蛋白质分离技术(全)
生物蛋白质分离知识点归纳总结
生物蛋白质分离知识点归纳总结蛋白质分离是生物化学和分子生物学研究中的重要技术。
它涉及到从复杂的生物样本中提取、纯化和分析蛋白质。
以下是对蛋白质分离技术的一些关键知识点的归纳总结：1. 蛋白质分离的原理：- 分子大小：利用不同蛋白质的分子量差异，通过凝胶过滤层析进行分离。
- 电荷差异：通过离子交换层析，根据蛋白质在不同pH值下的电荷差异进行分离。
- 疏水性：利用疏水相互作用层析，根据蛋白质的疏水性强弱进行分离。
- 亲和力：通过亲和层析，利用特定配体与目标蛋白质的亲和力进行分离。
2. 常用的蛋白质分离技术：- 凝胶过滤层析（Size Exclusion Chromatography, SEC）：根据蛋白质的大小进行分离，大分子先流出，小分子后流出。
- 离子交换层析（Ion Exchange Chromatography, IEC）：根据蛋白质的电荷差异进行分离，正电荷的蛋白质在低pH下吸附，负电荷的蛋白质在高pH下吸附。
- 疏水相互作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC）：根据蛋白质的疏水性进行分离，疏水性较强的蛋白质先被吸附。
- 亲和层析（Affinity Chromatography）：利用特定的配体与目标蛋白质的高亲和力进行特异性分离。
- 电泳技术：如SDS-PAGE，根据蛋白质的分子量进行分离。
3. 蛋白质分离的策略：- 预处理：包括细胞破碎、蛋白质提取和初步纯化。
- 多步骤纯化：通常需要通过多种层析技术组合，逐步提高蛋白质的纯度。
- 分析与鉴定：利用质谱等技术对纯化后的蛋白质进行鉴定和定量分析。
4. 蛋白质分离的影响因素：- 蛋白质的稳定性：在分离过程中需要考虑蛋白质的稳定性，避免变性或降解。
- 缓冲液的选择：缓冲液的pH值、离子强度和组成都会影响蛋白质的分离效果。
- 温度和压力：温度和压力的变化会影响蛋白质的折叠状态和相互作用，进而影响分离效果。
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
蛋白质分离技术全ppt课件
蛋白质 的分离与纯化
一、 引言
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理三、蛋白质（酶来自分离 与纯化四、层析技术
五、电泳技术
六、离心技术
1
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
26
Salting-in
Salting-out
溶 解 度
盐浓度
27
水化膜
++ + +
碱
+
+
++ +
酸
带正电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
水化膜 碱
酸
等点电时的蛋白质 （亲水胶体）
脱水
带负电荷蛋白质 （亲水胶体）
脱水
• 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• ①成本低，不需要特别昂贵的设备。 • ②操作简单、安全。 • ③对许多生物活性物质具有稳定作用。
25
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。
• 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。 • 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水
• 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
蛋白质分离纯化的技术
蛋白质分离纯化的技术前言蛋白质是生物体内非常重要的大分子有机物质，具有各种生物学功能，如结构支持、催化反应、传递信息、运输物质及免疫防御。
而蛋白质的研究和应用，早已成为生命科学的热门领域。
然而，大多数生物体中的蛋白质都混杂着众多的其他大分子物质，为了研究或应用某种特定蛋白质，就需要将它从其它物质中分离纯化出来。
今天我们就要来讲一讲蛋白质分离纯化的技术。
一、蛋白质分离的基本原理蛋白质分离的基本原理是利用不同的性质来分离具有不同特性的蛋白质。
蛋白质的各种性质包括分子大小、分子形状、电荷、亲疏水性、氨基酸序列等。
根据这些不同的性质，分别选择不同的分离纯化方法，可以实现不同程度的分离纯化效果。
二、蛋白质分离纯化技术的分类根据分离方式的不同，蛋白质分离纯化技术可以分为以下几类：1. 分子筛层析：分子筛层析是根据蛋白质的分子大小、形状来进行分离，其原理是在一定的缓冲液中，将特定孔径大小的陶瓷或聚合物微球填充进层析柱，根据蛋白质的分子大小，从层析柱中流出不同的蛋白质。
这种方法可以使蛋白质得到较好的分离纯化，但需要考虑蛋白质的保护。
2. 表面等电聚焦（IEF）：表面等电聚焦是根据蛋白质的等电点来进行分离，其原理是在聚丙烯酰胺凝胶电泳板上加上一组垂直于电泳方向的电场，在酸性一端放置一种酸性缓冲液，碱性一端放置一种碱性缓冲液，中间分别加入样品，蛋白质会在等电点处停留，使得不同等电点的蛋白质得到了分离和收获。
这种方法可以进行多品种、高分辨率的蛋白质分离。
3. 亲和层析：亲和层析是根据蛋白质与其他化合物的特异性相互作用进行分离，其原理是特定的化合物置于层析柱中，当特定的蛋白质与化合物结合时，蛋白质就可以纯化出来。
如在层析柱中放入钙离子，就可以纯化出骨钙蛋白，并且可以通过控制钙离子浓度来实现蛋白质的分离。
4. 透析：透析是将样品分子分离于透析膜之内或之外的方法。
通常将混合物放置于透析袋内，在培养基、缓冲液等适当环境中，透析袋内的小分子会从透析膜渗透出去，而较大的蛋白质则被留在透析袋内。
蛋白质分离和纯化技术的研究和应用
蛋白质分离和纯化技术的研究和应用蛋白质是生物体内最基本的分子，其担负着细胞结构与功能、物质转运、信号传递等重要生理功能。
由于生物样品中蛋白质种类众多、含量差异较大，为了深入揭示蛋白质的生物学功能和结构特性，必须对蛋白质进行精确分离和纯化。
本文将介绍蛋白质分离和纯化技术的研究和应用。
一、蛋白质分离技术蛋白质分离是指将复杂的蛋白质混合物进行分离，得到不同种类的纯化蛋白质的过程。
在蛋白质分离的基础上，再进行进一步纯化，能够更好地揭示蛋白质的生物学特性。
（一）凝胶电泳凝胶电泳是当前最常用的蛋白质分离技术之一。
它基于蛋白质的电荷、大小、形状和亲疏水性等性质，利用电场将蛋白质分子沿着凝胶移动，实现分子大小的分离。
凝胶电泳具有分离效果好、操作简单易行、样品消耗量小以及可视化等优点。
（二）液相色谱液相色谱（Liquid chromatography）是一种通过化学亲和性、分子大小、极性与非极性等属性分离物质的分离技术。
常用的液相色谱有透析液相色谱、醚基、硅烷基、反相、离子交换、凝胶过滤等类型。
其中反相色谱在蛋白质分离中尤为重要，它基于不同蛋白质在疏水性基质表面的分配系数不同，以蛋白质的亲水性为基础进行分离。
二、蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指在获得蛋白质的基础上，通过不同的纯化技术去除其中的杂质，得到纯度高的蛋白质分子。
蛋白质的纯化技术主要分为两类：非特异性纯化和特异性纯化。
（一）非特异性纯化非特异性纯化是指利用物理化学性质对样品进行分步纯化，将目标分子与混杂物质逐步分离开来的方法。
常用的非特异性纯化技术有盐析、凝胶过滤和透析等。
其中，盐析技术是常用的一种非特异性纯化技术，它利用富集目标蛋白质对盐的结合能力高于混杂蛋白质的特性，将混杂蛋白质和目标蛋白质分离。
（二）特异性纯化特异性纯化是指通过蛋白质与配体、抗体等生物学活性团之间的特异作用进行分离纯化的方法。
常用的特异性纯化技术包括亲和层析、免疫亲和层析等。
其中，亲和层析是一种重要的特异性纯化技术，它通过识别目标蛋白质与固定于固相材料上的亲和基团之间的特异性互作来分离纯化蛋白质。
SDS-PAGE分离蛋白技术
