单抗制备小鼠免疫SOP
小鼠单克隆抗体制备流程
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单克隆抗体制备技术
单克隆抗体制备技术单克隆抗体制备标准化操作方案（McAb—sop）第一章：小鼠免疫第二章：细胞融合第三章: 细胞建株第四章：细胞株鉴定第五章：腹水制备第六章：抗体纯化和鉴定(略）第一章. 小鼠免疫（BALB/c）小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证.一.小鼠免疫分两程方案：根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下:1.短程免疫方案:第一次: 1d 100ug（可溶性Ag)+等体积完全佐剂。
腹腔注射。
0.4ml/只第二次: 7d 100ug+等体积不完全佐剂腹腔注射。
0.4ml/只第三次: 12d 50ug IV 0.3ml/只(强化）第四次：15d 20ug IV 0。
3ml/只第17 d~24d内融合2长程免疫方案:第一次: 1d 100ug+等体积完全佐剂腹腔注射（IP）0。
4ml/只第二次: 14d 100ug+等体积不完全佐剂IP 0。
4ml/只第三次：21d 100ug IP或IV 0.4ml/只第四次: 25d 50ug IV 0.3ml/只(强化）第五次: 28d 20ug IV 0.3ml/只第30d~37d内融合。
注意:a。
在融合前(即加强免疫前)必须测定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必须≥1:8000,长程免疫≥1：32000,方可做融合。
b。
免疫周期完成后所有小鼠需在一周内做完融合. 否则不能保证融合质量.二．小鼠免疫质控标准1．免疫鼠血清滴度短程≥1:8000，长程≥1：32000；2．小鼠免疫后需在一周内做完融合；3．免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并且较粘连。
免疫鼠选择：免疫种类为：balb/c小鼠；性别。
雌性佳；大小:6—7周龄：体重：20g;健壮。
活泼。
第二章．细胞融合一．融合前准备1．脾细胞：取符合免疫质控标准的鼠在无菌条件下取出其脾脏,并制成单个脾细胞悬液,每只鼠的脾细胞约1～3亿.在制备过程中严格保证无菌。
制备脾细胞可选择研磨器+筛网或用无菌注射器吹吸。
单克隆抗体的制备方法
单克隆抗体的制备方法
单克隆抗体的制备方法主要包括以下几个步骤：
1. 免疫兔或小鼠：首先选择一个目标抗原，这可能是一种蛋白质、多肽或其他分子。
然后，将该抗原注射到实验动物（通常是免疫兔或小鼠）的体内，以刺激其免疫系统产生抗原特异性的抗体。
2. 細胞樹突瘤：在动物体内产生抗体后，从其体内提取淋巴细胞，通常是从脾脏或骨髓中获得。
然后，将这些淋巴细胞融合到特定的癌细胞（如骨髓瘤细胞）中，形成融合细胞，称为淋巴瘤细胞。
3. 杂交瘤筛选：将淋巴瘤细胞培养在富含饲养基的培养皿中，使其成长为一种混合的细胞群。
然后，利用对抗体特异性的检测方法，如ELISA或流式细胞术，筛选出对目标抗原具有高亲和力和高特异性的单克隆抗体产生的杂交瘤细胞。
4. 单克隆抗体培养和纯化：将筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞进行扩增培养，并采用特定培养基和条件，如添加低髓酸和高髓酸补充物，以增加单克隆抗体的产量。
随后，通过离心、净化和纯化等步骤，从培养物中分离和纯化出单克隆抗体。
5. 验证和应用：对制备的单克隆抗体进行验证，包括测定其亲和力、特异性和功能等方面。
然后，将其应用于各种实验和临床研究领域，如免疫组织化学、免
疫印迹、流式细胞术和免疫疗法等。
