人体肠道菌群定量技术研究进展
肠道菌群与免疫的研究进展
肠道菌群与免疫的研究进展
胡世莲，方向
中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）老年医学科安徽省老年医学研究所肿瘤免疫与营养治疗安徽省重点实验 室，合肥233041
［摘要］随着高通量测序技术的发展，越来越多的研究认为肠道菌群及其代谢产物可以通过多种途径调 节免疫系统，在维持宿主免疫稳态中发挥重要作用。肠道菌群可以直接或通过代谢产物间接参与消化系统、内 分泌系统、风湿系统及神经系统等多系统免疫性疾病的发生发展。因此探讨肠道菌群与免疫的关系，进一步 认识疾病，以及肠道菌群作为靶点的免疫治疗具有潜在意义。
2肠道菌群与免疫性疾病 随着高通量测序技术的发展，越来越多的证据
表明肠道菌群参与了多种疾病的发生发展，如炎症 性肠病、糖尿病、红斑狼疮及阿尔茨海默病等。肠道 菌群在机体的免疫调节中发挥了重要作用，菌群紊 乱可导致相关自身免疫性疾病的发生;研究认为肠 道菌群在消化、内分泌、风湿及神经等系统免疫相关 疾病的发生发展中有重要作用。 2.1肠道菌群与消化系统免疫性疾病关系肠道 早期免疫发育高度依赖肠道菌群,无菌小鼠免疫发 育不全，早期接触健康菌群对正常免疫建立以及预 防结肠炎至关重要。Zhop等帥］通过对临床病例研 究显示早期应用抗生素导致炎症性肠病的风险升 高。炎症性肠病是一种慢性非特异性的肠道炎症性 疾病，研究认为与异常免疫反应和肠道黏膜屏障减 弱有关飞］o炎症性肠病肠道菌群多样性普遍减少, 表现为有益细菌数量减少,病原体数量增加;提示肠 道菌群失调参与炎症性肠病的发病过程“4 ］ 0 Walujkar等［4 ］研究显示溃疡性结肠炎患者肠道菌 群的丰度和多样性均减低，异常的需氧菌和兼性厌 氧菌增多,绝对厌氧菌作用减弱;Proseerg等”9 ］研究 显示溃疡性结肠炎患者活动期与缓解期肠道菌群的 丰度与多样性也有明显的差异;而同样作为炎症性 肠病的克罗恩病肠道菌群紊乱比溃疡性结肠炎更为 严重口9 ］。Ivanpe等［0］将结肠炎小鼠的肠道菌群移 植到健康小鼠肠道内，在健康小鼠肠道诱发炎症,进 一步证实肠道菌群参与炎症性肠病的发病。尽管炎 症性肠病患者存在肠道菌群紊乱，仍不完全清楚是 早期炎症的影响导致肠道菌群紊乱，还是肠道菌群 紊乱出现在炎症之前。
人类肠道微生物组的研究现状和未来趋势
人类肠道微生物组的研究现状和未来趋势随着人类对肠道微生物群落的重视，人们对其研究的程度也越来越深入。
肠道微生物组是指包含大量微生物的生态系统，涵盖了1,000多种细菌属，其中包括成千上万的生物专门生存于人体肠道内。
这种结构与功能繁复的肠道微生物系统对人类的生理和病理状态有着深刻的影响，从而引起了越来越多的研究兴趣。
本篇文章将概述这一兴趣络绎不绝的领域的一些趋势和进展。
第一部分：肠道微生物组的健康重要性肠道微生物的双重性质有助于延伸研究的范围。
正常情况下，它是人体内的有益微生物。
它能够参与大量获益人体的活动。
比如在维生素和氨基酸的代谢演变中起到关键作用，消化食物，并保持肠道的黏膜完整，这些过程中只是体现了微生物对人体的好处。
微生物也可以利用自身的代谢特征，例如抗菌素的合成，并能对各种疾病的预防起到积极的作用。
当肠道微生物的平衡被破坏时，微生物就会成为道路提供细菌的侵略，从而引起疾病和不适感。
严重的紊乱症状可以包括脾气暴躁，抑郁心情，免疫感觉减弱，体重稳定不在采取，以及代谢难以调节。
长期的肠道微生物失调也被认为是某些自身免疫疾病的根本原因，例如肠道炎症性疾病、克罗恩病等疾病。
总之，肠道微生物组对人类健康和康复具有无可替代的作用，因此在很多不同的疾病方案和预防方法中探讨、了解肠道微生物群落都是至关重要的。
第二部分：目前的研究和进展在过去的几十年中，对肠道微生物组的研究从事者已经在对人类微生物和人体微生物生态系的性质、抑菌素和菌群以及菌群在各种疾病中的作用方面作出了重大贡献。
喜欢人口学归纳分析的研究者可以更好地了解肠道微生物组的组成和食物、公共健康项目以及循环模式对生态系统产生的影响。