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白技术SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济,快捷,而且可重复的方法,该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离.【实验目的】掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同蛋白质的方法.【实验原理】SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。
不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。
【实验器材与试剂】一,仪器垂直板电泳槽及配套的玻璃板,梳子,电泳仪,干式恒温培养器,微波炉等.二,材料蛋白样品,蛋白标准品,EP管三，试剂1,1.5mol/L Tris-HCL Ph8.8（已加SDS）2,0.5mol/L Tris-HCL pH6.8（已加SDS）3,10％SDS4,30％丙烯酰胺（Acr/Bis）溶液：29.2g丙烯酰胺（Acr）+0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis)，用双蒸水定容至100ml，过滤备用，4℃下存放。
5,10％过硫酸铵（AP）（-20℃存放）6, 2×样品缓冲液0.5mol/L Tris-HCL Ph6.8 2ml甘油 2ml20％SDS 2ml0.1％溴酚蓝 0.5mlβ-巯基乙醇 2~1.0ml双蒸水 2.5ml7, 5×电泳缓冲液T ris 7.5gGly 36gSDS 2.5g双蒸水溶解，定容至500ml，使用时稀释5倍。
8，染色液：0.2考马斯亮蓝R250+84ml95％乙醇+20ml 冰醋酸，定容至200ml，过滤备用9，脱色液：V（乙醇）:V(冰醋酸)：V（水）=7.5:7.5:85【实验内容】一，聚丙烯酰胺凝胶的配制1，分离胶（10％）的配制：双蒸水 4.0ml30％Acr/Bis 3.3ml1.5mol/LTris-HCL2.5ml10％SDS 0.1ml10％AP 0.1ml取1ml上述混合液，加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL封底，余加TEMED 4μL，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面齐平，凝胶完全聚合需30~60min2，浓缩胶（4％）的配制：双蒸水 1.4ml30％Acr /Bis 0.33ml1mol/L Tris-HCL 0.25ml10％SDS 0.02ml10％AP 0.02mlTEMED 2μL将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合15~30min。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理（二）利用溶解度差别影响蛋白质溶解度的外部因素有：1、溶液的pH；2、离子强度；3、介电常数；4、温度。
但在同一的特定外部条件下，不同蛋白质具有不同的溶解度。
1、等电点沉淀：原理：蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。
因此在其他条件相同时，他的溶解度达到最低点。
在等电点之上或者之下时，蛋白质分子携带同种符号的净电荷而互相排斥，阻止了单个分子聚集成沉淀，因此溶解度较大。
不同蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点时的溶解度最低的原理，可以把蛋白质混合物分开。
当pH被调到蛋白质混合物中其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来，那些等电点高于或低于该pH的蛋白质则仍留在溶液中。
这样沉淀出来的蛋白质保持着天然的构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。
5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.盐溶作用主要是由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质与水分子之间的相互作用却加强，因而溶解度增高。
球蛋白溶液在透析过程中往往沉淀析出，这就是因为透析除去了盐类离子，使蛋白质分子之间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝集并沉淀。
当溶液的离子强度增加到一定程度时，蛋白质溶解程度开始下降。
当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析。
盐析作用主要是由于大量中性盐的加入使水的活度降低，原来溶液中的大部分甚至全部的自由水转变为盐离子的水化水。
此时那些被迫与蛋白质表面的疏水集团接触并掩盖他们的水分子成为下一步最自由的可利用的水分子，因此被移去以溶剂化盐离子，留下暴露出来的疏水基团。
蛋白质疏水表面进一步暴露，由于疏水作用蛋白质聚集而沉淀。
盐析沉淀的蛋白质保持着他的天然构象，能再溶解。
盐析的中性盐以硫酸铵为最佳，在水中的溶解度很高，而溶解度的温度系数较低。
蛋白质分离技术
★等电点测定
等电聚焦法（isoelectricfocusing）
（2）蛋白质的胶体性质
蛋白质的分子量很大（1-100nm），在水溶液中 具有胶体性质，如布郎运动、丁达尔现象不能 通过半透膜等。 透析：将含小分子杂质的蛋白质放入透析袋，置 水中，小分子杂质不断从袋中出来，大分子蛋 白质仍留在袋中。 半透膜：只允许小分子通过，而大分子不能通过。 如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等。
等电聚焦法
2、离子交换层析法
基质：纤维素、交联葡聚糖、树脂
电荷基团：
（四） 配体亲和力的差异 ： 亲和层析
亲和层析:利用蛋白质分子对其配体分子特有的 识别能力。 配基：
酶的底物、辅酶、抑制剂、效应物及其结构类似 物，激素与受体蛋白，抗原与抗体，生物素与 亲和素（抗亲和素蛋白），凝集素。
（五）HPLC（high performance/pressure liquid chromatography)
第四节：蛋白质的重要性质及分离纯化
Release proteins from cells and Differential centrifugation as a first step in protein purification
一、蛋白质的性质
（1）蛋白质的两性解离
蛋白质与aa一样，能够发生两性解离， 也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在 电场中不移动。
（5）蛋白质的紫外吸收
Trp、Tyr和Phe在280nm 附近有最大吸收。 因此，利用这个性质，可以对蛋白质进 行定性鉴定和定量测定。
二、分离纯化蛋白质的主要方法
（一）根据溶解度差异分离：选择性沉淀 法
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1) 盐浓度（即离子强度）：
• 离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，绝大多数蛋白质和酶， 在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性 盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶 现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的 静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。 • 为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加 入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入KCl、NaCl、 NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的极性。
