磷酸化蛋白的western blot
做磷酸化蛋白的westernblot如何事半功倍？
做磷酸化蛋白的westernblot如何事半功倍？本人的研究生实验被western blot承包了，尤其是做磷酸化蛋白上摸爬滚打了这么多年，所以总结下自己的经验，希望能助同道中人一臂之力，少走点弯路，早日出结果发paper, 迎娶白富美，走向人生巅峰那首先先思考几个问题，什么是蛋白质磷酸化？在哪些位点发生蛋白质的磷酸化呢？发生磷酸化有什么作用呢？下面我们来一一揭晓蛋白质磷酸化的神奇面纱：Q1: 什么是蛋白质磷酸化呢？蛋白质磷酸化是在蛋白质激酶催化下，把ATP的磷酸基转移到其他蛋白质氨基酸残基。
Q2: 什么是蛋白质的去磷酸化呢？上述磷酸化的蛋白在蛋白磷酸酶的作用下去磷酸化，这个过程是可逆的图所示Q3: 蛋白质磷酸化主要发生的氨基酸残基是谁呢？蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上，一种是丝氨酸(包括苏氨酸)，另一种是酪氨酸Q4: 蛋白质磷酸化的作用？蛋白质磷酸化是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。
好啦，知道蛋白质磷酸化是怎么一回事，那通过什么手段检测蛋白质是否磷酸化以及磷酸化水平呢？那常用到的方法就是western blot啦，有人会说western blot还不好做吗？那可是研究生的技能标配，但是磷酸化蛋白的western blot就不能小看了，多少人在这里摸爬滚打，绞尽脑汁。
好了下面重点来了，赶紧搬个小板凳认真学起来。
收蛋白样：1、收蛋白样一定冰上操作，动作要快，防止磷酸化蛋白的降解；2、蛋白裂解液配置：蛋白裂解液RAPI：蛋白酶抑制剂PMSF=100:1, 因为蛋白裂解液RAPI中含有NaF（抑制酸性磷酸酶），所以不加磷酸酶抑制剂也是可以跑出很漂亮的条带;3、如果自己配置的蛋白裂解液不含磷酸酶抑制剂，为了防止磷酸化蛋白的降解，可根据需要另行添加磷酸酶抑制剂（氟化钠NaF：抑制酸性磷酸酶，使用浓度10mM; 正钒酸钠Na3VO4：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM；焦磷酸钠Na2P2O4：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM）；4、蛋白裂解后4℃离心后，最好立即加入loading buffer进行煮沸变性，也是防止磷酸酶降解磷酸蛋白。
wb检测磷酸化蛋白原理
wb检测磷酸化蛋白原理一、前言WB（Western Blot）是一种非常常用的蛋白质检测方法，其原理是利用特异性抗体与目标蛋白发生特异性反应，然后通过化学方法对反应产物进行可视化检测。
磷酸化是细胞信号转导中非常重要的一种修饰方式，因此WB检测磷酸化蛋白也成为了很多研究者的关注点。
二、WB检测磷酸化蛋白原理1. 磷酸化的基本原理在细胞内，磷酸化是一种非常重要的后转录后修饰方式。
它可以通过激活或抑制某些蛋白质的功能来调节细胞代谢、增殖、分化等生物学过程。
在细胞内，磷酸化通常由激酶催化，而去磷酸化则由磷酸酶催化。
因此，在WB检测中，我们通常会使用特异性抗体来检测目标蛋白是否被磷酸化。
2. WB检测的基本流程WB检测通常包括以下几个步骤：样品制备、SDS-PAGE电泳、转膜、阻断、一抗孵育、二抗孵育和可视化。
其中，样品制备和SDS-PAGE电泳的步骤与普通WB检测并无区别，这里不再赘述。
在转膜后，我们需要对膜进行阻断处理，以避免非特异性结合。
常用的阻断方法包括使用5%的非脂奶粉或3%的BSA（Bovine Serum Albumin）。
接下来，我们需要用一抗孵育膜上的目标蛋白。
一般情况下，我们会选择特异性抗体来进行磷酸化位点检测。
在一抗孵育后，我们需要对膜进行洗涤以去除未结合的一抗。
之后，我们再用二抗与一抗结合，并通过化学方法对反应产物进行可视化。
3. 磷酸化位点检测磷酸化位点检测是WB检测磷酸化蛋白的核心步骤之一。
目前常用的磷酸化位点检测方法主要有三种：Phos-tag SDS-PAGE、Pro-Q Diamond染色和Anti-phosphoamino acid抗体。
（1）Phos-tag SDS-PAGEPhos-tag SDS-PAGE是一种基于Phos-tag的SDS-PAGE电泳技术。
Phos-tag是一种含有多个磷酸酯结合位点的配体，可以选择性地捕获磷酸化蛋白。
在Phos-tag SDS-PAGE电泳中，我们会将Phos-tag添加到聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行电泳分离。
免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白
免疫印迹怎么测定磷酸化的蛋白免疫印迹（Western blot，WB）是利用抗原抗体特异性结合的原理，基于SDS-PAGE凝胶电泳进行蛋白质分离、纯化以及相互作用研究的技术，也是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法。
蛋白印迹技术先利用SDS-PAGE分离蛋白质样品，随后将电泳条带转移到固相载体膜上（如PVDF或尼龙膜），再利用磷酸化特异的抗体（一抗）来鉴定目的蛋白，能与磷酸化特异抗体结合的蛋白质即为磷酸化蛋白，最后通过标记的二抗识别一抗可以指示一抗的位置，即是待研究的磷酸化蛋白质的位置。