通过比较不同群体的肠道微生物组，研究人员可以发现该微生物组的穿戴区是持久的，但它也容易受到外部刺激的影响，比如饮食、使用抗菌素等编写。
在人类微生物组方面还有着无限的潜力。
与此同时，最近发展出来的细菌基因编辑技术CRISPR/Cas9也被广泛用于研究菌群。
肠道菌群与人体疾病的研究进展
肠道菌群与人体疾病的研究进展[摘要]肠道菌群是人体肠道的正常微生物，参与了人体维生素及氨基酸的合成、糖及蛋白质的代谢、矿物的吸收等。
近年来，我们对肠道菌群在健康和疾病中的作用的了解显著增加。
其中，许多文章指出人体的健康不仅与自身的基因组有关, 还与肠道内环境微生物有密不可分的联系。
肠道菌群通过与宿主间的相互作用调控肠道稳态，肠道菌群失调是多种疾病的发病因素和诱因。
[关键词]肠道菌群；肠道疾病; 代谢性疾病;癌症;1.肠道菌群与肠道疾病1.1肠道菌群与肠易激肠易激综合征是一种功能性肠病，表现为反复发作的腹痛，与排便相关或伴随排便习惯改变。
肠道菌群失衡导致肠易激的主要机制包括：发酵食物导致气体的生成（在同样的标准饮食条件下，IBS 患者的排气总量明显高于正常人）、菌群易位致黏膜屏障遭到破坏、菌群与胆盐结合引起免疫炎症反应的激活、肠道细菌刺激影响胃肠动力、菌群失调可增加内脏敏感性【2】。
近年来，对于肠易激患者调节肠道菌群治疗方面也取得了不同程度的进展，其中包括：微生态制剂疗法【3】（目前临床最常用治疗 IBS 的微生态制剂有双歧杆菌、活性乳酸菌、肠球菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌等）、抗生素疗法（如：新霉素、利福昔明）、粪菌移植、三氧疗法、中药制剂治疗等。
1.2肠道菌群与炎症性肠病炎症性肠病是一种病因尚不十分明确的慢性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
临床研究显示，益生菌、粪菌移植对 IBD 患者临床症状及肠道炎症的缓解均具有一定疗效【3】，这证实了肠道菌群对于炎症性肠病的致病作用。
肠道菌群影响IBD的主要机制可能有：益生菌数量减少、致病菌数量增加肠道免疫平衡打破。
近期有一项研究表明，IBD的抗TNF抗体治疗中肠道微生物生态系统与TNF拮抗剂的治疗效果之间存在功能性关联，并且抗TNF治疗能恢复IBD患者的代谢产物交换作用。
2.肠道菌群与代谢性疾病2.1肠道菌群与非酒精性脂肪NAFLD中涉及肠道菌群的病理机制（1）GM生态失调、细菌异味、导致肝脏脂质摄取增加的TLR4活化、脂质生成及炎症增强。
肠道菌群与人体健康的研究进展
Advances in Clinical Medicine 临床医学进展, 2021, 11(5), 2221-2227Published Online May 2021 in Hans. /journal/acmhttps:///10.12677/acm.2021.115319肠道菌群与人体健康的研究进展杨丽萍1，马臻棋2*，王学红2，马文霞1，李惠11青海大学研究生院，青海西宁2青海大学附属医院消化内科，青海西宁收稿日期：2021年4月21日；录用日期：2021年5月7日；发布日期：2021年5月25日摘要肠道菌群是在人体消化系统中蕴藏着的数万亿的微生物，其形成和增殖受多种因素的影响。
近年来，随着宏基因组学研究的深入，人们对肠道菌群及其潜在作用的认识也日益加深。
大量研究表明肠道菌群对人体健康有着很重要的作用，但当肠道菌群紊乱时可以改变肠道的通透性、消化和代谢以及免疫应答等，从而导致许多疾病的发生，本文阐明了影响肠道菌群的因素，并探讨了肠道菌群紊乱与人体健康、疾病之间的关系。