• 1） 先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、 反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶 法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离 心得到含有膜蛋白的粗组分。
• 2 ）用特殊的去污剂选择性的分离。在多数情 况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构 中溶解下来。
三、分离与纯化
• 从细胞中提取得到的生物大分子往往是不纯 净的，含有大量杂质，必须进一步分离纯化， 这一阶段可分为粗分级分离和细分级分离两 步进行。
（一）材料的选择与预处理
• 选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含 量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植 物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题， 只要能达到实验目的即可。
• 实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要 除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需 要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽 可能保持材料的新鲜，尽快加工处理。若不立即进行实验 或加工，应冷冻保存。
2.物理法： • 1) 反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后 放于室温 ( 或40 ℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞 内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。 • 2) 超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和 细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。 • 3) 压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法 。在 1000×105Pa～2000×105Pa 的高压下使细胞悬液通过一个小 孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。
•
•
4. 膜蛋白的提取
• 膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜 非常重要的生物学功能。 • 根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为 两大类型：外周膜蛋白和内在膜蛋白。 (1) 外周膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表 面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚 至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。 (2) 内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂 (detergent)使膜溶解后才可分离出来。
溶解度
分子大小 带电特性 吸附特性
对配体分子 的亲和性
（一）粗分级分离
主要是利用盐析法、等电点沉淀、有机溶剂 沉淀等方法，使目的蛋白与其它较大量的杂 蛋白分开。 优点：简便、处理量大、既能除去大量杂质， 又能浓缩蛋白质。 缺点：分辨率低，产品杂质多。
1. 盐析（中性盐沉淀）
• 在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过 程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、 多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。 • 盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八 十多年的历史，其突出的优点是：
• 2) pH值：蛋白质、酶的溶解度和稳定性与pH值有 关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在pH=6 ～8范围内，提取溶剂的pH应在蛋白质和酶的稳定 范围内，通常选择偏离等电点的两侧。
• 3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋 白质和酶，提取时一般在0℃～5℃的低温操作。 • 4) 防止蛋白酶的降解作用：加入抑制剂或调节提 取液的pH、离子强度或极性等方法使相应的水解 酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶的 降解作用。
（一）分离纯化的意义
①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与 功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本 质有重大意义。 ②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业， 需要大量的高活性的酶制剂。如用淀粉酶制造葡萄糖、 麦芽糖、糊精以及糖浆等。
③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。
④基因工程的需要
• 5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解， 一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大 量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等 物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当 数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需 基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气 接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的 二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入 少量巯基乙醇或二硫苏糖醇以防止巯基氧化。
• 膜蛋白 即内在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的 基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白 等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。 • 膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶 用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐， Triton-100，Tween-80, SDS等表面活性剂。
