地中海贫血的分子基础和产前诊断徐湘民
地中海贫血的分子基础及产前诊断
是一组遗传异质性很大的血红蛋白病
一般情况下是一个没有贫血的“正常人”
血红蛋白量及红细胞大小均正常或接近正常 α珠蛋白链与非α珠蛋白链维持正常的合成平衡 注意与（γδ）0-地贫、 β-地贫鉴别
地中海贫血: 常染色体隐性遗传病
Pedigree for -thalassemia in a typical family.
地中海贫血的产前诊断
胎儿取样技术
DNA诊断技术
-地贫的诊断
-地贫的诊断
目前及今后的胎儿产前诊断新技术
植入前基因诊断
Preimplantation genetic diagnosis(PGD)
超声产前诊断
Prenatal diagnosis: Ultrasound measurement
血蛋白病的定义及分类
血红蛋白病 由于血红蛋白在质量和数量上的异 常而发生的一类遗传性贫血病
异常血红蛋白病： 由于血红蛋白发生结构上 的异常而导致的贫血症 比如：镰刀型细胞贫血病 （HbS）、HbC、HbD、HbE 等
地中海贫血： 由于某类血红蛋白合成受 到抑制所引起的溶血性贫血
比如: α-地中海贫血、β-地 中海贫血
α-地中海贫血及β-地中海贫血
遗传性持续性胎儿血红蛋白增多症（HPFH） 与异常血红蛋白病相互作用的地贫
α-地贫+ α-链变异体 β-地贫+ β-链变异体
HPFH
其他
HPFH定义
当成人体内持续存在过量的HbF时,就称： 遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症 ( Hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH)
血红蛋白病的人群筛查和产前诊断
血红蛋白病的人群筛查和产前诊断徐湘民【期刊名称】《《海南医学》》【年(卷),期】2019(000)0z1【总页数】9页(P47-55)【关键词】血红蛋白病; 地中海贫血; 遗传筛查; 产前诊断; 二代测序【作者】徐湘民【作者单位】南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室广东广州 510515; 广东高校人类遗传病分子诊断工程技术研究中心广东广州 510515; 广东省出生缺陷监测与干预重点实验室广东广州 510515【正文语种】中文【中图分类】R5521 遗传性血红蛋白病及人群防控对策遗传性血红蛋白病是人类常见的孟德尔遗传病，这组疾病包括异常血红蛋白(abnormal hemoglobin, structural variants)和地中海贫血(thalassemia)，异常血红蛋白中最重要的疾病是镰状细胞贫血，它是由人β-珠蛋白基因的第6 号密码子上的谷氨酸变异为缬氨酸而导致的严重、致死性溶血性贫血，世界上最早的“分子病”的概念就是从镰状细胞贫血的研究中提出的[1-2]。
地中海贫血(简称地贫)因最先在地中海地区发现而得名，α-和β-地贫是其中最重要的疾病类型。
此外，还有一种发育阶段异常的良性表型—遗传性持续性胎儿血红蛋白(hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH)，该遗传特质在上述两种血红蛋白病，特别是β-地贫的临床表型变异上有重要的遗传修饰作用，是目前临床精准诊断的主要靶点之一[3]。
由于镰状细胞贫血患儿主要发生于非洲，本文重点阐述α-和β-地贫的人群筛查和产前诊断。
α-和β-地贫是最早被阐明分子病理学基础的人类遗传性疾病，也是世界上最先采用分子诊断技术开展产前诊断的疾病对象，从20 世纪70 年代中期开始，有人就已经通过检测“珠蛋白合成”成功进行了α-地贫的产前诊断，并随即应用分子杂交技术完成了β 地贫的产前诊断[4]。
经过近半个世纪的研究积累，我们已经有了系统的α-和β-地贫的人群遗传流行病学和分子病理学的基础知识，包括中国人在内的导致α-和β-地贫的在疾病高发区的人群发生率和疾病突变谱已经阐明，我国血红蛋白病的流行病学研究是从曾溢滔教授领导的合作团队于20 世纪80 年代中期开展的全国100 万人群的大规模调查开始的[5]，随着技术的进步，后续的研究更进一步阐明了我国南方一些高发省区的详细、准确的遗传流行病学数据，这是指导开展临床诊断、人群筛查和通过产前诊断实现该病预防控制的前提和基础[6-7]。
地中海贫血的分子基础和产前诊断-徐湘民
北海， 2013年 8月23-25日