关键词肠道菌群，影响因素，人体健康，疾病Research Progress of Intestinal Floraand HealthLiping Yang1, Zhenqi Ma2*, Xuehong Wang2, Wenxia Ma1, Hui Li11Graduate School of Qinghai University, Xining Qinghai2Department of Gastroenterology, Qinghai University Affiliated Hospital, Xining QinghaiReceived: Apr. 21st, 2021; accepted: May 7th, 2021; published: May 25th, 2021AbstractIntestinal flora is a kind of trillions of microorganisms in human digestive system, whose forma-tion and proliferation are affected by many factors. In recent years, with the development of me-*通讯作者。
人类肠道菌群的研究进展
人类肠道菌群的研究进展肠道菌群，即肠道微生物，它是人类体内最为庞大的微生物群落之一，有着非常重要的生理和代谢功能。
正常人体内大约有100万亿（10^14）个微生物，其中包括数千种不同的细菌、真菌、病毒和寄生虫。
这些微生物主要分布在人体的肠道、皮肤、口腔、泌尿系统等部位。
在这些细菌中，大多数是有益的，并对人体的生理、代谢、营养吸收等多个方面发挥着关键作用。
人类肠道菌群的研究历程可以追溯到20世纪初期。
起初，人们只是对一些肠道细菌的分类、数量和分布进行了一些简单研究。
随着科技进步和技术手段更新，对肠道菌群的研究也迎来了突破性的发展。
下面就来介绍一下肠道菌群研究的最新进展。
一、微生物群落组成和多样性分析随着新一代测序技术的进一步发展，越来越多的研究发现人类肠道菌群的组成和多样性与健康状态密切相关。
例如，有些研究表明，肠道微生物的多样性与人体免疫系统的稳定性有着密切的关系，并可以预测肠道疾病的发生和发展。
近年来，越来越多的科学家和医生开始意识到人体与微生物群落之间的相互作用，并提出了以肠道菌群为重点研究的整体健康观念。
二、肠道菌群对人体代谢的影响人类肠道菌群的组成及数量可以影响人体内多种代谢反应的进行。
例如，有研究表明肠道细菌可以促进人体吸收微量元素和维生素、调节血糖、脂肪和蛋白质的代谢等。
肠道菌群也可以产生多种有益物质，如丁酸、丙酸等，这些物质对维护肠道健康和整体代谢有着重要的作用。
三、肠道菌群与多种疾病的关系肠道菌群与多种人类疾病的关系已经成为当前研究的热点。
一些研究表明，慢性肠道疾病、肥胖、糖尿病、心血管疾病等都与肠道微生物群落的异常有关。
这些研究的发现为疾病的预防、诊断和治疗带来了新的思路。
四、肠道微生物的功能分析人类肠道微生物可以为人体提供许多生理和代谢上的帮助。
例如，一些能够在人体内产生叶酸和维生素K的肠道细菌，可以帮助人体维持血液凝固机制的稳定性。
此外，肠道细菌还能够分解多种不易被人体消化的食物成分。
2024肠道菌群在强迫症治疗中的研究进展(完整版)
2024肠道菌群在强迫症治疗中的研究进展（完整版）摘要强迫症是—种病因未明的致残性精神障碍，其发生发展过程与肠道菌群的关联尚未被完全阐明。
虽然强迫症的确切发病机制尚不清楚，但现有证据表明脑肠轴通过免疫炎症、神经递质及内分泌等多条通路参与强迫症的发生发展。
本文综述了肠道微生物群参与强迫症病理生理学的新证据及其作为新的治疗手段的潜力，同时总结了目前脑肠轴研究的主要研究方法和不足。
探讨了益生菌和粪便移植等微生物重组策略在强迫症治疗中的潜力和挑战，并对未来的研究方向进行了展望，期待通过对脑肠轴的深入研究能够为强迫症的防治提供新的靶点和方向。
强迫症是—种以反复持久出现的强迫观念(obsession)和（或）强迫行为(compulsion)为基本特征的病因未明的精神疾病［1]。
世界卫生组织将强迫症定位为世界十大致残性疾病之—[2 ]。
据统计，强迫症的终生患病率为0.8%~3%[ 3 ] ，其发病呈双峰分布，第—个高峰在青春期前（平均年龄三11岁），第二个高峰在成年早期（平均年龄22~24岁1有关强迫症病理生理学机制的研究—直是精神卫生领域的焦点问题，学者们从神经解剖、神经生化、神经心理、免疫及基因遗传学等多学科角度开展了系列研究，但仍未达成普遍共识。
