地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民
地中海贫血的分子基础及产前诊断
是一组遗传异质性很大的血红蛋白病
一般情况下是一个没有贫血的“正常人”
血红蛋白量及红细胞大小均正常或接近正常 α珠蛋白链与非α珠蛋白链维持正常的合成平衡 注意与（γδ）0-地贫、 β-地贫鉴别
地中海贫血: 常染色体隐性遗传病
Pedigree for -thalassemia in a typical family.
地中海贫血的产前诊断
胎儿取样技术
DNA诊断技术
-地贫的诊断
-地贫的诊断
目前及今后的胎儿产前诊断新技术
植入前基因诊断
Preimplantation genetic diagnosis(PGD)
超声产前诊断
Prenatal diagnosis: Ultrasound measurement
血蛋白病的定义及分类
血红蛋白病 由于血红蛋白在质量和数量上的异 常而发生的一类遗传性贫血病
异常血红蛋白病： 由于血红蛋白发生结构上 的异常而导致的贫血症 比如：镰刀型细胞贫血病 （HbS）、HbC、HbD、HbE 等
地中海贫血： 由于某类血红蛋白合成受 到抑制所引起的溶血性贫血
比如: α-地中海贫血、β-地 中海贫血
α-地中海贫血及β-地中海贫血
遗传性持续性胎儿血红蛋白增多症（HPFH） 与异常血红蛋白病相互作用的地贫
α-地贫+ α-链变异体 β-地贫+ β-链变异体
HPFH
其他
HPFH定义
当成人体内持续存在过量的HbF时,就称： 遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症 ( Hereditary persistence of fetal hemoglobin, HPFH)
血红蛋白病的人群筛查和产前诊断
血红蛋白病的人群筛查和产前诊断徐湘民【期刊名称】《《海南医学》》【年(卷),期】2019(000)0z1【总页数】9页(P47-55)【关键词】血红蛋白病; 地中海贫血; 遗传筛查; 产前诊断; 二代测序【作者】徐湘民【作者单位】南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室广东广州 510515; 广东高校人类遗传病分子诊断工程技术研究中心广东广州 510515; 广东省出生缺陷监测与干预重点实验室广东广州 510515【正文语种】中文【中图分类】R5521 遗传性血红蛋白病及人群防控对策遗传性血红蛋白病是人类常见的孟德尔遗传病，这组疾病包括异常血红蛋白(abnormal hemoglobin, structural variants)和地中海贫血(thalassemia)，异常血红蛋白中最重要的疾病是镰状细胞贫血，它是由人β-珠蛋白基因的第6 号密码子上的谷氨酸变异为缬氨酸而导致的严重、致死性溶血性贫血，世界上最早的“分子病”的概念就是从镰状细胞贫血的研究中提出的[1-2]。
地中海贫血(简称地贫)因最先在地中海地区发现而得名，α-和β-地贫是其中最重要的疾病类型。
此外，还有一种发育阶段异常的良性表型—遗传性持续性胎儿血红蛋白(hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH)，该遗传特质在上述两种血红蛋白病，特别是β-地贫的临床表型变异上有重要的遗传修饰作用，是目前临床精准诊断的主要靶点之一[3]。
由于镰状细胞贫血患儿主要发生于非洲，本文重点阐述α-和β-地贫的人群筛查和产前诊断。
α-和β-地贫是最早被阐明分子病理学基础的人类遗传性疾病，也是世界上最先采用分子诊断技术开展产前诊断的疾病对象，从20 世纪70 年代中期开始，有人就已经通过检测“珠蛋白合成”成功进行了α-地贫的产前诊断，并随即应用分子杂交技术完成了β 地贫的产前诊断[4]。
经过近半个世纪的研究积累，我们已经有了系统的α-和β-地贫的人群遗传流行病学和分子病理学的基础知识，包括中国人在内的导致α-和β-地贫的在疾病高发区的人群发生率和疾病突变谱已经阐明，我国血红蛋白病的流行病学研究是从曾溢滔教授领导的合作团队于20 世纪80 年代中期开展的全国100 万人群的大规模调查开始的[5]，随着技术的进步，后续的研究更进一步阐明了我国南方一些高发省区的详细、准确的遗传流行病学数据，这是指导开展临床诊断、人群筛查和通过产前诊断实现该病预防控制的前提和基础[6-7]。
遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(HPFH)的分子机制
遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(HPFH)的分子机制曾小红【摘要】遗传性持续性胎儿血红蛋白增高症(Hereditary persistence of fetal hemoglobin,HPFH)是成人红细胞中持续存在过量的胎儿血红蛋白(Fetal hemoglobin,Hb F),血液学检查正常的遗传综合征.携带者常无临床症状.HPFH具有高度的遗传异质性,分子机制主要涉及11p15上β-类珠蛋白基因的遗传缺陷导致的Hb F异常高表达.最近的研究表明,HPFH具有数量性状遗传特点,其发生机制可能不局限于单纯的β-类珠蛋白基因上的遗传缺陷,HPFH还与多个基因座的异常有关,具有数量性状位点(quantitative trait loci,QTL)的遗传特征.主要包括QTL6q23和QTL2p15等的异常.通过HPFH来探索珠蛋白基因的网络化表达调控机制,为镰状细胞性贫血、重型地中海贫血等疾病的治疗研究开拓了新路径.【期刊名称】《中国产前诊断杂志（电子版）》【年(卷),期】2012(004)002【总页数】7页(P26-32)【关键词】HPFH;分子机制;β-类珠蛋白基因;QTL【作者】曾小红【作者单位】昆明医科大学附属昆华医院遗传诊断中心,云南昆明650032【正文语种】中文【中图分类】R394.3血红蛋白（Hemoglobin）是人体红细胞内的一种主要蛋白质，由珠蛋白和血红素结合而成，通过携氧释氧实现氧气在人体内的运输[1］。
血红蛋白是由两条α珠蛋白链（αξ）和两条非α珠蛋白链（βγδε等）组成的四聚体。
6种不同的珠蛋白肽链组合成人类的6种血红蛋白，按照其在人体内表达的先后顺序分别是：Hb Gower1（ξ2ε2）、Hb Gower2（α2ε2）、Hb Portland（ξ2γ2）、Hb F（α2γ2）、Hb A（α2β2）、Hb A2（α2δ2）；前3种为胚胎型血红蛋白，Hb F（Fetal hemoglobin，胎儿血红蛋白）为胎儿时期血红蛋白主要成分，出生后逐渐由Hb A取代，由于γ链有Gγ和Aγ两种亚型，所以Hb F也有两种构成：α2Gγ2和α2Aγ2。
珠蛋白生成障碍性贫血的分子诊断研究进展
珠蛋白生成障碍性贫血的分子诊断研究进展徐祥虎;朱宝生【摘要】珠蛋白生成障碍性贫血是一类发病率较高的常染色体显性遗传病,除输血及骨髓造血干细胞移植之外,目前尚无较好的治疗方法,产前诊断是防止重型地贫胎儿出生积极有效的应对措施.近年来,在血红蛋白异常筛查方面出现了全自动血红蛋白电泳、高效液相色谱、傅里叶变换红外光谱等新技术;在基因诊断领域出现了DNA芯片技术、悬浮点阵技术、DNA测序、多重PCR等.由于这些新的技术具有更准确、灵敏、方便等优点,它们正在逐渐取代以往所使用的旧方法.非侵入性产前诊断、种植前遗传诊断成为地贫产前诊断的重要发展方向.目前对胎儿的超声检查仍不能取代血红蛋白电泳在地贫高发地区对孕妇群体进行携带者筛查,种植前遗传诊断存在着一定的医疗风险,绝大多数病例的预防仍是通过对高风险胎儿进行产前基因诊断来实现.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2011(003)004【总页数】6页(P283-288)【关键词】地中海贫血;分子基础;产前诊断;基因诊断【作者】徐祥虎;朱宝生【作者单位】昆明医学院附属昆华医院遗传诊断中心,云南,昆明,650032;昆明医学院附属昆华医院遗传诊断中心,云南,昆明,650032【正文语种】中文地中海贫血（thalassemia）是一种由于珠蛋白基因缺陷导致血红蛋白中的α-或β-珠蛋白肽链合成减少或不能合成,引起血红蛋白成份改变，从而导致的溶血性贫血[1]。
地贫的主要类型有两种：α地中海贫血和β地中海贫血，分别由α-或者β-珠蛋白基因突变所致，其表现型呈常染色体隐性遗传的方式出现。
重型α地贫胎儿（Bart's水肿胎）多在妊娠末期胎死腹中或产下即死；重型β地贫患儿一般在出生后3～6个月出现症状，要靠输血维持生命，多在童年期夭折。
全球人口的1.67%为地贫的基因突变携带者，每年出生的新生儿中突变纯合子和双重杂合子高达4.4‰[2]。
其发病区域主要集中在地中海沿岸、少数非洲地区、东南亚和中国的南方。
地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民
中国需要解决的研究主题
发展用于临床和预防的分子诊断技术 高发地区人群中的遗传流行病学调查 开展人群水平的地中海贫血预防
地中海贫血的研究策略
建立一系列诊断标准和诊断技术
研究背景
遗传流行病学调查
大人群监控和预防
指导制定计划
诊断
筛查
预防
地中海贫血的临床特征
小细胞低色素性溶血型贫血(中、重度) 黄疸 肝脾肿大 (脾大明显) 骨髓扩增 发育迟缓 合并感染 Bart’s 水肿胎 (α地贫,宫内或出生后半小时内死亡)
广州市主要出生缺陷的发生率 (1998-2001)
排序 出生缺陷分析
1 先天性心脏病 2 重型地贫 3 多指 4 肢体短缩 5 唇裂 / 腭裂
例数
260
发生频率 (/万)
19.66
208 15.73
200 15.12 111 8.39
109 8.24
地中海贫血: 常染色体隐性遗传病
Pedigree for -thalassemia in a typical family.
