直接显微镜酵母菌霉菌计数DME知识培训
《显微镜直接计数法》课件
数据处理
根据观察到的微生物数 量，进行数据处理和分 析，推算样品中微生物
的数量。
03
显微镜直接计数法的应用
在生物学中的应用
微生物计数
显微镜直接计数法常用于 微生物计数，如细菌、酵 母和原生动物等。
细胞计数
在细胞生物学研究中，显 微镜直接计数法可用于细 胞计数，如血细胞、组织 细胞等。
定义与特点
定义
显微镜直接计数法是通过显微镜 直接观察微生物的数量并进行计 数的方法。
特点
该方法具有操作简便、快速、准 确等优点，但也存在一定的局限 性，如需要经验丰富的操作人员 和较高的样品浓度。
02
显微镜直接计数法的原理
原理概述
显微镜直接计数法是一种利用显 微镜直接观察和计数微生物数量
的方法。
对观察者要求较高
显微镜直接计数法需要观察者具备较高的专业知识和技能，否则容易 出现误差和误判。
05
显微镜直接计数法的改进和发展趋势
பைடு நூலகம்
技术改进
自动化技术
通过引入自动化技术，减少人工 操作，提高计数准确性和效率。
高分辨率成像
采用高分辨率成像技术，提高显 微镜的分辨率和清晰度，使计数
更加准确。
图像处理算法
显微镜直接计数法可以直接观察样本，能 够直观地看到微生物的数量和形态，有助 于快速判断和识别。
显微镜直接计数法通过直接观察样本，能 够较为准确地计算出微生物的数量，避免 了间接计数法的误差。
灵活性
操作简便
显微镜直接计数法可以根据需要选择不同 的观察区域和样本，灵活性较高，适用于 多种不同类型的微生物计数。
涂片法
将样品涂抹在载玻片上， 利用显微镜观察和计数微 生物的数量。
微生物快速检测法(DME)
微生物快速检测法（DME）1、原理细菌和酵母菌都能在染色后通过显微镜直接计数，本程序可以对淀粉糊浆中活菌/死菌微生物污染进行准确计数2、仪器及试剂1、显微镜，40X物镜下观察2、天平3、微波炉4、三联不锈钢过滤器（包括三联支架+真空泵）5、平口镊子6、0.8um/25mm过滤膜7、载玻片8、盖玻片9、异丙醇，100％10、吖啶橙染色剂11、浸油12、75％乙醇13、洗洁精14、无菌杯3、操作程序1取一洁净的无菌杯（可重复使用，用洗洁精加自来水清洗干净后，使用离子水冲洗至少三次）2称取样品（取13克加去离子水至103克）3使用微波炉将配置好的样品微热（使样品充分溶解）4用去离子水将三联过滤杯冲洗干净。
（开过滤器，开泵—关过滤器，关泵—开排气阀，排气抽真空）（注：后可加入75％乙醇5ml，放置1min后滤掉）5使用平口镊子放置滤膜，亮面朝上，滤膜与过滤砂芯中间无缝隙6取出热好的样品，过滤，至103克样品全部滤完7关过滤器，关泵，排气8加入2.5ml吖啶橙染色剂，使其溢满整个滤膜9染色一分钟后，关排气阀，开过滤器，开泵10使用异丙醇冲洗（至少2.0ml）11在等待染色的1min时，取一载玻片加一滴浸油12在泵开启的状态下，用镊子移下滤膜（有助于滤膜干燥，便于观察）13在滤膜上再加一滴浸油，盖上盖玻片并用镊子将盖玻片压实（便于观察）14将放好滤膜的载玻片放在显微镜的40倍物镜下观察15细菌和酵母菌呈现桔色或绿色（细菌为针尖大小的亮点，酵母菌呈有规则的圆形或椭圆形，多为两个呈三个连在一起）16取中间位置观察20个视野，菌落总数/ml为20个视野的平均值*8617观察时，应注意滤膜四周的细菌，最好每个角落能观察到注意：1每个检测过程都在通风橱中进行2此检测方法检测出的菌类为死菌和活菌的总数4、技术程序可以采用集中计算方法确定每毫升的菌数，需要确定显微镜的视野范围，这个面积就是显微镜在给定放大倍数内可观察到的视野范围的总面积。
培训讲义-细菌.霉菌及酵母计数
16400 37750 27100
16000或 1.6×104
38000或 3.8×104
27000或 2.7×104
表3-1 稀释度选择及菌落数报告方式
例 稀释液及菌落数 两稀 菌落总数个 报告方式个/g
次
释液 /g 或mL
或mL
10-1 10-2 10-3 之比
4 多不可 多不 313 —— 计 可计
关于稀释倍数的选择可参考细菌菌落 总数的测定。
3.2.1 霉菌菌丝的特征
（1）平行壁：霉菌菌丝呈管状，多数情况 下，整个菌丝体的直径是一致的。因此在 显微镜下菌丝壁看起来象两条平行的线。 这是区别霉菌菌和其他纤维时最有用的特 征之一。
（2）横隔：许多霉菌菌丝具有横隔，毛霉、 根霉等少数霉素菌的菌丝没有横隔。
液体或半固体样品可用迅速颠倒容器 25次来混匀。有的规定在实际操作时， 振摇时振幅要30cm，7s振摇25次。
为了减少样品稀释倍数的误差，在连 续递增稀释时，每一稀释度应更换一 根吸管。
3.1.2 培养基的选择
（1） 马铃薯-葡萄糖琼脂培养基 （PDA）：
马铃薯含有氮源、丰富的维生素， 霉菌和酵母生长良好。抗菌素可以 抑制细菌。
（5）培养温度37℃，水产品30℃。 （6）检样从开始稀到最后一个平皿所用
时间不宜超过20min。 （7）培养基温度、用量：46℃，15mL。
霉菌和酵母计数
Enumeration of molds and yeasts