免疫印迹法不适用放射性32P标记，避免了使用放射性同位素时的危险品和废物处理。
此外，磷酸化抗体的灵敏性较强，可以轻松的检测常规细胞提取物中的磷酸化蛋白，对样品的用量要求不算严格。
WB除了能定性检测磷酸化蛋白外，还能一定程度上评估磷酸化蛋白质的水平，由于受到不同实验处理和凝集上样误差的影响，通常先用一个抗体来检测同源蛋白的总水平(而不考虑磷酸化状态)，以确定磷酸化组分相对于总组分的比例，并充当上样内对照。
百泰派克生物科技拥有纯熟的免疫印迹技术，专业的技术分析团队，为您提供一站式磷酸化蛋白免疫印迹鉴定服务，可以根据您的需求定制实验，并对可能影响结果的潜在因素进行评估。
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相关服务：Far-Western Blot分析。
翻译后修饰蛋白组分析。
磷酸化定量蛋白组学研究。
免疫共沉淀法（CO-IP）结合质谱联用的蛋白互作分析。
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蛋白磷酸化实验方法
蛋白磷酸化实验方法蛋白磷酸化实验方法主要包括以下几种：1. Western blot：这是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上(通常是PVDF或尼龙膜)，之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。
2. 放射性标记法：先用32P标记ATP，通过细胞代谢标记到磷酸化蛋白质上，再经一维或二维凝胶电泳或色谱法进行分离，最后通过放射自显影进行检测。
3. 免疫印迹法：基于抗体特异性结合抗原的原理，利用抗磷酸化氨基酸抗体与电泳分离得到的磷酸化蛋白质进行免疫印迹反应来检测磷酸化蛋白质。
在实验中，通常将免疫印迹与免疫沉淀结合使用，因为磷酸化蛋白质的含量较低，先利用免疫沉淀法对磷酸化蛋白质进行富集，可以降低非磷酸化蛋白质的干扰。
4. 荧光染色法：利用荧光染料直接对凝胶中结合在酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上的磷酸进行选择性染色，再通过荧光扫描仪检测就能直接鉴别出磷酸化的蛋白质。
5. 质谱法：首先将含磷酸化修饰的蛋白样品进行酶切，然后对酸化肽段进行富集，再将富集得到的磷酸化肽段进行串联质谱分析，最后利用质谱数据结合生物信息学分析对磷酸化蛋白质进行鉴定。
6. ELISA：ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法。
这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。
随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品(如细胞裂解液)中的一个组分。
加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。
这些分析通常设计为显色或荧光检测。
产生的信号强度与最初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。
与更为传统的免疫印迹相比，磷酸化特异的ELISA技术具有一些优点。
首先，利用经过校准的标准品，可轻松定量结果。
其次，以三明治形式使用目的蛋白特异的两个抗体，带来了高的特异性。
第三，ELISA的灵敏度更高允许使用更少量样品，检测低丰度的蛋白。
最后，微孔板形式的通量比传统的Western blotting要高得多。
蛋白质印迹法westernblot应用介绍
定量Western Blot技术
定量Western Blot技术能够准确定量蛋白质的表达水平，为比较不同样品之间的蛋白质表达差异提供 了可靠的工具。
该技术采用了同位素标记、荧光染料标记等方法，通过与标准品进行比较，计算出蛋白质的相对表达量。
该技术的应用范围广泛，包括药物靶点筛选、疾病标志物 发现、蛋白质相互作用研究等领域。
Western Blot与其他蛋白质分析技术的联用
Western Blot可以与其他蛋白质分析技术联用，如质 谱技术、免疫共沉淀等，以获得更全面的蛋白质信息。
通过将Western Blot与质谱技术联用，可以获得蛋白 质的氨基酸序列和修饰信息，有助于深入了解蛋白质
缺点
操作繁琐、耗时长、成本较高、对实验条件和操作技能要求较高。
02 Western Blot在科研中 的应用
验证抗体特异性
抗体特异性验证
通过Western Blot，可以验证抗体的 特异性，确保抗体只针对目标蛋白进 行反应，而不与其他非目标蛋白发生 交叉反应。
抗体稀释度测试
通过Western Blot，可以测试抗体的最 佳稀释度，以获得最佳的检测效果。
定量Western Blot技术的应用范围广泛，包括生物标志物发现、药物作用机制研究、疾病发病机制研究 等领域。
蛋白质组学与Western Blot的结合应用
蛋白质组学与Western Blot的结合应用能够实现大规模蛋 白质组学研究与特异性蛋白质检测的有机结合。
通过将Western Blot技术与蛋白质组学技术相结合，可以 同时获得蛋白质的特异性和丰度信息，为深入了解蛋白质 的功能和作用机制提供有力支持。