需要注意的是，单克隆抗体的制备过程较为繁琐和耗时，并且存在一定的技术挑战。
因此，近年来还出现了许多其他方法来制备单克隆抗体，如基因工程技术和体外抗体筛选技术等，可以更快速和高效地得到目标单克隆抗体。
单抗制备小鼠免疫SOP
单抗制备免疫一、材料准备：弗式完全佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）实验动物：小鼠（Balb/c）雌性，8周以上,体重20g以上每种抗原蛋白免疫小鼠4只靶抗原：具有免疫原性的抗原或蛋白质、多肽，生理盐水抗原要求：抗原要尽量在无毒无刺激溶液中（PBS或生理盐水），纯度大于80%，浓度1mg/ml以上，总量大于2mg。
抗原尽量是可溶性抗原，溶液为PBS，如必需加入刺激物质，SDS浓度在0.5%以下，尿素在2M以下，不含咪唑，丙烯酰胺等变性剂，要求溶液澄清，无沉淀。
二、实验步骤1.抗原准备：每只小鼠按照100ug/100ul蛋白质或多肽置于生理盐水中制备成抗原。
2.抗原-佐剂的准备：将抗原液与佐剂混合制成乳状液，抗原与佐剂混合按照1：1比例进行，加入搅拌子后于4度搅拌过夜。
注射量为200ul 每只小鼠，抗原量为100ug。
第一次免疫使用弗氏完全佐剂，以后加强使用弗氏不完全佐剂，最后一次加强不加佐剂，免疫前采集阴性血做为对照，乳化因考虑损失，多计算两只小鼠的量。
乳化完全判断标准：挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否稳定，如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。
将乳状液移入1ml注射器。
3.小鼠免疫：将小鼠放在鼠笼上，拉住小鼠尾尖部，背部75%酒精消毒，针头15度角刺入小鼠皮下，挑起注射。
皮下注射共200ul，分5个点（背部皮下任意点）4.冲击免疫：如计划在免疫3d后进行细胞融合实验，则使用水相溶解的游离抗原进行直接脾脏免疫。
过程：将小鼠在固定架上固定，脾脏位置毛剪掉并消毒，快速分别剪开外皮和内皮，将脾脏拉出，吸取100ul/100ug抗原注入脾脏内，并快速用手术线分别缝合内皮和外皮。
5.小鼠阳性血清采集：尾部剪尾采血20ul，用生理盐水稀释10倍，离心收集上清。
6.效价检测：间接法检测小鼠多抗血清效价。
单抗的制备方案（很详尽）
单抗的制备方案首先制备抗原明白所做工作的目的，了解抗原的免疫原性和反应原性。
确定免疫方案既确定抗原的免疫特性是什么来根据此制定合适的小鼠免疫方案。
对于可溶性抗原和颗粒性抗原的方案有不同的免疫程序可以查阅文献或者做一些预实验。
免疫后取脾进行细胞融合细胞融合前的准备骨髓瘤细胞系的选择常用的为SP2/0细胞系饲养细胞的选择一般常用的为小鼠腹腔巨噬细胞细胞融合的步骤制备饲养细胞层暴露处理好的小鼠腹膜反复冲洗吸出冲洗液冲洗液离心加入小牛血清培养液混悬加入96孔板放入培养箱制备免疫脾细胞最后免疫小鼠后拉颈处死无菌取脾脏洗一次后研碎过不锈钢筛网离心细胞用培养液洗2次计数取108脾淋巴细胞悬液备用制备骨髓瘤细胞取对数生长的骨髓瘤细胞离心用培养液洗2次计数取x107细胞备用融合选择杂交瘤细胞及抗体检测HA T选择杂交瘤细胞抗体的检测根据抗原的性质抗体的类型不同选择不同的筛选方法。
常用的方法放免，ELISA，免疫荧光，间接血凝杂交瘤的克隆化抗体阳性孔的克隆化，检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体分泌的细胞所抑制。
克隆化的方法很多常用的是有限稀释法和软琼脂平板法杂交瘤细胞的冻存与复苏杂交瘤细胞的冻存细胞的复苏单克隆抗体的大量生产单克隆抗体的鉴定抗体特异性的鉴定，除用免疫原进行抗体的检测外还应该用于其抗原成分相关的其他抗原进行交叉实验。