1. 概述
霉菌和酵母广泛分布于自然界并可作为 食品中正常菌相的一部分。
25~28℃ 5d 菌落计数
报告
2.2 霉菌直接镜检计数法
常用的方法为郝氏霉菌计数法，或称 霍华德（Howard）霉菌计数法。
《霉菌和酵母计数》课件
在生物领域中，霉菌和酵母起着重要作用。本课件将介绍计数方法的基本原 理和实验步骤，以及在工程和医学中的应用。
计数方法
平板计数法
通过将微生物样品均匀涂布 在琼脂平板上，结合菌落计 数原理，用于测定微生物的 数量。
筛选计数法
通过过滤和筛选微生物样品， 用显微镜观察计数，可用于 测定微生物的浓度。
2
对参与学习者的要求
说明参与学习此课程的学习者应具备的知识和技能，以及学习的态度和动力。
3
后续学习建议及扩展阅读资料
提供参与学习者继续学习的建议和推荐扩展阅读资料，以进一步拓展知识。
浓度计算公式
根据样品中微生物的计数结 果，进行浓度计算，以了解 微生物的分布情况。
现场实验
实验设备及 时所需要使用的实验设备和试剂。
详细阐述进行霉菌和酵母计数实 验的步骤及操作指南。
数据处理及分析
介绍如何处理实验数据并进行统 计和分析，以得出可信的结果。
结论及应用
1 结论简述
总结霉菌和酵母计数实验 的结果，并提出对微生物 数量的评估和判断。
2 工程及医学中的应用 3 发现与尚未解决的问
题
探讨霉菌和酵母计数在工
程和医学领域中的应用，
讨论与霉菌和酵母计数相
如食品工业和制药工业等。
关的挑战和待解决的问题，
为未来的研究提供方向。
总结
1
概括本课程的重点
对本课程的核心内容进行概括，强调学习目标和要点。
霉菌酵母菌计数实训报告
一、实训目的1. 掌握观察酵母菌和霉菌形态的基本方法；2. 观察酵母菌和霉菌的形态特征；3. 学习使用显微测微尺测量微生物大小；4. 熟悉霉菌酵母菌计数的实验流程和操作方法；5. 提高食品微生物学检验技能。
二、实训原理霉菌和酵母菌是广泛存在于自然界和食品中的微生物，它们对食品品质和人体健康具有重要影响。
霉菌和酵母菌计数是食品微生物学检验的重要指标之一，通过计数可以了解食品中霉菌和酵母菌的数量，为食品卫生质量控制提供依据。
本实训采用直接镜检计数法，利用显微镜观察霉菌和酵母菌的形态特征，并通过显微测微尺测量其大小，从而进行计数。
三、实训材料与仪器1. 实验材料：酵母菌、霉菌纯培养物，食品样品；2. 仪器设备：显微镜、显微测微尺、血球计数板、酒精灯、接种环、无菌培养皿等。
四、实训步骤1. 预备工作：a. 准备好实验所需的材料与仪器；b. 检查显微镜、显微测微尺等仪器的性能；c. 熟悉实验操作流程。
2. 观察酵母菌和霉菌形态：a. 将纯培养物接种于无菌培养皿中，培养至适宜生长状态；b. 取少量培养物，涂布于载玻片上；c. 将载玻片置于显微镜下，观察酵母菌和霉菌的形态特征，如菌丝、分生孢子、菌落等。
3. 使用显微测微尺测量微生物大小：a. 将显微测微尺放置于显微镜载物台上；b. 对准显微镜视野中的微生物，调整测微尺的刻度；c. 记录微生物的长度。
4. 霉菌酵母菌计数：a. 将纯培养物接种于血球计数板中，培养至适宜生长状态；b. 将血球计数板放置于显微镜下，观察菌落；c. 记录每个视野中菌落数量；d. 计算霉菌酵母菌总数。
5. 结果分析：a. 分析实验数据，得出霉菌酵母菌计数结果；b. 对比实验结果与理论值，分析误差原因。
五、实训结果与分析1. 观察酵母菌和霉菌形态：实验中观察到酵母菌为单细胞，呈圆形或椭圆形，细胞壁厚，具有芽生繁殖方式；霉菌为多细胞真菌，菌丝体发达，无较大的子实体，具有分枝、分生孢子等特征。
酵母菌大小测定及显微镜直接计数[指南]
![酵母菌大小测定及显微镜直接计数[指南]](https://img.taocdn.com/s3/m/455b9f37ae45b307e87101f69e3143323968f51b.png)
实验一：酵母菌大小测定一、实验器材1、菌种：酵母菌液体培养物2、仪器和其他物品目镜测微尺，镜台测微尺，普通光学显微镜，擦镜纸，载玻片，滴管等。
二、实验目的及要求1、学习并掌握使用显微测微尺测定微生物大小的方法。
2、掌握对不同形态细菌大小测定的分类学基本要求，增强对微生物细胞大小的感性认识。
三、基本原理微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。
微生物大小测定需借助测微尺---目镜测微尺和镜台测微尺，两者配合使用。
镜台测微尺是一个在特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每个小格10μm。
镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺每格地相对长度。
目镜测微尺是一块可放入接目镜内的圆形小玻片，其中央有精确的等分刻度，一般有等分为50小格和100小格两种。
测量时，需将其放在接目镜中的隔板上，用以测量经显微镜放大后的细胞物像。