徐湘民
南方医科大学基础医学院
School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University
遗传性血红蛋白病
Inherited disorders of hemoglobin
和地贫发生的分子遗传学机制
• -珠蛋白基因缺失 • -珠蛋白基因点突变 • 中间型地贫:复杂变异
和地贫发生的分子遗传学机制
• -珠蛋白基因缺失 • -珠蛋白基因点突变 • 中间型地贫:复杂变异
产前基因诊断：地贫预防的技术基础
• 人群携带者筛查发现高风险家庭 • 基于DNA分析的胎儿基因型诊断
• 胎儿取样 • 家系分析
-地中海贫血 临床综合征
-地中海贫血 临床综合征
正常
珠蛋白链不平衡
正常
11p15.3
-珠蛋白基因表达
-地中海贫血特征
-地中海贫血特征
Hb H 病
中间型-地中海贫血
Bart’s胎儿水肿综合征
重型-地海贫血
地中海贫血的临床特征
• 小细胞低色素性溶血型贫血 (中、重度) • 黄疸 • 肝脾肿大 (脾大明显) • 骨髓扩增 • 发育迟缓 • 合并感染 • Bart’s 水肿胎
IVS II
EXON III
UTR
3’
1
CD74 CD78
CD118
错义突变 小缺失或插入
终止密码突变 移码突变
地中海贫血预防控制操作指南. 人民军医出版社, 2011.
中国南方人群不同基因型Hb H病的分布
Unpublished Data, 2012.
遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(HPFH)的分子机制
遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(HPFH)的分子机制曾小红【摘要】遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(Hereditary persistence of fetal hemoglobin,HPFH)是成人红细胞中持续存在过量的胎儿血红蛋白(Fetal hemoglobin,Hb F),血液学检查正常的遗传综合征.携带者常无临床症状.HPFH具有高度的遗传异质性,分子机制主要涉及11p15上β-类珠蛋白基因的遗传缺陷导致的Hb F异常高表达.最近的研究表明,HPFH具有数量性状遗传特点,其发生机制可能不局限于单纯的β-类珠蛋白基因上的遗传缺陷,HPFH还与多个基因座的异常有关,具有数量性状位点(quantitative trait loci,QTL)的遗传特征.主要包括QTL6q23和QTL2p15等的异常.通过HPFH来探索珠蛋白基因的网络化表达调控机制,为镰状细胞性贫血、重型地中海贫血等疾病的治疗研究开拓了新路径.【期刊名称】《中国产前诊断杂志（电子版）》【年(卷),期】2012(004)002【总页数】7页(P26-32)【关键词】HPFH;分子机制;β-类珠蛋白基因;QTL【作者】曾小红【作者单位】昆明医科大学附属昆华医院遗传诊断中心,云南昆明650032【正文语种】中文【中图分类】R394.3血红蛋白（Hemoglobin）是人体红细胞内的一种主要蛋白质，由珠蛋白和血红素结合而成，通过携氧释氧实现氧气在人体内的运输[1］。
血红蛋白是由两条α珠蛋白链（αξ）和两条非α珠蛋白链（βγδε等）组成的四聚体。
6种不同的珠蛋白肽链组合成人类的6种血红蛋白，按照其在人体内表达的先后顺序分别是：Hb Gower1（ξ2ε2）、Hb Gower2（α2ε2）、Hb Portland（ξ2γ2）、Hb F（α2γ2）、Hb A（α2β2）、Hb A2（α2δ2）；前3种为胚胎型血红蛋白，Hb F（Fetal hemoglobin，胎儿血红蛋白）为胎儿时期血红蛋白主要成分，出生后逐渐由Hb A取代，由于γ链有Gγ和Aγ两种亚型，所以Hb F也有两种构成：α2Gγ2和α2Aγ2。
地中海贫血的产前诊断
Prenatal Diagnosis of Thalassanemia
概念
地中海贫血是由于珠蛋白缺失或缺陷使某种珠 蛋白链合成受到抑制而引起的溶血性贫血,为 全球最大的单基因遗传病 在中国好发于广东、广西、湖南、四川、湖北 等南方省市
血红蛋白的组成
发育阶段
胚胎
胎儿
血红蛋白
Genetic Counseling
