小胶质细胞原代培养
原代星形胶质细胞细胞培养方法
原代星形胶质细胞细胞培养方法
原代星形胶质细胞（primary astrocytes）是从胶质细胞含量较高的组织（如大脑皮层）中分离得到的。
其细胞培养方法如下：
1. 将新鲜脑组织剖出，用积聚素/液体软膜法（trypsin/liquid membrane method）进行酶解，使得细胞可以分离开来。
2. 使用无菌生理盐水或DMEM/F12将细胞悬液进行洗涤，然后放置在含有足够营养物质的培养基中，如DMEM。
3. 放置的培养皿需放置在37摄氏度、5% CO2和95%空气的恒温箱内，以提供最适宜的环境和养分。
4. 在培养初期，需要添加适当比例的血清（如胎牛血清），以提供必要的生长因子以及细胞所需的其它营养物质。
但在细胞数目增长到一定规模后，可将血清浓度逐步降低，以避免胎牛血清对实验结果的影响。
5. 定期更换培养基，以保证细胞在最佳的生长状态。
6. 如需进行实验或操作，需要将细胞从培养皿中移入滴定皿或其它相应容器中，并按照操作所需加入相应的药物或物质。
注意事项：
1. 在操作过程中需要尽可能避免对细胞的机械损伤，比如抽吸和强烈摇动。
2. 在移入滴定皿或其它操作容器时，需要注意细胞的密度，以避免过于稀疏或过于密集。
3. 在更换培养基、加药等操作时，需要十分温和，以避免对细胞造成伤害或死亡。
大鼠脊髓小胶质细胞体外纯化培养方法的建立
大鼠脊髓小胶质细胞体外纯化培养方法的建立陈雪;张婷;李彩红;王伟;骆翔;喻志源【摘要】Objective: To establish a simple and highly efficient primary culture method for microglia from rat spinal cord. Methods: Mixed glial cells were obtained from the spinal cord of newborn SD rats. On day 3, the culture medium was changed until the cultured microgila became fused on day 10. The microglia were purified using shocking methods (37 ℃, 180 rpm, 1~2 h) with different adhesion time (20~40 min). The isolated and purified microglia were identified with Iba1 and CD11b after 24 h. Results: The rat spinal cord microglia were successfully isolated and purified. The cultured microglia presented round or fusiform, highly refractive morpholo-gy. Iba1 and CD11b fluorescence tests showed that the purity of microglia was more than 95%. Conclusion:Using nutrition deprivation, Shock and different adhesion time methods, a primary spinal cord microglia culture method with high yield and purity was established, providing a useful tool for studying rat spinal cord microglia in vitro.%目的：建立一种简易高效的大鼠脊髓小胶质细胞原代培养方法。
8_9个月SD大鼠小胶质细胞的纯化分离培养
#论 著#8-9个月SD 大鼠小胶质细胞的纯化分离培养耿 慧 钟 远=摘要> 目的 建立培养8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞的方法。