同时，由千已有的药理机制治疗—直处千较低的治疗反应率，因此可能还有其他的病因途径有待探索。
随着测序技术的进步，“微生物－肠道－大脑轴',(microbiota-gut-brain, MGB)轴逐渐成为各个领域的研究热点，有研究发现肠道菌群参与了自闭症、精神分裂症、情感障碍、帕金森病等疾病的发生发展。
但关千MGB与强迫症的研究，目前还处于起步阶段。
本文综述了肠道菌群参与强迫症病理生理机制的新证据和研究手段，并探讨其作为潜在靶点在新治疗方法中的作用，旨在为强迫症发病机制的研究和诊疗手段的选择提供新思路。
—、“微生物报5道－大脑＂轴肠道菌群是人类胃肠道中微生物的集合体，它在调节肠脑轴方面的作用似乎与心理健康密切相关。
肠道菌群与人类健康研究进展
肠道菌群与人类健康研究进展肠道菌群是生活在人体肠道内的微生物群落，与人体健康有着密切的。
近年来，随着微生物组学研究的深入，肠道菌群在人类健康中的作用逐渐受到重视。
本文将概述肠道菌群的概念、历史及其在人类健康中的重要性，并探讨近年来相关领域的研究进展及未来研究方向。
肠道菌群是由多种微生物组成的复杂生态系统，这些微生物通过与人体之间的相互作用，对人体的消化、代谢、免疫等方面产生影响。
早在20世纪初，科学家们就开始研究肠道菌群与人类健康的关系。
随着科学技术的不断发展，人们对肠道菌群的认识逐渐深入，肠道菌群在维护人体健康方面的作用也越来越受到。
肠道菌群通过影响人体的消化、代谢、免疫等方面，对人类健康产生影响。
研究表明，肠道菌群失调与多种疾病的发生密切相关，如肥胖、糖尿病、炎症性肠病等。
通过对比不同疾病患者与健康人的肠道菌群，科学家们发现疾病患者的肠道菌群多样性减少，有害菌增多，有益菌减少。
肠道菌群的调节机制主要包括遗传、环境、饮食等因素。
近年来，研究发现肠道菌群受到宿主代谢的影响，而肠道菌群也可以通过影响宿主代谢来调节人体健康。
例如，益生菌可以通过调节肠道屏障功能、影响脂肪和糖代谢、增强免疫功能等方式来改善人体健康状况。
益生菌是指对宿主有益的肠道微生物，如双歧杆菌、乳酸菌等。
研究表明，益生菌可以通过调节肠道菌群、增强免疫力等方式来改善人体健康状况。
益生菌还可以缓解抗生素使用引起的肠道菌群失调，减少抗生素相关腹泻等不良反应。
肠道菌群与人类健康之间的关系研究已经取得了一定的进展，但仍存在许多问题和争议。
不同研究之间存在差异，部分研究结果可能受到研究方法、样本选择等因素的影响。
肠道菌群与疾病之间的因果关系仍需进一步探讨，部分研究发现可能仅仅是相关性而非因果性。
益生菌的应用方面也存在一些问题，如益生菌种类和剂量的选择、益生菌的安全性等。
为了进一步深入探讨肠道菌群与人类健康之间的关系，未来的研究方向包括：进一步探讨肠道菌群的作用机制，特别是肠道菌群如何影响人体代谢、免疫等方面的研究；加强肠道菌群与常见疾病发生发展之间关系的研究，为疾病的预防和治疗提供新的思路；开展大规模、多中心的临床研究，以验证益生菌在改善人体健康方面的效果；研究不同人群肠道菌群的差异，为个体化营养和健康管理提供依据；益生菌的安全性及其对肠道微生态的长期影响，为益生菌产品的研发和应用提供科学支持。
使用生物大数据技术研究肠道菌群的技巧与方法
使用生物大数据技术研究肠道菌群的技巧与方法在近年来，随着生物大数据技术的发展和应用，研究人员们开始运用这一技术来探索肠道菌群的复杂生态系统。
肠道菌群是人类肠道中的微生物群落，包括细菌、真菌、病毒等多种微生物。
它与宿主的健康密切相关，并在多种疾病的发生和发展过程中发挥重要作用。
本文将介绍使用生物大数据技术研究肠道菌群的一些常用技巧和方法。
首先，研究肠道菌群的第一步是采集样本。
肠道菌群的研究样本通常包括粪便、肠粘膜组织、粪便样本较为常用，因为它们易于采集和处理，且能够代表整个肠道菌群的情况。
对于小鼠等实验动物样本，还可以通过剖腹手术获取肠道组织样本。
