，让参与者在模拟环境中进行应对。
通过实践操作和经验积累，参与者能够更好地掌握应对策略，提高应急处置水平。
二. 多元化媒体运用1. 制作主题教育微视频在传播信息和表达思想的过程中，视频是一种非常有效的媒介。
我们可以利用现代科技手段，制作主题教育微视频。
视频时间短小精悍，能够吸引受众注意力，突出主题要点，并融入生动有趣的形象、音乐等元素，使得学习过程更加愉快和高效。
2. 开展线上互动在主题教育活动中，线上互动成为了一种非常流行的形式。
可以通过电子邮件、社交媒体平台或在线论坛开辟专门的交流渠道，在线答疑解惑、集智共识。
除此之外还可以创建“云”学习群组或小组讨论等活动，提供多样交流方式促进成员之间的交流沟通和合作学习。
三. 注重体验式学习1. 实地考察与观摩学习实地考察和观摩学习可以帮助参与者更好地了解实际情况，并从中汲取经验和教训。
为此，可以选择对组织文化、生产流程等方面有代表性的企业、基层单位进行实地考察。
通过亲身感受和参与其中，参与者能够更加深入地理解主题内容，并将理论知识与实践相结合。
2. 情景体验式学习主题教育活动中，设立情景体验式学习环节是非常有必要的。
幼儿园构建活动感想
幼儿园构建活动感想作为幼儿园的一名老师，我深知孩子们的成长不仅仅是在教室里进行的，更需要在各种活动中去感受和体验。
因此，我非常重视幼儿园构建活动，认为这是孩子们在成长过程中需要参与和体验的一种重要活动。
我对幼儿园构建活动的意义有着深刻的理解。
首先，这种活动可以帮助孩子们培养动手能力和创造力。
在活动中，孩子们需要用手去搭建、组装一些简单的构件，这既能锻炼他们的动手能力，也能激发他们的创造力。
其次，构建活动可以培养孩子们的合作意识和团队精神。
孩子们要想完成一个构建任务，就需要相互合作，共同努力，这对于他们的合作意识和团队精神是一种很好的培养。
再次，构建活动可以帮助孩子们培养自信心和毅力。
在活动过程中，孩子们可能会遇到很多困难和挫折，但只要他们坚持下去，最终会将构建完成，这可以让他们更加了解到自己的潜力和坚强的意志。
最后，构建活动可以丰富孩子们的想象力和创造力。
在活动中，孩子们可以尽情地去发挥自己的想象力和创造力，构建出各种美丽的作品，从而激发他们对于美的追求和表达。
在参与幼儿园构建活动的过程中，我发现孩子们的成长和收获是非常显著的。
他们在活动中能够快乐地参与其中，充分地发挥自己的想象力和创造力，尽情地去探索和创造。
他们还能够培养出良好的合作意识和团队精神，互相帮助，共同努力，最终完成属于自己的作品。
而且，在构建活动中，我也能够看到孩子们变得更加自信和坚强，因为他们在不断的尝试和挑战中，不断地发现自己的优点和潜力，从而变得更加自信和坚强。
除此之外，构建活动还能够激发孩子们的学习兴趣，促进他们对于美的追求和表达，培养他们对于美的敏感和热爱。
然而，在幼儿园构建活动中，也存在一些问题和挑战。
例如，孩子们在构建活动中可能会出现一些意见分歧，导致合作困难；在搭建过程中，孩子们可能会受到一些安全隐患的影响。
因此，我们需要做好相关的准备工作和安全保障，确保孩子们在构建活动中能够安全、快乐地参与其中。
另外，构建活动还需要一些相关的教学资源和教学方法的支持，以便让孩子们在活动中能够得到更好的指导和帮助。
建构活动教研心得感受
建构活动教研心得感受
在参与建构活动教研的过程中，我深深地感受到了它的重要性和价值。
建构活动教研是一种基于学生的主体性和探究性的教学方法，通过学生参与实际的建构活动，来促进他们的研究和发展。
首先，建构活动教研可以激发学生的研究兴趣和主动性。
传统的教学方法往往是老师讲，学生听，学生在被动接受知识的过程中缺乏主动性和积极性。
而通过建构活动教研，学生可以亲身参与到实际的建构活动中，主动探索和发现知识，这样的研究方式更加符合学生的天性和需求，从而激发他们的研究兴趣。
其次，建构活动教研可以培养学生的创新和解决问题的能力。