方法以M cCarthy 的方法为基础,并加以改进,采用振摇结合贴壁分离法纯化小胶质细胞;CD11b 免疫细胞化学染色对纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定;相差显微镜下进行细胞形态观察和细胞计数;CCK-8比色法检测纯化的小胶质细胞在不同时间点的活力和增殖。
结果 培养的8-9个月SD 大鼠大脑皮层小胶质细胞,纯度达到95%,培养过程中未出现明显的增殖。
结论 8-9个月SD 大鼠大脑皮层的小胶质细胞在体外亦可成功培养,为小胶质细胞在老年疾病中的研究奠定了基础的。
=关键词>小胶质细胞;细胞培养;衰老;阿尔茨海默病中图分类号:R 331 文献标识码:A 文章编号:1006-351X (2010)02-0152-03The pr i m ary cu lture m e thod for isolation of m icrogli a fro m 8-9m on th rats GE N G H u i ,Z H ONG Yuan .D epart m entof G e ronti s m,the S i x t h P eop le s 'H osp ita l o f Shangha i Ji ao t ong U n i ve rs i ty ,Shangha i 200233,Ch i na Correspond i ng au thor : ZHONG Y uan ,Ema i:l zhongyuan60@yahoo =Abstract > O bjective T o se t up an easy and e ffecti ve m ethod for pr i m ary cu lti vate and pur ifi cation of the m i crog lia cells .M eth odsBased on class i ca lm i crog li a pri m ary cu lture m e t hod o fM cCa rt hy ,and w e i m proved th i sm ethod .In the l a ter pur ifi cation phase o f ce ll cu lti va tion ,m i crog lias w ere parall y ope ra ted and culti v ated w ith m echan ical separa ti on m ethod .M orpho log i c changes and the nu mber of ce lls were reco rded under the sa m e m agn ifi ed fi e l d o f scope .The acti v ity and t he pro liferati on w ere exam i ned by C ell Counting K it .R es u lts P resen t m od ifi edm ethod stead ily produced m icrog li a from 8-9m ont h SD rat w ith hi gh pur it y.N o sign ificant pro lifera ti on w as found i nnor m a l cu lt ura l cond iti on .Con clusi onThe m i crog lia ce lls i solated from 8-9m ont h SD rat can a lso be cu lti vatedsuccessfull y i n v itro ,prov i ding a basis f o r furt her research o f the m icrog lia i n A l zhe i m er d i sease .=K ey words >M icrog li a ;Ce ll culture ;A g i ng ;A lz he i m er s 'disease作者单位:200233上海,上海交通大学附属第六人民医院老年科通信作者:钟远,Em ai:l z hongyuan60@yahoo .co 小胶质细胞是脑内的免疫效应细胞,大约占中枢神经系统脑实质胶质细胞数量的10%。