由于不同显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，目镜测微尺每小格在不同条件下所代表的实际长度也不一样。
因此，用目镜测微尺测量微生物大小时，必须先用镜台测微尺进行校正，以求该显微镜在一定放大倍数的目镜和物镜下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。
然后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，即可计算出细胞实际大小。
四、操作步骤1、装目镜测微尺(换目镜)把目镜上的透镜旋下，将目镜测微尺刻度朝上放在目镜镜筒内的格板上，然后旋上目镜透镜，再将目镜插入镜筒内。
※双目显微镜的左目镜通常配有屈光度调节环，不能被取下，因此使用双目显微镜时目镜测微尺一般都安装在右目镜中。
2、校正目镜测微尺（1）放镜台测微尺将镜台测微尺刻度面朝上放在显微镜载物台上。
（2）校正先用低倍镜观察，将镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行。
酵母菌的形态观察及死活鉴别与显微直接计数法
酵母菌地形态观察及死活鉴别与显微直接计数法酵母菌地形态观察及死活鉴别与显微镜直接计数法I 酵母菌地形态观察及死活鉴别一、目地要求观察酵母菌地细胞形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞地实验方法.二、基本原理酵母菌是多形地、不运动地单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显地分化，菌体比细菌大.繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；地.0.1(1)(2)泡.(3)(1)II1．明确显微镜计数地原理.2．学习使用血球计数板进行微生物计数地方法.二、基本原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用地微生物计数方法.此法地优点是直观、快速.将经过适当稀释地菌悬液(或孢子悬液)放在血球计数板载玻片与盖玻片之间地计数室中，在显微镜F进行计数.由于计数室地容积是一定地(0.1mm3)，所以可以根据在显微镜下观察到地微生物数目来换算成单位体积内地微生物总数目.由于此法计得地是活菌体和死菌体地总和，故又称为总菌计数法.血球计数板，通常是一块特制地载玻片，其上由四条槽构成三个平台.中间地平台又被一短横槽隔成两半，每一边地平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间地大方格即为计数室，微生物地计数就在计数室中进行.计数室地刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格.；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格..但无论是哪种规格地计数板，每一个大方格中地小方格数都是相同地，即16 X 25：400小方格.每一个大方格边长为1mm，则每一大方格地面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间地高度为0.1mm，所以计数室地容积为0.1mm3.25，因B (个1ml1234静止.一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜.每个计数室选5个中格(可选4个角和中央地中格)中地菌体进行计数.位于格线上地菌体一般只数上方和右边线上地.如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞地一半时，即作两个菌体计数.计数一个样品要从两个计数室中计得地值来计算样品地含菌量.5．清洗血球计数板使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干.镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物.若不干净，则必须重复洗涤至干净为止.五、实验报告1．结果将结果记录于下表中.A表示五个中方格中地总菌数；B表示菌液稀释倍数.2．思考题根据你实验地体会，说明用血球计数板计数地误差主要来自哪些方面?应如何尽量减少误差，力求准确？。
霉菌酵母菌检验知识分享
5）作平皿内菌落计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
二、平皿菌落总数计算CFU/g（ml）
（1）若有两个连续稀释度的平板菌落总数在适宜计数范围（10CFU~150CFU）内时，按式（Ⅰ）计算：
N= ∑C/(n1+0.1n2)d………………（Ⅰ）
有时在标准视野中出现极细的菌丝丛或小菌落，则以其直径来计算，超过视野直径1/6为阳性视野，否则为阴性视野。阳性视野用“＋”表示；阴性视野用“－”表示之。