McAb的ig类和亚类的鉴定分别用抗体的ig类型和ig亚类血清作双扩和夹心ELISA进行检测单抗中和活性的鉴定：用动物或细胞的保护实验来确定单抗的生物学活性。
单抗识别抗原表位的鉴定：用竞争结合实验测相加指数的方法测定单抗所识别抗原位点，赖确定单抗识别的表位是否相同。
单抗亲和力的鉴定用ELISA或RIA竞争结合实验来确定单抗与相应抗原结合的亲合力。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程一、免疫准备1）试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂2）常用免疫原：纯化蛋白、融合蛋白、多肽。
3）耗材：1ml、2ml注射器，橡胶管，1.5ml EP管，刀片（或毛细玻璃管），酒精棉球。
4）免疫动物：小鼠（BALB/c,雌性6-8周）5）乳化器（或者手动推）二、免疫过程1）免疫前取血取血方式：酒精棉擦拭尾部后（酒精多了伤口挤压出来的血液易分散），用锋利的刀片在小鼠尾部靠近静脉处划开小口，如下图箭头所示方向从上往下挤压血管，血从伤口处流出后用枪吸取放入EP管中（30ul血够用）离心取上清放冰箱备用。
此方法取血最为简单易行，避免眼球取血毛细管扎瞎老鼠眼睛。
注意点：①避免切断老鼠尾巴②切口劲量靠近尾末端，方便挤压血管③伤口消毒酒精不要太多，不利于伤口血液凝固。
2）免疫原制备：一支2ml注射器吸抗原，另一支注射器吸等量体积佐剂，橡胶管连接两支注射器来回推几下混匀，然后放乳化器上乳化（为防止蛋白变性，乳化器上可放置冰袋），大约来回推1500次左右可乳化完全（滴一小滴到静水中若不扩散说明乳化完全）。
换上1ml注射器针头免疫小鼠（2ml注射器免疫不好控制，可将乳化液转移到1ml注射器中免疫，但这样会损失部分抗原）。
注：①每只老鼠免疫蛋白量10-100ug,初次免疫参考量50ug蛋白/只，加强免疫及融合前冲击免疫25ug蛋白/只。
初次免疫使用弗氏完全佐剂，加强免疫使用弗氏不完全佐剂，融合前冲击免疫不使用佐剂可用缓冲液如PBS等稀释抗原（如果需要）。
②免疫量100ul-300ul/每只小鼠。
③多点免疫，一针不要打太多。
3）免疫方式和免疫时间根据免疫原决定免疫方式，皮下免疫和腹腔注射较为常见(纯化蛋白、融合蛋白多肽)。
皮下注射免疫，免疫时间间隔为2周，第三次免疫一周后（8-10d）采血测效价，决定是继续加强免疫还是冲击免疫后做融合。
较好的效价应该在10W以上，附表1 免疫接种时间表天数操作佐剂免疫方式0 初次免疫CFA 皮下14 第二次免疫IFA 皮下28 第三次免疫IFA 皮下36-38 收集血清测效价＿＿42 第四次免疫（如果需要）IFA 皮下50 收集血清测效价＿＿52 融合前冲击免疫＿腹腔55 收获脾细胞和融合＿＿注：如果第四面免疫血清效价仍然达不到要求可以继续加强免疫，如果免疫超过6次仍然达不到要求免疫基本失败。
单克隆抗体制备
单克隆抗体制备1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELI SA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
SOP-True Blot抗体
True blot多抗的制备抗体：小鼠IgG山羊抗小鼠IgGHRP-标记的抗山羊IgG抗体抗原性抗体（小鼠IgG）的变性：方案一1. 抗原性抗体溶液加入使终浓度为0.1％SDS， 2－巯基乙醇，沸水5分钟。
2. G－25脱盐柱除去2－巯基乙醇。
3. 置透析袋，对含有 M半胱氨酸的PBS缓冲液透析，4C过夜。
4. 非还原SDS-PAGE分析，检测氧化性抗体的含量。
5. 置透析袋对PBS充分透析除去半胱氨酸。
方案二1．抗原性抗体溶液加入SMCC使终浓度与蛋白浓度比为1：5。