神经胶质细胞的原代培养
星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养
1、取新生24h内的C57BL/6J乳鼠，在超净工作台中用75％乙醇浸泡3～5min消毒，断头，无菌条件下用眼科剪小心剪开头骨，取两侧大脑，体视镜下剥除脑膜，取出大脑皮质置于盛有HBSS液的无菌培养皿内。
2、用预冷的HBSS液漂洗2次，剪碎大脑皮质制成糜状，以0.25％的胰酶液，1:4与不完全培养基混合，37℃消化15min，并用含有10％胎牛血清的DMEM/F12-K完全培养基终止消化，轻轻吹打。
3、800g离心5min，弃上清。
4、用DMEM／F12完全培养基制成单细胞悬液，以70目滤网过滤，吸取细胞悬液接种至预先已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内，置37℃、5％CO2培养箱中培养。
0.5h后将培养基移至已包被多聚赖氨酸的细胞培养瓶内继续培养。
5、24h后轻柔换液。
以后每隔2～3d换一次培养液，且每次换液前用HBSS 液剧烈振荡洗涤2次，并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。
6、7至8天后，当星形胶质细胞汇合并且覆盖的小胶质细胞暴露在星形胶质细胞层上或已经与星形胶质细胞层分离时，在轨道摇床上以180rpm摇动T25烧瓶120分钟以分离收集小胶质细胞。
加入新鲜的细胞培养基，并在240rpm下16小时继续摇动烧瓶以除去少突胶质细胞前体细胞（OPC）。
7、胰酶消化后的细胞移至培养皿中传代，培养2d后可用免疫荧光的方法进行细胞鉴定。
bv2小胶质细胞培养方法
bv2小胶质细胞培养方法bv2小胶质细胞是一种常用于神经科学研究中的细胞系，它是从小鼠大脑中的胶质细胞中分离出来并进行培养得到的。
在研究神经炎症、神经退行性疾病等领域，bv2小胶质细胞的培养方法非常重要。
本文将介绍一种常用的bv2小胶质细胞培养方法。
准备培养基和培养器具。
常用的培养基包括DMEM/F12、FBS、青霉素和链霉素等，可以根据实际需要添加其他补充物。
培养器具包括细胞培养板、离心管、移液器等。
接下来，收集小鼠大脑组织并分离胶质细胞。
可以选择小鼠的新生仔或成年小鼠进行实验。
将小鼠的大脑取出，去除外膜和血管，并切成小块。
将切好的组织块转移到含有消化酶（如胰蛋白酶）的消化液中，然后在37摄氏度的恒温培养箱中进行消化。
消化时间一般为30分钟至1小时，根据组织的大小和样本量进行调整。
消化结束后，用培养基停止消化反应，并用离心将细胞沉淀下来。
将沉淀的细胞用培养基重新悬浮，并通过筛网过滤掉组织碎片和大颗粒。
然后，将细胞计数，并根据实验需要进行稀释。
将细胞悬浮液均匀分配到预先涂有培养基的细胞培养板中，使其在培养基中均匀分布。
将细胞培养板放入培养箱中，调节温度为37摄氏度，湿度为95%，并提供适当的CO2气氛（一般为5%）。
每2-3天更换一次培养基，并观察细胞的生长情况。
当细胞达到80%的密度时，可以进行下一步的实验。
在培养过程中，需要注意细胞的健康状态。
细胞应该呈现出典型的胶质细胞形态，即星形或梭形，并有良好的附着性。
如果细胞呈现不正常的形态，或者细胞死亡较多，可能是培养条件不适合，需要进行调整。
培养过程中还需要注意细胞的污染问题。
保持培养器具的清洁和消毒，避免细菌、真菌等污染源的进入。
如果发现培养基出现异常，如呈现黄色或浑浊，可能是细菌污染，需要立即更换培养基。
在bv2小胶质细胞培养过程中，还可以进行相关实验，如细胞增殖实验、分化实验、细胞活力检测等。
这些实验可以进一步研究bv2小胶质细胞的生物学特性和功能。
星形胶质细胞和小胶质细胞培养