在建构活动中，学生需要运用已有的知识和技能，去解决实际的问题，这要求他们具备一定的创新思维和问题解决能力。
通过参与建构活动教研，学生可以不断锻炼和提升这些能力，培养他们的创造力和创新精神，为他们未来的发展打下坚实的基础。
此外，建构活动教研还可以促进学生的合作与交流能力。
在建构活动中，学生通常需要与他人合作完成任务，这可以帮助他们培
养合作精神和团队意识。
同时，学生还需要与他人进行交流和协商，以确保任务的完成。
通过这样的合作和交流，学生可以研究和借鉴
他人的经验和知识，提高自己的研究效果。
综上所述，建构活动教研是一种有益且有效的教学方法。
它可
以激发学生的学习兴趣和主动性，培养他们的创新和解决问题的能力，促进他们的合作与交流能力。
因此，我们应该积极推广建构活
动教研，让更多的学生受益于这种教学方法的优势。
教学构建模型心得体会
作为一名教师，我在教学过程中不断探索、实践和总结，逐渐形成了一套自己的教学构建模型。
这个模型以学生为中心，注重培养学生的自主学习能力和创新能力，同时也关注教师的专业成长。
以下是我对教学构建模型的一些心得体会。
一、以学生为中心，关注学生个体差异在构建教学模型的过程中，我深刻认识到，学生是学习的主体，教师只是引导者和协助者。
因此，我在教学过程中始终以学生为中心，关注学生的个体差异，尊重学生的兴趣和需求。
1.了解学生：在授课前，我会通过各种方式了解学生的知识基础、兴趣爱好和学习风格，以便有针对性地设计教学活动。
2.激发兴趣：针对学生的兴趣爱好，设计富有创意的教学内容和方法，激发学生的学习兴趣。
3.分层教学：根据学生的个体差异，将学生分为不同层次，实施分层教学，使每个学生都能在原有基础上得到提高。
4.关注个体：在教学中，关注每个学生的表现，及时给予鼓励和表扬，帮助学生树立自信心。
二、注重自主学习，培养学生的创新能力在构建教学模型的过程中，我注重培养学生的自主学习能力，使他们成为学习的主人。
同时，通过激发学生的创新能力，为他们的未来发展奠定基础。
1.创设情境：通过创设生动、有趣的情境，激发学生的求知欲，让他们在轻松愉快的氛围中学习。
2.自主学习：引导学生学会独立思考、分析问题、解决问题，培养他们的自主学习能力。
3.合作学习：鼓励学生之间的合作与交流，让他们在互动中共同进步，培养团队协作精神。
4.创新实践：通过开展各种实践活动，激发学生的创新思维，培养他们的创新能力。
三、关注教师专业成长，提升教学质量在构建教学模型的过程中，我认识到教师的专业成长对于提高教学质量至关重要。
因此，我注重以下几个方面：1.不断学习：积极参加各类培训，不断更新自己的教育理念和教学方法。
2.反思总结：在教学过程中，认真反思自己的教学行为，总结经验教训，不断改进教学方法。
3.交流合作：与其他教师开展教学研讨，分享教学心得，共同提高教学质量。
整体建构感悟心得体会(3篇)
第1篇在参加整体建构培训的过程中，我深刻体会到了整体建构的重要性以及它所带来的巨大影响。
整体建构不仅仅是一种教学方法，更是一种教育理念，它强调教育的全面性、系统性，旨在培养具有综合素质的人才。
以下是我对整体建构的一些感悟心得体会。
一、整体建构的内涵整体建构是指以学生为中心，关注学生的全面发展，将知识、能力、情感、价值观等方面有机融合的教育理念。
整体建构强调教育的整体性，要求教师在教学中做到以下四个方面：1. 知识建构：关注学生对知识的掌握程度，引导学生主动探索、发现和构建知识体系。
2. 能力建构：培养学生的思维、创新、实践等能力，使其具备适应社会发展所需的各种能力。
3. 情感建构：关注学生的情感需求，引导学生树立正确的人生观、价值观，培养良好的道德品质。
4. 价值观建构：培养学生的社会责任感、集体主义精神，使其成为有益于社会的人才。
二、整体建构的优势1. 提高教学质量：整体建构关注学生的全面发展，使学生在知识、能力、情感、价值观等方面得到全面提升，从而提高教学质量。