变性抗体与凝胶的连接：采用-NH2方法。
山羊抗小鼠抗体经凝胶吸附：1.抗小鼠抗体适量与凝胶室温下充分混合2小时。
2.装入P10柱，收集流穿液（目的成分）。
3.大量PBS淋洗凝胶后，以0.1M甘氨酸（PH 3.0）洗脱，根据紫外280nm吸收值收集洗脱的蛋白组分。
4.流穿液和洗脱液检测280/260nm吸收值计算蛋白浓度。
5.流穿液和洗脱液进行SDS-PAGE分析。
（必要时重复以上实验一次）目的抗体的印迹分析：1.小鼠IgG SDS-PAGE。
2.转膜至NC膜。
3.膜封闭后分别加入0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10ug/ml的经特异吸附的(目的抗体)和未经吸附的山羊抗小鼠IgG抗体。
4.洗膜后加入HRP－标记的抗山羊IgG抗体。
5.DAB显色。
6.比较同一浓度下两种抗体（经吸附和未经吸附）显色带的差异，确定未经吸附抗体显色而经吸附抗体未显色的浓度范围。
True blot单抗的制备动物：Balb/c小鼠、Lewis大鼠免疫剂量：200μg/次。
免疫容积：0.5ml/鼠/次。
免疫部位：背部皮下，多部位/次，末次采用腹腔或静脉注射（相同剂量免疫原但不含助剂）。
免疫方案：d0 第一次免疫注射，采用CFA。
d21 第二次免疫注射,采用IFA。
d35 尾静脉或眼眶静脉采血0.3－0.5ml，提取血清进行ELISA检测和/或Western blot。
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单抗制备免疫
一、材料准备：
弗式完全佐剂（complete Freunds adjuvant，CFA）
弗氏不完全佐剂（incomplete Freunds adjuvant，IFA）
实验动物：小鼠（Balb/c）雌性，8周以上,体重20g以上
每种抗原蛋白免疫小鼠4只
靶抗原：具有免疫原性的抗原或蛋白质、多肽，生理盐水
抗原要求：抗原要尽量在无毒无刺激溶液中（PBS或生理盐水），纯度大于80%，浓度1mg/ml以上，总量大于2mg。
抗原尽量是可溶性抗原，溶液为PBS，如必需加入刺激物质，SDS浓度在0.5%以下，尿素在2M以下，不含咪唑，丙烯酰胺等变性剂，要求溶液澄清，无沉淀。
二、实验步骤
1.抗原准备：每只小鼠按照100ug/100ul蛋白质或多肽置于生理盐水中制备成抗原。
2.抗原-佐剂的准备：将抗原液与佐剂混合制成乳状液，抗原与佐剂混合按照1：1比例进行，加入搅拌子后于4度搅拌过夜。
注射量为200ul 每只小鼠，抗原量为100ug。
第一次免疫使用弗氏完全佐剂，以后加强使用弗氏不完全佐剂，最后一次加强不加佐剂，免疫前采集阴性血做为对照，乳化因考虑损失，多计算两只小鼠的量。
乳化完全判断标准：挤出一滴乳状液滴于冷水表面以检测乳状液是否
稳定，如果液滴散开则继续混合操作直至稳定的乳状液形成。
将乳状液移入1ml注射器。
3.小鼠免疫：将小鼠放在鼠笼上，拉住小鼠尾尖部，背部75%酒精消毒，针头15度角刺入小鼠皮下，挑起注射。
皮下注射共200ul，分5个点（背部皮下任意点）
4.冲击免疫：如计划在免疫3d后进行细胞融合实验，则使用水相溶解的游离抗原进行直接脾脏免疫。
过程：将小鼠在固定架上固定，脾脏位置毛剪掉并消毒，快速分别剪开外皮和内皮，将脾脏拉出，吸取100ul/100ug抗原注入脾脏内，并快速用手术线分别缝合内皮和外皮。
5.小鼠阳性血清采集：尾部剪尾采血20ul，用生理盐水稀释10倍，离心收集上清。
6.效价检测：间接法检测小鼠多抗血清效价。
包被：抗原使用PBS缓冲液，浓度1ug/1ml,每孔加入100ul溶液，4度包被过夜
酶：羊抗鼠IGG-HRP，1：5K
样品：20%小牛血清的PBS梯度稀释。