Couples came or came alone Conditions/disorders Progress Risk/chance Amino/CV test Test’s accuracy Test’s limitation Options: positive, what to do? negative, back to the limitation
α地贫产前诊断适应证
双方均为α地贫东南亚型（--SEA/αα），有 1/4机会生育巴氏水肿胎。 一方α地贫东南亚型（--SEA/αα），一方标 准型2，有1/2机会生育HbH 患儿。 一方为α地贫东南亚型（--SEA/αα），另一 方为αTα（突变型如CS,QS),有1/4机会生育 症状较重的 HbH 患儿。
ABO血型不合
母血型O型 父血型A、B、或 AB型 发生率：占妊娠总数的20-25%，而发生ABO 溶血的仅占其中的10% 与胎次关系：ABO溶血常发生在第一胎， Rh 溶血常发生在第二胎以上。 临床表现：黄疸出现早，出生后24-48小时内。 重症可发生死胎、重度黄疸、重度贫血。
抗体检测
Hb Bart’s胎儿水肿综合征
珠蛋白生成障碍性贫血的分子诊断研究进展
珠蛋白生成障碍性贫血的分子诊断研究进展徐祥虎;朱宝生【摘要】珠蛋白生成障碍性贫血是一类发病率较高的常染色体显性遗传病,除输血及骨髓造血干细胞移植之外,目前尚无较好的治疗方法,产前诊断是防止重型地贫胎儿出生积极有效的应对措施.近年来,在血红蛋白异常筛查方面出现了全自动血红蛋白电泳、高效液相色谱、傅里叶变换红外光谱等新技术;在基因诊断领域出现了DNA芯片技术、悬浮点阵技术、DNA测序、多重PCR等.由于这些新的技术具有更准确、灵敏、方便等优点,它们正在逐渐取代以往所使用的旧方法.非侵入性产前诊断、种植前遗传诊断成为地贫产前诊断的重要发展方向.目前对胎儿的超声检查仍不能取代血红蛋白电泳在地贫高发地区对孕妇群体进行携带者筛查,种植前遗传诊断存在着一定的医疗风险,绝大多数病例的预防仍是通过对高风险胎儿进行产前基因诊断来实现.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2011(003)004【总页数】6页(P283-288)【关键词】地中海贫血;分子基础;产前诊断;基因诊断【作者】徐祥虎;朱宝生【作者单位】昆明医学院附属昆华医院遗传诊断中心,云南,昆明,650032;昆明医学院附属昆华医院遗传诊断中心,云南,昆明,650032【正文语种】中文地中海贫血（thalassemia）是一种由于珠蛋白基因缺陷导致血红蛋白中的α-或β-珠蛋白肽链合成减少或不能合成,引起血红蛋白成份改变，从而导致的溶血性贫血[1]。
地贫的主要类型有两种：α地中海贫血和β地中海贫血，分别由α-或者β-珠蛋白基因突变所致，其表现型呈常染色体隐性遗传的方式出现。
重型α地贫胎儿（Bart's水肿胎）多在妊娠末期胎死腹中或产下即死；重型β地贫患儿一般在出生后3～6个月出现症状，要靠输血维持生命，多在童年期夭折。
全球人口的1.67%为地贫的基因突变携带者，每年出生的新生儿中突变纯合子和双重杂合子高达4.4‰[2]。
其发病区域主要集中在地中海沿岸、少数非洲地区、东南亚和中国的南方。
PPT讲义 徐湘民 遗传修饰基因与地中海贫血表型
Shandong
S
0.08% (1/1190)
c.41T>C 1
Guangdong Thalassemic endemic region, n=3839
1.25% (48/3839)
Guangxi
c.519_525dupCGGCGCC 36
c.895C>G 9
c.13G>A
1
c.892G>C 1
NA
1.000
Damaging
1 (1.6%)
NA
1 (1.6%)
1.000
Damaging
1 (1.6%)
携带KLF1突变的正常个体的 MCV 和 MCH 值降低
KLF1突变携带者及KLF1突变复合地贫 个体的HbA2 和 HbF 水平升高
Normal Individuals
-Thalassemia Trait
–/–
A/C
T/T
P2 9/M 4
None (0)
Occasional (1)
87
5.8 82.0 / -28 / CD41/42
[c.519_525dupC GGCGCC]+[=]
–/–
A/C
T/T
P3† 8/M
3
Occasional (8)
Systematic (8-12)*
86
c.1022G>A 1
Blood, 2014.
