MS培养基母液的配制、培养基制备及灭菌

MS培养基母液的配制、培养基制备及灭菌

一、实践目的

通过本实训，学会配制大量元素、微量元素、铁盐、维生素、生长调节剂等培养基母液。通过MS固体培养基的配制，掌握配制培养基的基本技能。通过对培养基和培养用具的灭菌，掌握高压蒸汽灭菌和干热灭菌的一般操作技术。

二、实践用具与材料

移液管、电炉、PH试纸、培养瓶、标签、铅笔、量筒、烧杯、容量瓶、广口瓶、玻棒、电子天平、托盘天平、棉花、报纸等用具。

硝酸铵、硝酸钾、EDTA、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、IAA、BA等药品、琼脂、蔗糖、蒸馏水、0.1mol/L的NaOH、0.1mol/L的HCL、95%酒精

三、实践学时与场地

10学时，植物组培实验室。

四、实践内容

（一）三角瓶棉塞的制作

棉塞的作用有：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。

要求：形状，大小，松紧适度

制作：（1）取一大小适当的纱布，将其中心铺于三角瓶口，任其自然下垂至外壁，用玻璃杯将纱布向瓶内推进，至棉塞所需长度，握住瓶壁及纱布，取适量棉花向内填塞并压紧（2）将棉塞尾部加适量棉花并压紧，使其略大于瓶口，收紧尾部纱布，并用棉线扎进，剪去多余线头和纱布，棉塞制作完毕

（3）使用时，再用牛皮纸或二层报纸包扎好

（二）培养基母液的配制

母液是欲配制培养基的浓缩液，一般配成比所需浓度高10—100倍的溶液。

优点：（1）保证各物质成分的准确性。（2）便于配置时快速移取。（3）便于低温保藏。

1、步骤

⑴测定各类母液保存容器容量，记录。

⑵根据记录设计各种母液所配浓度倍数和制培养基时取用量

⑶计算各种药品所需用量

⑷称量药品

大量元素等大于0.1g用托盘天平称量，微量元素等小于0.1g用电子天平称量。

⑸溶解

⑹定容

⑺写上标签

⑻装瓶

将配制好的母液分别装入试剂瓶中，贴好标签，注明各培养基母液的名称、浓缩倍数、日期。注意将易分解、氧化的溶液，放入棕色瓶中保存。

（9）冰箱保存。

2、母液配方

MS培养基配方=见教材

⑴MS大量元素母液（10X）

称10升量溶解在1升蒸馏水中。配1升培养基取母液100ml。

⑵MS微量元素母液（100X）

称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。

注意：C oCl2·6H2O和CuSO4·5H2O可按10倍量，即0．25 mgX10=2．5 mg（100倍量25 mg）称取后，定容于100ml水中，每次取1ml（0.1ml，即含0．25 mg的量）加入到母液中。

⑶MS铁盐母液（100X）

称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。

注意配制时，应将两种成分分别溶解在少量蒸馏水中，其中EDTA盐较难完全溶解，可适当加热，并将pH调至5.5。混合时，先取一种置容量瓶（烧杯）中，然后将另一种成分逐加逐剧烈震荡，至产生深黄色溶液，最后定容，保存在棕色试剂瓶中。

⑷MS有机物母液（100X）

称10升量溶解在100ml蒸馏水中。配1升培养基取母液10ml。

⑸生长调节剂

单独配制，浓度为1-5 mg/ml（书中为0.5-1mg/ml），一般配成4 mg/ml 。溶解生长素时，可用少量0．5 –1N的NaOH (6-BA)或1ML95%酒精(2，4-D和NAA)溶解，溶解分裂素类用0．5 –1N的HCl加热溶解。

⒊配制培养基母液时注意事项：

①某些离子易发生沉淀，可先用少量蒸馏水溶解，在按配方顺序依次混合；

②配制母液时必须用蒸馏水或重蒸馏水；

③药品应用化学纯或分析纯；

（三）培养基的制备

1.步骤

⑴本次实验要求制作培养基数量1L

培养基成分用量10X大量元素母液100ml 100X微量元素母液10ml

1000XCoCl

2·6H

2

O 母液1ml

1000XCuSO

4·5H

2

O母液1ml

100X铁盐母液10ml

蔗糖30g

⑵根据制作要求计算培养基各种母液的用量。

3、按下列母液的顺序，用量筒或移液管提取母液，放入有一定蒸馏水的烧杯中。

4、加入固化剂：称量10g琼脂，溶解，在电炉上不断加温溶液，并不断搅拌，使琼脂熔化。

5、加糖：放入30g已称量蔗糖，稍加搅拌。

6、加入生长调节物质，激素类型和用量视培养物不同而不同。

7、定容：定容至所需升数。

8、调整PH值：迅速用PH试纸测试PH，应该在5.8-6.0之间，如过高，则滴加0.1mol/L 的HCL调整，过低滴加0.1mol/L的NaOH调整。

9、培养基分注：趁热将配制好的培养基分注到培养瓶中，每瓶装入20-35ML左右的培养基。分注后立即加盖，贴上标签，注明培养基的名称和配制时间。

（四）、灭菌

1、高压蒸汽灭菌

⑴包扎用牛皮纸、纱布把玻璃器皿和金属器械包扎好。

⑵装水先在高压灭菌锅内装入一定量的水，需淹没电热丝。

⑶灭菌将装好培养基的培养皿、包扎好的玻璃器皿和金属器械、放入高压灭菌锅。压力升至49kPa时，打开排气阀排冷气，关闭排气阀继续加压至108kPa, 锅内温度为12-10C 时，保持15-20min，关断电源，自然冷却。

⑷贮藏将培养基、器械取出置于30℃下备用。

附：组培的其他灭菌方式

◆干热灭菌

⑴洗涤将组织培养的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。

⑵灭菌把洗涤干净的玻璃器皿放到烘箱中，在150℃温度下，干热灭菌1小时，或120℃下2小时。

⑶放置灭菌完毕，待冷却后取出。

◆紫外线消毒

用于空气、操作台表面和一些不能使用其它方法进行消毒的培养器皿（如塑料培养皿、培养板等）的灭菌，方便，效果好，是目前各实验室常用的消毒法。缺点是（1）产生臭氧，污染空气，对身体有害；（2）射线照射不到的部位起不到消毒作用，故消毒时，物品不宜相互遮挡。

◆滤过消毒

用于大多数培养用液，如人工合成培养液、血清、酶溶液等（这些在高温下会发生变性，失去其功能，必须采用滤过法除菌。一般用液常用孔径0.22um滤膜过滤即可。

注意：（1）滤膜用后丢弃，滤器清洗也比较方便，先用毛刷蘸洗涤剂刷洗干净，用自来水冲洗后，再用蒸馏水冲洗，凉干即可；

（2）用前再装上一张新的滤膜；

（3）消毒时旋钮不要扭太紧，凡与空气接触部位都用纸包装好，以保证消毒时的效果；

（4）消毒后，在无菌环境中立即将旋钮扭紧；

（5）滤过少量液体时，用一种能安装在注射器上的小滤器，使用相同的滤膜，滤过时把滤过物装入注射器针管内，压出过滤物注入无菌容器中即可。