采集样本时应尽量避免污染，使用无菌器皿和工具，以确保样本的纯净性。
其次，对采集的样本进行DNA提取是分析肠道菌群的关键环节。
DNA提取的方法可以根据样本性质进行选择，常用的方法包括基于细胞壁的裂解方法、宏基因组提取方法等。
DNA提取过程中注意保持无菌操作，避免污染，确保获取到高质量的DNA样本。
接下来，利用生物大数据技术进行肠道菌群的分析与研究。
生物大数据技术包括16S rRNA测序（代表性的方法为高通量测序），以及宏基因组测序方法。
16S rRNA测序可用于分析菌群的组成与结构，通过对16S rRNA基因序列的测定，可以区分不同的菌属、菌种，并进行物种多样性和群落结构的分析。
宏基因组测序可以更全面地了解菌群的功能特征，包括其代谢能力、抗药性等。
这两种方法可以相互补充，提供对肠道菌群的详细描述。
在分析过程中，通常使用生物信息学软件进行数据处理与分析。
例如，可以使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）或mothur等软件进行菌群的OTU（操作分类单位）分析，得到菌群丰度和多样性等信息。
此外，还可以使用PICRUSt（Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）等工具进行功能预测，从而了解菌群在代谢和功能方面的潜在作用。
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人体肠道菌群定量技术研究进展姜美娟，梁冰(中国人民解放军第401医院检验科，青岛266071)摘要在传统微生物学研究中，人们只重视致病菌的作用，而没有重视正常菌群的作用。
通过对肠道菌群的分布特点和生理功能的了解，我们认识到肠道菌群的微生态平衡与人的健康及疾病的密切关系系，针对传统培养方法存在的问题，国内外专家先后开展了分子生物学方法的研究和生物学评价工作。
本文结合本课题组的研究，对各种技术的特点及存在的不足进行了全面的论述。
关键词肠道菌群;定量技术;进展中图分类号:R445.6文献标识码:B doi:10.3969/j.issn.2095－1434.2011.03.013正常菌群在人体内分布很广，其中以肠道菌群最具有代表性。
对健康人的粪便标本研究已知，肠道内栖息着大约400 500种微生物，其中包括细菌、真菌和病毒等。
这些微生物的总质量约为1kg，其体积相当于1个人的肝脏，其数量为1014个，是人体自身细胞总数的10 20倍［1］。
在常见的十几种细菌中，绝大多数为专性厌氧菌，约占99%以上，包括双歧杆菌、乳杆菌、优杆菌、拟杆菌、消化链球菌等，也有少量的兼性厌氧菌、专性需氧菌和微需氧菌，如肠杆菌属细菌、肠球菌、葡萄球菌、酵母样菌等。
它们构成了人体胃肠道的生物学屏障。
肠道正常菌群与宿主、菌群中各种微生物之间相互依存，相互协调，处于动态平衡。
大量研究表明，肠道正常菌群对宿主具有消化、吸收、营养、生物拮抗等生理作用，实际上已成为宿主生命的必需的组成部分。
当这些正常的微生物群落受宿主及外环境影响，其种群数和菌量、活性发生了异常或定位转移时，这些群落中就容易容纳外籍菌，原先的平衡遭到破坏，出现菌群失调。
在人体抵抗力降低的情况下，如瘦弱婴幼儿，年老体弱和患急、慢性疾病者，以及长期使用广谱抗生素、免疫抑制剂、肾上腺皮质激素、抗肿瘤药物和放射治疗者，尤其是应用广谱抗生素者，可使肠道正常菌群被抑制而数量减少，耐药的过路菌过量繁殖，造成肠道菌群失调，同时，肠道菌群的失调还会加重某些疾病的严重程度。
因此确切了解肠道菌群变化及对肠道菌群进行精确定量对疾病的诊断有着重要的意义。
1直接镜检法镜检法是目前广泛采用的进行肠道菌群分析的方法。
该方法是通过油镜观察革兰染色粪便涂片的菌群象，估计细菌总数、球菌与杆菌比例，革兰阳性菌与革兰阴性菌的比例，结合各种细菌的形态特点、有无特殊形态细菌增多等结果来综合判断菌群状况。
观察细菌总数可以先计数部分(如1/8视野)油镜视野中细菌的数量，再对整个视野进行估计，观察几个视野后取平均值。