中国南方人群的KLF1突变谱
突变
c.519_525dup CGGCGCC c.895C>G c.1022G>A c.13G>A c.892G>C c.913+1G>A c.1001C>G
地中海贫血的实验室分子诊断技术研究进展
地中海贫血的实验室分子诊断技术研究进展李继慧;覃运荣;梁毅【摘要】地中海贫血是最常见的血红蛋白病之一,具有遗传性,其主要类型为α-及β-型.目前实验室针对α-、β-型地中海贫血的分子学诊断方法主要是基于PCR法的多种检测技术,此外还有多重连接探针扩增技术、基因芯片技术、高通量测序技术等,各种技术均有其优缺点,合理选择检测方法有助于提高地贫的检出率,还能够引导患者及时进行产前诊断,为降低人口出生缺陷和提高人口素质提供有效的临床依据.本文就目前应用于地中海贫血的多种实验室分子诊断技术作一综述.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2018(010)003【总页数】4页(P202-205)【关键词】地中海贫血;分子诊断技术;α-地中海贫血;β-地中海贫血【作者】李继慧;覃运荣;梁毅【作者单位】广西玉林市妇幼保健院检验科,广西,玉林537000;广西玉林市妇幼保健院检验科,广西,玉林537000;广西玉林市妇幼保健院检验科,广西,玉林537000【正文语种】中文地中海贫血（简称地贫）是世界上最常见的血红蛋白病之一，主要是由于遗传性珠蛋白基因缺失或点突变导致血红蛋白中一种或一种以上珠蛋白链合成缺失和/或不足而引起的贫血，也称为珠蛋白生成障碍性贫血［1］。
按照存在缺陷的珠蛋白基因的种类，地中海贫血一般可以分为α⁃、β⁃、δβ⁃和εγδβ⁃等类型，其中α⁃和β⁃地贫是最为常见的2种地贫类型［1］。
地中海贫血好发于地中海、中东、南亚次大陆和东南亚等地区，在我国四川、云南、广西、贵州、广东等南部地区也较为常见［2］。
地贫患者具有广泛的临床表现，可从几乎无症状到需要终身输血并伴随多器官系统并发症的重度贫血，并会遗传给下一代，给家庭和社会带来沉重的负担［3］。
目前对于地贫的治疗一般是根据其类型采用相应的治疗方案，而α⁃重型地贫（通常是指Hb⁃Bart's胎儿水肿综合征）及β⁃重型地贫尚无有效、经济的治疗方法［4⁃5］。
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地贫 8.53%
地贫 2.54%
地贫携带者约1000万
J Clin Pathol, 2004.
11种突变
%
12种突变
Clin Genet, 2010.
北
柳州市 790
贺州市 1033
百色市 834
西
东
南宁市 1559
5,789人份
• 汉族：3361
玉林市 1349
• 壮族：1670
防城港市 224
Blood Rev, 2012.
全球血红蛋白病人群负荷
Blood, 2011; WHO Statistics, 2012.