星形胶质细胞和小胶质细胞培养文件编码（GHTU-UITID-GGBKT-POIU-WUUI-8968）胶质细胞原代培养及纯化2.1原代胶质细胞培养培养箱中6h以上，使用1）于细胞培养前1d，用0.05%PLL(orPLO)包被培养瓶，置5%CO2前用HBSS液冲洗3次，备用；2）1d内的新生C57小鼠4只，置入75%乙醇中消毒后断头处死，75%乙醇中漂洗一次，迅速转移至预冷的HBSS（可加入双抗）中，弯镊从鼻部固定住头部，迅速剪开皮肤，换剪刀，从正中线剪开颅骨，弯镊向两边剥去颅骨，去小脑，将脑组织置于含预冷的HBSS的60mm培养皿中；3）解剖显微镜下仔细剥离皮层表面脑膜和血管后置于含预冷的HBSS的60mm小皿中，用HBSS洗3次，留少量刚好盖过组织，用眼科弯剪剪碎组织（越碎越好），加入0.25%胰酶2mL，于37℃水浴中消化7min，消化过程中摇晃离心管数次，使消化均匀；4）加入含有血清DMEM/F12完全培养基10mL(1:1)终止消化；5）使用玻璃滴管或1mL枪头吹打（可将其头部略剪一部分，以扩大口径），若一次取的动物只数多，由于液体过多，可使用5mL枪头进行吹打，但因其吹打力度较大，操作时要尽量轻且吹打次数不宜过多；6）吹打过程采用分步吹打法，每吹打15~20下，静置1~2min，吸取上清，以避免已消化出的单细胞被过多吹打，该过程重复3次；7）200目筛网过滤至50mL离心管中，去除残余的组织块；8）1000r/min×5min，弃上清；9）调整细胞数为1～2×106/mL,接种到25cm2培养瓶中,每瓶5mL；10）接种24h后换以新鲜完全培养基，以除去悬浮死亡的细胞及碎片；11）细胞每3d更换培养液，培养10～12d左右细胞基本铺满瓶壁，进行纯化分离。
分离根据胶质细胞间贴附性不同进行，将培养瓶放入恒温振荡器中，37℃180rpm振荡5h，上层疏松贴壁的为小胶质细胞；底层即是纯度较高的星形胶质细胞，收集小胶质细胞，离心重悬，接种于35mm圆皿中；星形胶质细胞用0.25%胰酶消化按1：2传代，待长满后用于实验。
大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案
大鼠小胶质细胞原代培养及分离纯化实验方案经过相关文献阅读，参考了众多对于小胶质细胞培养方案，对比了不同方案的利弊优缺，整合了相对符合本实验室条件和实验要求的方法，如有其他变更方案，以修改后为准。
1.实验材料剪刀、小镊子、小毛刷、DMEM/F12培养液、胎牛血清、0.05% 胰蛋白酶、PBS液、恒温细胞培养箱、倒青霉素、链霉素、培养皿离心管、50 mL 细胞培养瓶、CO2置相差显微镜、细胞板、小鼠抗大鼠OX42单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和新生SD大鼠等2.实验步骤2.1小胶质细胞的混合培养取新生SD大鼠若干只(出生24h内),在无菌条件下断头, 迅速剪开颅骨, 取出脑组织至盛有冷PBS 液的培养皿中反复冲洗以去除血污; 再把全脑移入另一盛有PBS 液的培养皿中, 用小毛笔轻轻刷去脑表面的脑膜和血管, 用PBS液冲洗后剪去脑干仅留大脑半球; 用小剪刀充分剪碎脑组织, 加入比组织块总量多30~50倍的0.05% 胰酶, 再移入50 mL 离心管, 用吸管反复吹打消化至肉眼观察无明显的脑组织团块; 加入DMEM/F12 完全培养基(含10%胎牛血清、100U/mL 青霉素和100 ug/mL 链霉素) 终止消化, 再次反复吹打制成单细胞悬液, 配平, 1000 r/ min, 离心5min, 弃上清; 加定量完全培养液再次制成细胞悬液, 更具实验需要接种入若干个50 mL细胞培养瓶或者培养皿中, 置于5%CO恒温细胞培养箱( 372度) 培养; 3 h 后更换1 次培养液, 以后每3 d 换1 次液, 并在镜下观察细胞的生长和存活情况。
2.2小胶质细胞的分离和纯化细胞培养18 d~20d左右, 在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞培养物中出现细胞分层现象, 即底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的大细胞(星型胶质细胞) , 而上层细胞明显偏小呈类圆形、折光性强, 附着于星型胶质细胞表面生长(小胶质细胞) ; 倒掉培养液, 用0.05%胰酶2~ 3 mL 消化, 边观察边轻轻晃动培养瓶, 等到贴附在星形胶质细胞上的小胶质细胞脱离下来, 将含漂浮的小胶质细胞的消化液转入10 mL离心管, 立刻用完全培养基终止消化。
一种改良小胶质细胞的培养方法