2. 培养创新人才：整体建构注重培养学生的创新思维和实践能力，使学生在面对问题时能够提出新颖的解决方案。
3. 促进学生全面发展：整体建构关注学生的个性发展，使学生在德、智、体、美等方面得到全面发展。
4. 增强教育公平：整体建构强调教育资源的均衡配置，使每个学生都能享受到优质的教育资源。
三、整体建构的实施策略1. 教师角色转变：教师应从传统的知识传授者转变为学生的引导者、合作者和参与者，关注学生的全面发展。
2. 教学内容整合：将知识、能力、情感、价值观等方面有机融合，设计具有挑战性和趣味性的教学活动。
3. 教学方法创新：采用多种教学方法，如探究式学习、合作学习、项目式学习等，激发学生的学习兴趣。
4. 评价方式改革：采用多元化的评价方式，关注学生的全面发展，鼓励学生展示自己的特长。
四、个人感悟通过参加整体建构培训，我深刻认识到整体建构的重要性。
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转载一篇别人的载体构建的心得与体会这两年在美帝净做克隆实验了，以前读PHD时候还觉得自己分子克隆挺牛X的，来这边之后做了各种各样的构建才知道以前是坐井观天，刚才粗粗统计了一下，在美帝一年零八个月，我构建的质粒的超过四百个，其中有很简单从PCR构建到拿WB结果的一共不到一周，也有巨难的花了四个月时间换了几次strategy才弄好激动得我半夜給老板发信的品种;有单片段酶切插入这种不用脑型的，也有九个片段逐一插入正反向还不同的。
专家不敢说，但是熟能生巧，确实积累了不少经验，现在系里从POSTDOC到PHD学生到TECH构建前很多人都跟我商量(做博后结果成了技术员的人生真悲哀啊)。
我老板甚至开玩笑说，我们将来开个公司，我专门负责构建(这话听得我想揍他大家同意不?)想了想还是把经验写下来，一来做个记录，二来博同行一笑，能让大家少绕点弯路则更好。
1. 准备工作俗话说用欲善其事，必先利其器。
我强烈建议大家在做构建之前先找好工具，这样起的效果事半功倍。
这里说个笑话，我们系有个新PHD学生，是个印度女孩，很聪明很刻苦，她所在的实验室也很好，不过除了她之外包括老板在内都是生物物理背景的，以前一个生物POSTDOC在的时候还好，这个POSTDOC一走，整个实验室对分生就只有一个粗浅的概念，这个女孩就想把一个质粒上的基因插到另一个质粒上去，要是我就先查查有没有合适的酶切位点，要没有就改造一下质粒一切搞定，这女孩她不懂啊(要命的是她老板固然牛，对这方面也不懂)，自己辛辛苦苦设计了PCR引物去做PCR，P了将近5K的产物去测序，结果测的结果中间有个MUTATION，要懂行的就找找酶切位点，从原来的替换上去，然后测这下这段就行。
她呢，又送去了若干了质粒一个接一个的测，一个测序反应这边是8刀,一个质粒测下来就是40刀，她光测序就要花好几百刀(你得佩服老美实验室真有钱呀)。
这件事教育我们准备工作是多么重要。
这里推荐大家两个工具，一个都知道，PRIMER5.0。
另一个工具极强大，也不知道国内流行不，叫lasergene，包括设计引物到构建图谱一应俱全，图谱非常漂亮，而且分析酶切位点等等就超NB，如果感兴趣的话我可以給大家传一个图谱看看。
2. PCR如果没有现成的质粒可供酶切，PCR是最理想也是最方便的策略。
关于PCR具体技术坛子内帖很多，我不多说了，这里仅在构建方面谈一谈。
（1）如何设计引物?首先，看懂质粒图谱!拿大家比较熟悉的PEGFP-C1和PEGFP-N1做例子。
想用N1质粒，设计引物就得把下游引物上的中止密码子去掉，不要辛辛苦苦的一路做下来结果根本不表达融合蛋白，你就死了;C1质粒，注意frame，要是移码了，你也死了。
而且PEGFP系列有1.2.3，要弄清楚别弄窜了。
一句话，要看懂你的图谱!再多一句，PEGFP的XBA1和Bcl1位点不能用。
注意在设计酶切位点的时候要加保护碱基(大家要用T载体就当我没说)。