中国异常血红蛋白调查
Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet,
中国地中海贫血调查
Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet, 1987.
血红蛋白病是世界上最常见的出生缺陷之一
全球每年约有790万出生缺陷患儿出生 5中常见的疾病占7000种出生缺陷的25% 血红蛋白病的发病率位于第三位
120 － 100 － 80 － 60 －
40 － 20 － 0
全球5种常见的出生缺陷
－ － － －
地中海贫血全球分布区域
中国南方高发地区 人群携带率3%-24%
AE Bart’s AF HA
-
1
2
3
500V, 25min
4
5
1. 正常人Hb 2. 轻型地贫 3. 异常Hb E杂合子 4. 新生儿Hb Bart’s
(4, 地贫标准型） 5. Hb H
中间型地贫的临床特征
• 发病年龄在2岁以后, 或成年期发病 • 血红蛋白水平维持在60-100g/L水平 • 不需进行常规输血治疗 • 轻度黄疸 • 肝脾肿大(脾大明显) • 骨髓扩增 • 合并感染
/ /–3.7 /–4.2 WS/ CS/ QS/ ––SEA/ –– THAI/
/ /–3.7 /–4.2 WS/ CS/ QS/ ––SEA/ –– THAI/
Unpublished Data, 2012.
和地贫发生的分子遗传学机制
• -珠蛋白基因缺失 • -珠蛋白基因点突变 • 中间型地贫:复杂变异
和地贫发生的分子遗传学机制
• -珠蛋白基因缺失 • -珠蛋白基因点突变 • 中间型地贫:复杂变异
和地贫发生的分子遗传学机制
• -珠蛋白基因缺失 • -珠蛋白基因点突变 • 中间型地贫:复杂变异
产前基因诊断：地贫预防的技术基础
• 人群携带者筛查发现高风险家庭 • 基于DNA分析的胎儿基因型诊断
• 胎儿取样 • 家系分析
864例样品定量诊断特异性评价
-地贫定量与定性检测的比较
Gap-PCR定性 检测基因缺失
基因缺失
--SEA, -3.7, -4.2 等单倍型分析
基
基
因
因
缺
缺
失
失
待检人基因 基因缺失 珠蛋白基 基因缺失 --SEA/, -3.7/
组DNA 基因重复 因拷贝数
-4.2/等基因分型
-地贫分子诊断: 临床表型与基因分型
地中海贫血的预防控制
TIF Publication, 2003.
地中海贫血的研究策略
建立一系列诊断 标准和诊断技术
用于基因分型
用于产前诊断
遗传流行病学 调查
指导制定计划
大人群监控和 预防
和地贫发生的分子遗传学机制
• -珠蛋白基因缺失 • -珠蛋白基因点突变 • 中间型地贫: 复杂变异
和地贫发生的分子遗传学机制
1 基因 看家基因
2个拷贝 2个拷贝
43
PCR
个
扩增
循
8环
43
个
循
8环
1 基因 看家基因
1个拷贝 2个拷贝
2
4
43
4个
个
循
循
8环
8环
1 基因 看家基因
0个拷贝 2个拷贝
无
43
扩Hale Waihona Puke 个 循增8环
16
16
Ct值 3
3
△Ct
0
16
16
4
3
1
0
16
No
3
－
三个靶基因拷贝数定量分析结果
J Mol Diagn. 2013.
产前基因诊断：地贫预防的技术基础
• 人群携带者筛查发现高风险家庭 • 基于DNA分析的胎儿基因型诊断
• 胎儿取样 • 家系分析
用于携带者检测的表型分析方法
• 全血细胞计数
MCV (<80fL) MCH (<27pg)
• 血红蛋白分析 (电泳/HPLC)
Hb A2 () or () Hb F () Hb Bart’s () Hb CS () Hb E ()
中国地中海贫血调查
Zeng YT, Huang SZ. J Med Genet,
北
西
湛江 3160
韶关 3444
广州 2604
东
汕头 1049
珠海 3140
南
13,397人份
广东省地中海贫血的流行病学调查
J Clin Pathol, 2004.