对初次学习菌计测法者，作记录前，先在记录纸上划出计测室上50视野均匀分布的小格，观察一个标准视野，立即在相应的方格内作“＋”或“－”的记录，或“－”以空格表示之。
如均大于150CFU，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
如均小于10CFU，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。
如菌落数有的大于150CFU，有的又小于10CFU，但均不在10~150CFU之间，则应以最接近150CFU或10CFU的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
如所有稀释度（包括液体样品原液）均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告。
液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml无菌稀释液（蒸馏水或磷酸盐缓冲液或生理盐水）的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中混匀，为1:10样品匀液。
用灭菌吸量管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸量管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。
取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸量管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。
琼脂凝固，正置平板。
培养
样品28℃±1℃培养
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13/10/2019
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操作程序
8.切断真空，用2.5mL 吖啶橙染色剂滴溢满滤膜； 9.静止一分钟然后抽真空； 10.用2.5mL过滤蒸馏水冲冼滤器； 11.用2.5 mL异丙醇冲冼滤器，保持冲冼时间尽可能短以减少
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操作程序
样品量如下：
> 成品为13g样品 > 中间体样品为31g > 如果样品很难过滤，多不可计（TNTC）或者
有大量异物存在，则将样品稀释10倍后过滤。
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问题分析
> 注意对细胞的精确计数？ > 检查光源是否打开？ > 检查光线是否有偏离？ > 视野光线是否均匀或者过亮？ > 细胞是否形态明显且清晰？ > 膜上是否有浸油？ > 所用的水是否有污染？ > 滤膜表面是否有染色剂存在？ > 可见光灯是否打开？ > 视野的焦距是否正确？ > 形态是规则的还是不规则的？
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DME简介
> 直接显微镜计数法（DME）是一种通过过滤糖浆中 的酵母、细菌、藻类、真菌及其他一些可染色的 微小物质，快速检测细胞数目的微生物学方法。
> 利用荧光染色剂吖啶橙及紫外显微镜可对细胞进 行快速鉴定。
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霉菌，细菌和酵母菌
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异物多时的照片
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DME 取样表
细菌
每天
bacteria
正在出料的糖化产品
223696
转鼓泵出口滤液(P6511)
122016
葡萄糖碳柱供料罐(TK6517) 20336
葡萄糖检查过滤供料罐(TK6519) 6232
葡萄糖离交供料罐(TK6520) 1968
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DME检测频率
DME Schedule
Daily SACC Oldest Drum Filter filtrate DX CC Feed Tank DX Check Filter Feed Tank DX IX Feed Tank DX Evaporator Feed Tank ISO pH Trim Tank FX CC Feed Tank FX Check Filter Feed Tank FX IX Feed Tank FX Evaporator Feed Tank 42 buffer tank ADSEP water ADSEP Feed ADSEP product ADSEP by product 90 buffer tank MB Feed Tank 55 Evaporator Feed Tank Cuno In (1/4hours) Cuno Out-2 (1/4hours) 55 Evaporator Out (1/4hours) Sweet Water Process Water condensate water