一般来说，每视野细菌数在501 5000个为正常，101 500个为轻微少，11 100个为明显减少，11个以下为显著减少，也有高于5000的情况，但较少见，临床意义不大。
细菌总数减少则与肠道菌群失调存在密切关系，应引起重视，并结合细菌类别构成等指标进行综合评估。
由于通过涂片镜检的方法无法精确区分细菌种类，一般就细菌形态和染色性将细菌分为4大类，即革兰阳性杆菌、革兰阴性杆菌、革兰阳性球菌、革兰阴性球菌，通过计算4者的比例来评估肠道菌群的特征。
具体计数方法为:计数1000个细菌中各类细菌的百分率。
可先计数部分视野中(如1/8视野)各类细菌数，然后估计全视野中的各类细菌数［2］。
该方法虽然由于所需设备简单，操作简便，耗时短，很适宜临床应用。
但是并不能完全反映肠道菌群的状态，更不能对细菌种类及数量进行精确定量，而且操作过程受主观因素影响较大，不易于推广。
2活菌定量培养计数法Hartemink等人［3］于1997年提出了活菌定量培养及计数的方法，即将一定质量的粪便标本，悬浮于PBS中，经连续10倍稀释，分别接种于不同的选择培养基中，进行培养。
对不同培养基选取最佳分布菌落进行计数，并根据其相应稀释倍数而得到细菌在标本中的含量。
此法可以同时显示肠道菌群的多样性和比例构成。
但是，目前选择性培养基并不能真正做到完全特异性选择，仍有85%的肠道菌群无法培养得到。
而且稀释平皿接种费时，通常孵育需2 3d，如果微生物分布不均，呈链状或成丛，则导致低估真正菌数。
平皿接种中的氧化作用会杀死像双歧杆菌这样的厌氧菌，影响菌数的估计。
3聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，PCR) 16S rRNA是编码细菌核糖体16S小亚基的核酸序列，而16Sr DNA是编码它的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。
16S rRNA基因可分为保守区和可变区，在不同的微生物可变区其核苷酸序列不同，一个16SrRNA的基因序列就代表着一种原核生物［4］。
16SrRNA/rDNA分子是研究微生物的最佳靶分子，利用保守区系列设计通用引物来判断细菌的存在与否，也可以利用16Sr DNA可变区特异性序列来进行特异性微生物种属鉴定和分型，这在细菌分类学中可作为一个科学可靠的指标。
基本过程是:先用PCR法扩增模板DNA，然后对扩增片段进行测序，获182第22卷第3期航空航天医学杂志2011年3月得新的特征性序列。
该技术可检测肠道中不能培养或生长缓慢的细菌，加速发现新的细菌和加快肠道微生态研究进程，但也存在局限性和偏差，需要从优化电泳及PCR条件着手改善或与其他技术方法结合使用、互为补充［5］。
4荧光原位杂交(fluorescent in situ hybridization，FISH)首次由于Delong于1989年用于微生物学，此技术是将带有荧光标记的寡核苷酸探针直接与固定在载玻片上的细胞进行杂交，固定过程中要使短的探针渗透到细胞内的核酸，用荧光显微镜即可观察到带有杂交荧光标记探针的细胞。
Langendijk等［6］已应用此技术检测粪便样品中双歧杆菌，其用荧光标记靶16SrRNA寡核苷酸探针，使用显微镜测定粪便样品中双歧杆菌中的数量。
Harmsen等［7］曾设计7种16SrRNA寡核苷酸探针来检测人粪便样品中6种厌氧菌(Phascolarctobacterium，Veillonella，Eubacterium hallii，Lachnospira，Eu2bacterium cylindroids，Ruminococ-cus)，能检测到细菌总数的90%。
尽管FISH的方法已有很大进展，但还存在一些问题。
以后灵敏度的提高、新探针标记方法及高强度荧光染料的开发，各种检测仪器的更新改进，细胞固定和透过处理方法优化都是必要的。
5DNA指纹图谱技术变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electropho-resis，DGGE)DGGE现在已经成为常用的一种16S rRNA/ rDNA指纹技术，可从通常的扩增产物分开单独的rRNA基因，具有简单、快速、灵敏的优势。