酶切位点设计也有一定的讲究，我的原则是，能用粘端就用粘端，实在不能用的就用只好用一些常用的平端酶，如ECORV和SNAB1之类，要是以后还有别的用处就多加点酶切位点，我曾一口气在引物上加了五个酶切位点以防以后要用到，注意计算TM的时候要减去这些不match的序列，或者选用touch-up策略。
除了酶切位点，还要注意KOZAK序列的问题，很多质粒没有提供KOZAK序列，这要在设计的时候直接在引物上加好。
GENE OVERLAP也比较有用，比方说加个FLAG片段，HIS片段，2A序列之类的，直接设计三引物OVERLAP一下就可以，省得还要再多构建一步，这些都是设计引物时候就要考虑好的。
引物长一点不要紧(我最喜欢两步法了)，尤其是对GC比高的序列，有时候引物不长PCR根本不出结果，注意如果GC比较高，这个时候GENE OVERLAP就不要做了，很麻烦，克隆很难挑。
（2）没有合适的酶切位点?很简单，用同尾酶策略，比方说Bgl2和BamH1,Nhe1和spe1，Xho1和Sal1(注意连上了切不下来)，实在不行就平端吧，只要不超过4KB，平端酶连接也不那么难。
（3）如何选择Taq酶?选择Taq酶也很关键，首先，高保真(High fidelity)这是必须的，我在国内常用LA KIT，可这边忑贵，只好用美国货。
常用的PFU，PHUSION和PFX。
PFX50是invitrogen公司的，一度曾卖到脱销，保真性应该是目前最高的，是普通Taq的50倍，对一般基因绝无问题(我同事4.5K PCR产物,居然一个突变都没有)，但是对比较难PCR的高GC或者位点比较难做PCR 的基因(基因组为模板)就明显不行了;PFU(安捷伦)保真性没有PFX50高，但是能力很强，略贵点; phusion是NEB公司的，不贵，但是这个酶很怪异，每次用都要把annealing温度调高好几度，否则就出杂带，个人觉得NEB内切酶绝对是NO.1，但是Taq就不如Invitrogen了，如果实验室有钱，直接买invitrogen的spuermix，什么都混好了，连ddH 2O都搞定，只要直接向里加模版和引物就OK，每次我要拿漂亮的结果都用supermix。
还是那句话，读说明书。
同是高保真Taq酶，iproof 要求98度起始1min，pfx就要求95起始2min ，延伸有的是72，有的是68，有的要加1uL,有的加0.5，有的TM要低五度，有的高三度，这些必须要读说明书，读且仔细读，这是拿到任何试剂都要做的第一步。
（4）如果基因太难PCR，怎么办?首先，DMSO是好物，好到甚至FISHER的Phusion就直接写上了DMSO这项，注意3%-6%，太高Taq酶活性就不行了。
如果GC太高而且片段过长的话，DMSO也不行，GC低的不推荐。
我做个过一个2.8 k, GC比高达92%的基因PCR，一共做了两周，从保真性最强的PFX50到普通的promega 2xGO Taq都试过，什么DMSO，甘油，Biorad的iproof with high GC Buffer, NEB one Taq 2x Taq High GC(还带Enhancer的)，TAKARA 的LA都试过，都不行，要么不出带，要么就是乱七八糟的带一起来，头晕脑涨的我都打算抹平策略了，后来从别的实验室弄来一个clontech的2 GC rich kit，一次搞定! 强烈推荐这个KIT，太牛了，在别家都缴械的时候，它一锤定音，不过价格也比别家都牛，10次反应就130刀，其实实验室大可以备一个，就是防备超高GC又长的片段。
不过这个KIT非高保真，送了三个克隆测序，各在不同部位有突变，于是我就从A克隆切一段接到B克隆上，又从C克隆切一段接B克隆上。
注意的问题是GC比太高测序也很困难，正常GC能测1K左右，到了High GC就能测个五六百，这时要多准备些引物。
（5）PCR产物的纯化如果带很单一，又强，直接PCR产物纯化就可以，如果有杂带，但目的带也很强，跑胶，目的带切胶回收。