14.在蓝光激活下用4OX物镜观察载玻片。在深色背景下微生物的 荧光显色为桔色或绿色。局部的有机物残渣也发出荧光，但酵 母菌、霉菌菌丝及细菌细胞也能够由它们的组织特性及染色特 性被认出,见附图；
15.取20个视野进行计数时，视野间不可重叠，否则可能会使计 数过大；
16.结果=平均视野数*82 (cfu/ml)
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> 本方法可以对淀粉糖浆中活菌/死菌微生物污染进 行准确计数(本方法适用于所有玉米湿磨工业生产 的糖品)
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设备
1.Olympus或相同类型的显微镜 2.反射荧光装置 3.带有玻璃支架的玻璃过滤容器(25 mm) 4.带有3/8″小孔的8#塞。TS NO.30578 5.GelmanSciences过滤仪＃15402 6.真空软管 7.NucleporeФ 25mm聚碳酸酯滤膜，滤膜孔径0.8微米
> 滤器面积＝（直径/2）2*3.14＝（15.6/2） 2*3.14=191.038
> 显微镜的视野面积和滤器的面积一旦确定，滤器面积的视 野数量按下式计算：
> 视野数＝滤器面积/视野面积=191.038/0.233=819.90 > 计算1ml的视野数/ml＝总滤器面积的视野数/样品的毫升
数=819.90/10=82
many 绿色大块杂质 many 绿色大块杂质 many 绿色大块杂质 moderate moderate few few few few few few few few few few few few few few few few few few few few
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Q&A?
葡萄糖蒸发供料罐(TK6548) 2132
异构pH调节罐(TK6527)
2460
果糖碳柱供料罐(TK6531)
2296
果糖检查过滤供料罐(TK6007) 2378
果糖离交供料罐(TK6532)
2460
果糖蒸发供料罐(TK6549)
2542
42 缓存罐
2050
色谱洗水
410
色谱供料
2706
色谱产品
1968
酵母菌
yeast
114390 104222 10168
328 164
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 82 0 0
霉菌
mold
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
异物*
备注
debris* comments
色谱副产品
1968
90缓存罐(TK6547)
1886
混床供料罐(TK6552)
2460
55蒸发供料罐(TK6546)
2214
Cuno进（1/4小时）
2706
Cuno出口（1/4小时）
238
55蒸发出口（1/4小时）
246
甜水(TK6511)
1640
工艺水(TK6510)
328
冷凝水（TK6013）
410
污染的可能性，这点很重要； 12.在开真空的状态下移去过滤容器并用镊子取下滤膜片，这
有助于干燥滤膜，与空气接触片刻后，滤膜就应刻干燥了；
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操作程序
13.滴一小滴浸油在干净的载玻片上，将滤膜光面向上平铺在浸 油上，在滤膜上面加一滴油，放上盖玻片轻轻压下滑动使之均 匀；
水 13.吖啶橙细菌染色剂250ml,Difco3336-75-9 14.异丙醇100%
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操作程序
1.确认过滤容器及其支架是干净的； 2.安装过滤装置，滤膜光面朝上； 3.向样品中(成品为13g样品;中间体样品为31g)加入60
> 视野面积＝［（直径/2）2］*3.14＝［（0.545/2）2］ *3.14=0.233
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计数程序
> 计算Millipore滤膜的面积。尽管滤器的直径是15.6mm， 但过滤使用的不是滤器的总面积。有水和一滴染色剂结合 的50ml样品应该被过滤。可以测量有染色剂存留的滤器的 面积。滤器直径一旦被测量，滤器的面积便可由下式计算：
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