地贫纯合子：致死性出生缺陷
重型地贫 出生后1年内发病 多于未成年前因严重贫血而夭折 输血和去铁治疗可维持,代价昂贵
中间型地贫是严重致残性遗传病
家系样品采集现场
研究地中海贫血的意义
研究背景
重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题 通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施 WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病 预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求
地贫是严重致死、致残性遗传性血液病
常染色体隐性遗传病 受累基因： 地贫 - 珠蛋白基因（16p13.3）
β地贫 - β珠蛋白基因（11p15.3） 突变纯合子：重型地贫 - 致死
PPT讲义 徐湘民 遗传修饰基因与地中海贫血表型
Shandong
S
0.08% (1/1190)
c.41T>C 1
Guangdong Thalassemic endemic region, n=3839
1.25% (48/3839)
Guangxi
c.519_525dupCGGCGCC 36
c.895C>G 9
c.13G>A
1
c.892G>C 1
NA
1.000
Damaging
1 (1.6%)
NA
1 (1.6%)
1.000
Damaging
1 (1.6%)
携带KLF1突变的正常个体的 MCV 和 MCH 值降低
KLF1突变携带者及KLF1突变复合地贫 个体的HbA2 和 HbF 水平升高
Normal Individuals
-Thalassemia Trait
–/–
A/C
T/T
P2 9/M 4
None (0)
Occasional (1)
87
5.8 82.0 / -28 / CD41/42
[c.519_525dupC GGCGCC]+[=]
–/–
A/C
T/T
P3† 8/M
3
Occasional (8)
Systematic (8-12)*
86
c.1022G>A 1
Blood, 2014.
中国南方人群的KLF1突变谱
突变
c.519_525dup CGGCGCC c.895C>G c.1022G>A c.13G>A c.892G>C c.913+1G>A c.1001C>G
地中海贫血的产前诊断
地中海贫血的产前诊断地中海贫血（Thalassemia）是一组遗传性溶血性贫血。
由于珠蛋白基因的缺陷使珠蛋白肽链合成减少或不能合成，导致红细胞内血红蛋白的组成成分改变，引起慢性溶血性贫血。
组成珠蛋白的肽链有4种，α，β，γ，δ链，每种肽链由相应的基因编码。
根据珠蛋白基因缺陷的同而导致肽链合成障碍的不同，将贫血分为α，β，γ，δβ等几种类型。
以α和β地中海贫血较为常见。
地中海贫血常见于地中海沿岸国家，中东、印度、东南亚各国、中国南方等地。
我国以广西、广东、海南、江西、湖南、四川等地多见。
广西的地中海贫血发生率：α-thalassemia为15%；β-thalassemia为5%。
分型α-地贫：静止型：-α/αα，-α/αTα；轻型：--/αα；中间型（HbHdisease）：--/-α，--/αCSα；重型（HbBart's胎儿水肿综合征）：--/--。
β-地贫：轻型；中间型；重型。
β-地中海贫血（β-Thalassemia）β-地贫是由于β珠蛋白基因的缺陷导致β珠蛋白肽链合成障碍的慢性溶血性贫血。
至目前已发现200多种突变，国内28种。
病理生理学1、血红蛋白：HbA：α2β2（成人血红蛋白）；HbF：α2γ2（胎儿血红蛋白）；HbA2：α2δ2（成人血红蛋白）2、HbF增高；3、红细胞寿命缩短；4、红细胞生成素增加；5、铁负荷增加。
临床表现1.重型β地贫：生后6个月出现症状；慢性进行性贫血；苍白，黄疸，肝脾肿大；特殊面容；生长发育障碍；合并感染。
并发症：含铁血黄素沉着症，心力衰竭等。
重型β地中海贫血需终生依赖输血，使用昂贵的去铁剂，死亡率极高。
给家庭和社会带来沉重的经济负担（因病致贫、返贫）。
2、轻型β地贫：无症状或轻度贫血（Hb90-100g/L）；脾轻度肿大；HbA2（α2δ2）轻度升高；MCV50-60fl。
3、中间型β地贫：于幼童期出现症状；中度贫血；肝脾轻或中度肿大；生长发育障碍较轻，骨骼改变较轻。