一种改良小胶质细胞的培养方法聂菁;李耀斌;周明;吕诚【期刊名称】《南昌大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(049)004【摘要】目的建立一种简便高效的小胶质细胞的原代培养及纯化方法.方法无菌环境下采取雄性新生SD大鼠(24 h内)全脑,清洗、剪碎,以0.25%胰蛋白酶消化,200目滤网过滤,混合培养.9 d后,利用盐酸利多卡因注射液代替传统机械振摇纯化分离小胶质细胞;采用免疫细胞化学方法检测CD11b/c的表达情况,观察小胶质细胞形态.结果改良方法可获得高产量和高纯度的小胶质细胞.显微镜下可见刚贴壁的小胶质细胞多为圆形,边缘不规则;培养4～5 d后小胶质细胞形态多呈阿米巴样,折光不均.结论该方法步骤简便,可有效地提高小胶质细胞的产量和纯度,具有较高的实用价值,为研究与小胶质细胞相关的疾病提供了基础.【总页数】3页(P1-3)【作者】聂菁;李耀斌;周明;吕诚【作者单位】南昌大学医学院解剖学教研室,南昌,330006;南昌大学医学院解剖学教研室,南昌,330006;南昌大学医学院解剖学教研室,南昌,330006;南昌大学医学院解剖学教研室,南昌,330006【正文语种】中文【中图分类】R322.81【相关文献】1.一种改良的小胶质细胞培养方法及初步研究 [J], 杨忠;何家全;蔡文琴2.一种原代小胶质细胞培养与纯化方法的改良 [J], 徐蛟天;边立功;张琰;王威;陈孝祥;陈鑫月;李庆;邓兴力3.SD大鼠视网膜小胶质细胞原代培养方法的改良 [J], 陈雪;张培;曹安民4.小胶质细胞纯化分离培养方法的改良 [J], 赵虎;朱长庚;魏瑛;王伟5.新生大鼠原代小胶质细胞分离培养方法的改良 [J], 钱凯;唐琳俊;王希;杨坤;张开鑫;钱腾达;马涛;石晶;李立新因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
小胶质细胞原代培养
时间：15天
试剂：
出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠（斯莱克）9只
DF12培养基（GIBCO，C11330）90ml
胎牛血清（FBS）(10%) （GIBCO，10099）5ml
解剖液50ml
1 x胰蛋白酶(0.25%)（Gibco，25200-072）10ml
10mg/ml DNA酶70ul
75%酒精200ml
器材：
酒精棉球1杯（20个）
装有75%酒精的敞口容器1个
原代解剖器械盒（2把中号镊子，1把中号剪刀，1把眼科弯镊，1把眼科直镊，1把眼科剪，2把显微镊，1把显微剪）
洗净消毒后小瓶3个（带盖子）
小平皿4个（带盖子）
解剖镜+冷光源
消毒后卫生纸12张
1ml移液器1把+枪头1盒
10ml玻璃离心管3个
T75大培养瓶3个
消毒后吸管3根
紫外消毒白大褂1件
试剂配制：
中和胰蛋白酶用的完全培养基：DF12 45ml和FBS 5ml混合而成。
步骤：
1、取出生后1-2天的新生C57BL/6小鼠9只，泡在酒精中消毒后取出大脑，置于放有解剖液的小平皿中，在解剖镜下剥离血管膜
关键：注意无菌操作；剥离血管膜要完全
2、将剥离完血管膜的大脑放入预置有1ml解剖液的青霉素小瓶中，用显微剪剪碎（<1mm3）关键：剪碎效果较用枪头吹吸好，要剪得尽量碎
3、加入两滴DNA酶和1ml胰酶（胰酶终浓度为0.125%），于37℃孵箱中孵育15分钟
关键：每5分钟可略微晃动一下以助于消化
4、取出小瓶，将液体倒入离心管中，加5ml完全培养基，离心（1000rpm*5分钟），取出离心管，吸出上清，再加入5ml无血清培养基，吹打后静置沉降20分钟，将上清用吸管吸出，加入T 75大培养瓶中，放入孵箱中培养，3小时后换液。
关键：静置沉降后吸取上清液时吸取中层（最上层和最下层均不要），避免杂质吸入培养瓶中
5、每7天换一次液，培养14天后取出，在摇床中培养6小时（200rpm ，37o C），取上清加入离心管中离心（400g*8分钟），弃上清，加入4ml无血清培养基轻轻吹打重悬，均匀滴加于24孔培养板的中央4个孔中，于孵箱中培养半小时使小胶质细胞贴壁，取出，吸出上清，再每个孔加1ml培养基，即得较纯净的小胶质细胞。
关键：小胶质细胞贴壁后吸取上清当轻微吹打，以使杂细胞悬浮吸去。