WB检测磷酸化蛋白
百泰派克生物科技
WB检测磷酸化蛋白
蛋白印迹（Western Blot，WB）是基于免疫学原理的一种蛋白质分析技术，常用于检测组织匀浆提取物中特定蛋白质的存在、大小、含量以及相互作用等。
WB已广泛用于蛋白质-DNA相互作用、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质翻译后修饰等分析。
WB同样可以检测特定样品中磷酸化蛋白的存在、含量以及大小等，只是需要选择能特异识别磷酸化蛋白的一抗。
其基本原理是通过一级抗体识别并结合经电泳分离并转移到PV膜上的磷酸化蛋白，再利用二级抗体特异识别一级抗体，形成磷酸化蛋白-一抗-二抗复合体，二抗可以通过染色和免疫荧光等技术进行检测，从而间接检测到磷酸化蛋白。
百泰派克生物科技基于蛋白印迹WB以及Thermo公司最新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供快速准确的磷酸化蛋白质分析服务技术包裹，包括磷酸化蛋白质定性定量鉴定等，还可根据需求提供其他定制化检测方案，欢迎免费咨询。
磷酸化wb灰度值
磷酸化wb灰度值磷酸化WB灰度值是一种常用的分析方法，用于研究蛋白质的磷酸化状态。
磷酸化是一种重要的蛋白质修饰方式，能够调控蛋白质的结构和功能。
通过测量蛋白质磷酸化水平的变化，可以揭示其在细胞信号转导、代谢调控和疾病发生发展中的作用。
磷酸化WB灰度值是通过Western blotting（简称WB）技术来测量蛋白质磷酸化水平的一种方法。
WB是一种常用的蛋白质分析方法，可以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
通过WB技术，可以将蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并通过特异性抗体进行检测。
磷酸化WB灰度值则是通过将目标蛋白质的磷酸化状态与非磷酸化状态进行比较，利用灰度值来反映磷酸化水平的变化。
在进行磷酸化WB实验时，首先需要提取细胞或组织中的蛋白质，并进行电泳分离。
然后，将蛋白质转移到膜上，并进行特异性抗体的孵育。
特异性抗体将与目标蛋白质结合，并形成免疫复合物。
接下来，使用辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的二抗进行检测。
最后，使用化学发光或染色法来可视化目标蛋白质，并通过成像仪或胶片进行记录。
磷酸化WB灰度值是通过分析成像结果得到的。
成像结果可以定量化为灰度值，灰度值越高表示蛋白质的表达水平越高。
在磷酸化WB实验中，我们通常会比较磷酸化状态和非磷酸化状态的灰度值差异。
如果磷酸化状态的灰度值明显高于非磷酸化状态，说明目标蛋白质在该细胞或组织中存在磷酸化修饰。
磷酸化WB灰度值的分析可以提供重要的研究信息。
首先，它可以帮助我们了解蛋白质的磷酸化调控机制。
磷酸化是一种常见的蛋白质修饰方式，参与多种细胞信号传导通路的调控。
通过比较不同条件下的磷酸化WB灰度值，我们可以了解磷酸化的动态变化，揭示蛋白质在信号通路中的作用。
磷酸化WB灰度值的分析可以帮助我们研究疾病的发生和发展。
磷酸化异常与多种疾病的发生有关，如癌症、神经系统疾病等。
通过比较疾病组织与正常组织的磷酸化WB灰度值，我们可以发现与疾病相关的蛋白质磷酸化异常，为疾病诊断和治疗提供新的靶点。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
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磷酸化蛋白的western blot
我做了很久的western blot，尤其是phospho-抗体，可以算是达人了。
我根据自己的经验，对磷酸化蛋白之western blot提出以下建议，供刚入门的同仁参考：
1.一定要在lysis buffer中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使band压出来也会很浅，结果也不可信。
2.加一抗后最好4度过夜，保证抗体有充分的结合时间。
因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。
4度也可使一抗重复使用多次。
毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。
二抗则室温1小时即可。
3.磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。
个人认为，Cell signaling公司做的磷酸化抗体不错，尤其是MAPKs磷酸化抗体。
3.最好根据厂商的protocol来操作实验，这是实验成功的保证。
如Cell signaling会建议用含5%BSA的TBST稀释phospho-p38等抗体，效果不错，而不是用常见的含5%non-fat milk 的TBST。
4.抗体的稀释倍数也要适当。
不同厂商也会有不同要求。
5.研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。
如压完phospho-p38抗体后，我会把相同的membrane做strip后再压p38,然后再strip一次，再压内标actin。