广东地中海贫血流行病学调查 %
正常人群 88.93％
• 人群携带者筛查发现高风险家庭 • 基于DNA分析的胎儿基因型诊断
• 胎儿取样 • 家系分析
产前基因诊断：地贫预防的技术基础
• 人群携带者筛查发现高风险家庭 • 基于DNA分析的胎儿基因型诊断
• 胎儿取样 • 家系分析
羊膜穿刺(amniocentesis)抽取胎儿样品示意图
Family 1 Family 2 Family3
(地贫,宫内或出生后半小时内死亡)
地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症
地中海贫血的血液学表型特征
• RBC 参数 MCV MCH 细胞形态变化
• Hb 成分分析 Hb A2 () 或 () Hb Bart’s Hb H () Hb E ()
Normal AA2
+
血红蛋白电泳图谱
IVS II
EXON III
UTR
3’
1
CD74 CD78
CD118
错义突变 小缺失或插入
终止密码突变 移码突变
地中海贫血预防控制操作指南. 人民军医出版社, 2011.
中国南方人群不同基因型Hb H病的分布
Unpublished Data, 2012.
中国人主要-珠蛋白基因型与血液学表型的关系
中国南方血红蛋白病人群负荷
和地中海贫的分子基础
• 常染色体隐性遗传病 • 致病基因：地贫 - 珠蛋白基因（16p13.3）
地贫 - 珠蛋白基因（11p15.3）
• 突变纯合子：重型地贫 - 致死
中间型地贫 - 致残
• 病理学基础： / 链比例失衡
和地贫的病理学机制和临床分类
16p13.3
-珠蛋白基因表达
• 免疫学定性检测
东南亚缺失型地贫链 (阳性)
地中海血贫携带者筛查及产前诊断流程
被检对象（婚前或孕早、中期） 血液学分析（MCV，HbA2% ）
排除地贫 遗传咨询
双亲基因分析
胎儿产前诊断
？
终止妊娠
地贫携带者 遗传咨询，配偶检查 血液学分析（MCV，HbA2%）
地贫携带者
排除地贫
产前基因诊断：地贫预防的技术基础
中间型地贫的临床特征
• 发病年龄在2岁以后, 或成年期发病 • 血红蛋白水平维持在60-100g/L水平 • 不需进行常规输血治疗 • 轻度黄疸 • 肝脾肿大 (脾大明显) • 骨髓扩增 • 合并感染
地贫是严重致死、致残性遗传性血液病
重
重
型
型
地
地
贫
贫
中间型地贫
地中海贫血的防治对策
重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题 通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施 WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病 预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求
-地贫:基因点突变分析技术
• Reverse Dot Blot （RDB）: 反向点杂交 • probe melting curve-based genotyping assay
（PMCA）: 基于探针熔解曲线的基因分型
3种缺失型地贫检测试剂盒：单管多重gap-PCR法 17种地贫突变检测试剂盒：反向点杂交法 多位点缺失型地贫检测试剂盒： PCR荧光探针法 25 种地贫突变检测试剂盒：荧光PCR熔解曲线法
• 瑶族： 619
• 其它： 139
南
广西地区地中海贫血的流行病学调查
广西地中海贫血流行病学调查 %
地贫 0.16%
-地地贫 1贫177..5555%%
地贫 6.43%
正常人群 7正5.常86人％群 75.86%
9种突变
%
地贫携带者约1000万
Clin Genet, 2010.
13种突变
高发区人群遗传负荷评估
血液学分析指导血红蛋白病诊断的一般原则
用于 和 地贫临床基因分型的实验室流程
FBC / Hb Analysis
临床样品
-地中海贫血
Hb CS etc
-地中海贫血
Hb F > 5%
Gap-PCR / MLPA (1) RDB / PMCA (2) RDB / PMCA (1) Gap-PCR / MLPA (2)
地中海贫血的 分子基础和产前诊断
北海， 2013年 8月23-25日
徐湘民
南方医科大学基础医学院
School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University