分离膜蛋白的方法（原则性）
（二）分离纯化的要求
1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作 为研究一级结构、空间结构，一级结构与功能的关系 的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制 剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质 制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物 活性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有 不少损失。而且提纯步骤越多，损失越大。
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
• （NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4
0℃ 70.6 4.9 1.6
20℃ 75.4 18.9 7.8
80℃ 95.3 43.3 93.8
100 ℃ 103 42.2 101
一、 引言
第十节
蛋白质 的分离与纯化
二、 蛋白质（酶）分 离纯化的前处理 三、蛋白质（酶）分离 与纯化 四、层析技术 五、电泳技术 六、离心技术
一、 引言
• 蛋白质（酶）存在于一切生物体中，是 非常重要的生物大分子。蛋白质是生物 功能的执行者，担负着生物催化、物质 运输、运动、防御、调控及记忆、识别 等多种生理功能。
（二）细胞的破碎
• 分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原 来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原 来的天然状态，不丢生物活性。因此应选择适当的方 法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生 物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破 碎。 • 组织细胞的破碎方法很多，不同的实验规模，不同的 实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。
（四）提取
• 组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内
含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件 下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保 持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备 物的分解破坏，这就是提取。
1. 影响提取的因素
• 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； • 由固相扩散到液相的难易； • 溶剂的pH值和提取时间等。 通常：
• 蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋 白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶 解度，电荷等建立起来的。
常用的蛋白质分离纯化技术
依据性质 方 用于粗分
盐析、等电点沉淀、 有机溶剂沉淀
透析、超过滤
法 用于细分 分配层析
密度梯度离心、凝 胶过滤 电泳、离子交换层析 吸附层析 亲和层析、金属 螯合层析
• 4) 冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此 法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如 此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。
3. 化学与生物化学方法： • 1) 自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的 pH和适当的温 度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯 酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。 • 2) 溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的 稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞， 将细胞膜胀破释放出细胞内含物。 • 3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛 酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专一性地将 细胞壁分解。
•
•
①成本低，不需要特别昂贵的设备。
②操作简单、安全。
•
③对许多生物活性物质具有稳定作用。
⑴ 盐析的基本原理
• 蛋白质溶液为亲水溶胶体系，其稳定因素：水 化膜和电荷。 • 中性盐的亲水性大于蛋白质分子的亲水性。
• 加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水 化膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷， 破坏了亲水溶胶，蛋白质分子即聚集而形成沉 淀。
极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；
碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂； • • 温度升高，溶解度加大； 远离等电点的pH值，溶解度增加。
提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持 其生物活性。
2. 水溶液提取
• 蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。用水溶液提取生物大分子应注 意的几个主要影响因素是： •
• 4) 有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或 SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞 膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。
（三）细胞器的分离
• 细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞 还有叶绿体。 • 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了 防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需 先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。 • 细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在 适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠 檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经 过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次 分步离心后，即可获得所需组分。