回收这里也有个瓶颈，就是回收率的问题，我试过很多家的KIT，promega的GEL回收试剂盒效率和价格都很合适，推荐这个。
关于T载体，我在国内的时候是必用的，到了美帝反倒一次没用过，这边比较流行直接用PCR产物切，就是回收完了直接切上，回收后然后连接，这又回到了最开始设计，要加保护碱基。
这个策略好处就是免除了T载体这步，直接插入目的载体，存在的问题就是处于盲做状态，还要加保护碱基。
3. 酶切我的原则一向是：尽量避免PCR，能酶切的多酶切，实在没办法才去PCR。
这里强烈推荐NEB的内切酶，还记得在有一次用别家的酶切过夜，结果质粒都被切碎了(当然当时质粒浓度也不高)，而用NEB的酶，切个七十二小时仍旧一切OK，尤其现在NEB还推出了HF的内切酶，没有星活性而且统一都用Buffer4，很好用，在国内我都用TAKARA的酶，基本上还可以。
注意要读说明书，选用什么buffer，多少度，用不用加BSA，这些都要仔细读。
酶切的起始量，PCR产物没甚么可说的，全都切上，如果是从质粒上切片段，要根据你片段大小，片段适中，比如说7 kb质粒，有2 KB是目的片段，这时切个3-4 ug就足够了，如果只有0.2 KB,那最好多切点，6 ug-7 ug内切酶也没问题。
4. 连接最常用的是NEB的T4和Promega的T4,都很好用，但是注意Buffer里有ATP，反复冻融ATP失活得很快，这时有两种办法，一种是象我们chair实验室，每次连接都统统朝里面加1uL ATP;另一种是我们实验室的策略，拿到buffer就分装，10 uL/管，一次性使用，哪怕就用1uL，剩下的直接扔掉。
连接最重要的注意事项：（1）载体总量；（2）载体和插入片段比例；（3）载体和插入片段质量。
我在回收之后都要测载体浓度，一般来说，载体浓度在20-100 ng/uL很好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，总量从50-100 ng就可以，太低失败几率很高，太高克隆太多，挑克隆会很麻烦，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低，而且对感受态细胞也是个挑战，通用10-15 uL，我试过25 uL没有问题，40 uL就不行了。
载体和插入片段比例一般是1:3，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高载体浓度，同时加大比例1:10，我试过一端平一端粘连接，4 kb片段，4KB载体，连接成功率相当高，10个克隆里8个都是阳性的，但是7 KB片段，5 KB载体的平端连接就连试两周都失败，最后换策略分两段先后克隆进去的，这也給了我很深教训，隔了一阵又做类似的实验，这回我干脆连试都没试，继续分成两段分别连进去的。
3片段连接同理，如果片段不太大，比方说小于3 K，3片段连接成功几率很高，但是如果你片段太大，就不行了，我试过4 K载体，4 K片段A，2 K片段B连接，失败四五次，最后还是绕路走了。
5. 转化这个简单遵循基本的准则就行，话说实验室原来从sigma买感受态(competent cell)，后来发现还是自己做的效率高，尤其在使用XL-10细菌的时比DH5a效率要高，需要的话我可以发protocol上来。
要注意的是LB必须无菌而且没有抗生素，实验室原来有个volunteer，做一次失败一次，我就奇怪了，后来才发现他用的居然是加了KANA的LB，直接晕过去了。
还有就是氯化钙的问题。
氯化钙吸水性很强，吸水后就完蛋了，我一般把它放在干燥罐里(反正我也不知道啥名字，就那种玻璃罐，干燥用的)，大家要不放心，用之前可以把氯化钙放在烘箱里烤一烤。
6. 鉴定普通实验做酶切鉴定，阳性率非常高，大多数情况下四个中起码有三个是正确的，很多时候都是百分百正确，这里推荐一种叫fast digest的酶，切个十几分钟跑胶就行了。