地中海贫血的分子诊断技术进展
地中海贫血的分子诊断技术进展王文娟;朱春江【摘要】地中海贫血是常见的人类遗传性血液病之一,其表型严重程度与地中海贫血基因突变型密切相关.及时准确地对地中海贫血进行基因诊断及产前基因诊断,可为患者的治疗以及产前优生遗传咨询提供依据.笔者将常见的地中海贫血分子诊断技术进行综述.【期刊名称】《华夏医学》【年(卷),期】2017(030)002【总页数】5页(P172-176)【关键词】地中海贫血;分子诊断技术;基因【作者】王文娟;朱春江【作者单位】桂林医学院,广西桂林541004;桂林医学院附属医院,广西桂林541001【正文语种】中文【中图分类】R556.61目前对于地中海贫血的诊断技术，除了有很多用于诊断已知地中海贫血类型的基于PCR的诊断技术，还有用于检测未知地中海贫血的其他分子诊断技术[1]。
这些技术包括等位基因特异性寡核苷酸(ASO)杂交、斑点杂交、反向斑点杂交、突变特异扩增体系(ARMS)、限制性酶切分析、缺口-PCR(gap-PCR)等，以上技术主要用于检测已知突变，对于未知突变的筛查，基于PCR技术的变性单链DNA检测会更有优势，例如变性梯度凝胶电泳(DGGE)等。
基因突变鉴定的金标准仍然是DNA直接测序。
长期以来，DNA测序技术一直是分子生物学相关研究中最常用的技术手段之一[2]。
而二代测序技术、三代测序技术则实现了地中海贫血常见新发基因缺陷等高通量快速检测[3]，常见地中海贫血分子诊断技术如下。
Southern印记杂交(Southern blotting)技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern教授首创的，因而称该技术为Southern印迹杂交[4]。
但是，Southern印迹杂交技术操作烦琐、费时费力、费用高、需使用放射性核素，且其成功率还很大程度依赖于所用基因组DNA的质和量[5]。
近些年已被多重连接探针扩增法替代[1]。
常用于对缺失型突变的检测。
其原理是：针对缺失区域上下游序列设计引物，正常情况下，这对引物由于相距太远无法扩增出特定片段，但是，当上下游引物之间的序列发生缺失突变时，上下游引物被拉近，从而得以扩增出特定长度的片段。
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Thalassemias -thalassemia -thalassemia
• 遗传性持续性胎儿血红蛋白
Hereditary persistence of fetal hemoglobin(HPFH)
研究背景
Thalassemia
中国南方不同高发地
区人群携带率 1 ~ 23%
和地中海贫血的分子基础 及产前诊断
Zhongshan 2007, November 30
徐湘民
南方医科大学，医学遗传学教研室 南方医院产前诊断和遗传病诊断技术中心
遗传性血红蛋白病
Genetic disorders of human hemoglobin • 异常血红蛋白
Abnormal hemoglobin, Structural variants
Ⅱ4
M/22 13 5 4.57 82.3 29.5 95.7
Ⅱ5
F/35 118 5.87 63.0 20.1 96.9
Ⅲ1
F/1 112 6.09 56.2 18.4 90.0
Ⅲ2
M/5 141 5.02 78.5 28.1 97.4
HbA2(%) HbF(%) Genotype
2.20
0
--11.1 /αα
20kb
30kb
2 1
(--SEA) Deletion (- 4.2) Deletion (- 3.7) Deletion
导致α地贫的不同类型的基因缺失
Normal
Silent carrier
Thalassemia trait
Hb H disease
Hydrops fetalis
α Globin genes affected by thalassemia deletion
地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一
全球血红蛋白病人群负荷
WHO地区
非洲 美洲 亚洲 欧洲 大洋洲 合计
人口
(百万)
650 730 3150 780 30 5340
出生
(百万)
30.0 17.5 84.0 11.0 0.5 143.0
纯合子出生
(千)
230 5.0 120.0 1.6 0.2 356.8
地贫纯合子：致死性出生缺陷
重型地贫 • 出生后1年内发病 • 多于未成年前因严重贫血而夭折 • 输血和去铁治疗可维持,代价昂贵
中间型地贫是严重致残性遗传病
家系样品采集现场
研究地中海贫血的意义
研究背景
• 重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题 • 通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施 • WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病 • 预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求
+
1. 正常人HB 2. 轻型地贫 3. 异常HB E 杂合子 4. 新生儿HB Bart’s (地贫标准型） 5. HB H
-
1
2
3
500V, 25min
4
5
地贫发生的分子病理学经典机制
• α地贫: 基因缺失使基因功能丢失 • 地贫: 结构基因变异使转录异常
-50kb -10kb
0kb
10kb
MCV(fL)
64.5
MCH(pg)
21.0
HbA(%)
97.8
Ι2
M/54 150 4.96 85.7 30.2 97.5
Ⅱ1 Ⅱ2
M/33 F/27 173 126 5.70 6.23 88. 1 62.1 30.4 20.2 93.1 97.0
Ⅱ3
F/25 135 4.51 87.8 29.9 96.6
2.50
0
Αα /αα
3.27 2.98
3.62 0
Αα
--11.1
/αα /αα
3.37
0
Αα /αα
3. 28
0
Αα /αα
3.12
0
--11.1 /αα
2.18
7.79
-- 11.1 /αα
2. 65
0
Αα /αα
Jia SQ, et al. J Clin Pathol, 2004; 57:164-7.
Different point mutations reducing globin gene expression
EXON 1 IVS 1
EXON 2
Rund. & Rachmilewitz. N. Engl. J. Med. 2005, 353:1135-46.
α地贫疾病严重程度的单倍型顺序 2 1T 2 – – 1 2T1 – 1T – –
Hematological data of the proposituse and her family members.
Ι1
Sex/age(Y) F/49
Hb(g/L)
118
RBC(×1012) 5.63
地中海贫血的血液学表型特征
• RBC 参数 MCV MCH 细胞形态变化
• Hb电泳分析 Hb A2 () 或 () Hb Bart’s Hb H () Hb E ()
地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症
血红蛋白电泳图谱
Normal AA2
AE Bart’s AF HA
广州市主要出生缺陷的发生率 (1998-2001)
排序 出生缺陷分析
1 先天性心脏病 2 重型地贫 3 多指 4 肢体短缩 5 唇裂 / 腭裂
例数
260
发生频率 (/万)
19.66
208 15.73
200 15.12 111 8.39
109 8.24
地中海贫血: 常染色体隐性遗传病
Pedigree for -thalassemia in a typical family.
地贫是严重致死、致残性遗传性血液病
• 常染色体隐性遗传病 • 受累基因： 地贫 - 珠蛋白基因（16p13.3）
β地贫 - β珠蛋白基因（11p15.3） • 突变纯合子：重型地贫 - 致死
中间型地贫 - 致残 • 病理学基础： /β链比例失衡
重型地贫:胎儿水肿综合征 • 早产死胎或出生前后死亡 • 可导致严重产科并发症 • 无理想治疗方法
中国需要解决的研究主题
• 发展用于临床和预防的分子诊断技术 • 高发地区人群中的遗传流行病学调查 • 开展人群水平的地中海贫血预防
地中海贫血的研究策略
建立一系列诊断标准和诊断技术
研究背景
遗传流行病学调查
大人群监控和预防指导制定计划诊断 筛查 防地中海贫血的临床特征
小细胞低色素性溶血型贫血(中、重度) 黄疸 肝脾肿大 (脾大明显) 骨髓扩增 发育迟缓 合并感染 Bart’s 水肿胎 (α地贫,宫内或出生后半小时内死亡)