基本做法:从胃肠道标本中提取总DNA，用通用引物PCR法扩增16Sr DNA，由于不同细菌的16SrDNA片段在通过DGGE凝胶时在不同的尿素和甲酰胺浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中发生部分变性而迁移速度明显下降，从而将16S DNA片段分离并产生细菌群体的图谱。
通过指纹图谱比对有利于发现新的菌群和监测肠道菌群的多样性变化。
温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electro-phoresis，TGGE)温度梯度凝胶电泳(TGGE)是继DGGE 之后发展起来的DNA指纹图谱技术，与DGGE不同的是凝胶中所采用的不是尿素和甲酰胺浓度梯度而是温度梯度以及在引物的5'端加入30 50bp的GC片段(GC2clamp )。
16S rRNA基因进行PCR后扩增产物带有较高解链温度GC片段，在不同温度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳时，由于序列不同的DNA分子的解链速度和程度不同，它们在凝胶的不同位置停止迁移，从而使不同序列的DNA 分子分开并留下指纹印迹。
应用此技术能快速地检测单独区系菌群的构成，也可以发现存在的尚未被认识的肠道细菌。
LIONETTI等［8］运用该技术对儿童克罗恩病患者的肠道营养和微生物群落进行了研究。
DNA指纹技术也有其限制性，只能分离较小的片段(最长只达1000)因此只能提供有限的信息，片段太长时解离率下降，限制了系统发育分析和探针的序列信息量;再者分辨率低，通常显示的是群落中优势种类的DNA片段。
6实时荧光定量PCRFQ－PCR技术创立于1996年，由美国Applied Biosys-tems公司推出，是一种在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。
FQ－PCR技术是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
FQ－PCR技术融合PCR技术和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化使PCR的扩增及其分析过程均在同一封闭系统下完成，并在电脑分析软件支持下实现对PCR 扩增产物的动态监测和自动定量。
罗予等［9］利用实时荧光引物证实脆弱类杆菌可以与大肠埃希菌、乳酸杆菌和嗜热链球菌相鉴别，最低受检细菌数为102。
FQ－PCR的特点主要有以下几个方面:(1)定量原理独特，用产生荧光信号的多少来显示扩增产物的量，动态实时连续荧光监测，具有很好的可视性;(2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大地提高了检测的灵敏度、特异性和精确性;(3)只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速;(4)结果重现性好，定量动态范围高达五个数量级。
FQ－PCR作为PCR技术的发展，自1996年已来，在科研及临床诊断的许多领域显现出它的优越性，现在已广泛应用于生物学、基础医学、疾病诊断、食品、水质环保、药物开发等领域，被认为是核酸定量的金标准。
7小结了解肠道菌群在宿主体内的量，一方面可以有助于判断菌群平衡状况，另一方面又可以为疾病的诊治提供依据。
在没有掌握PCR等分子生物学手段的情况下，早期人们通过粪便涂片镜检法及细菌培养、显微镜下菌细胞计数来定量细菌，不仅费时而且对操作者的专业经验要求很高。
20世纪80年代中后期，人们试图用免疫学方法找到特定细菌产生特定抗原或代谢产物和细菌量之间的结合点。
20世纪90年代分子生物学技术的迅猛发展为细菌定量技术的研究提供了广阔的空间，加之各种灵敏荧光染料的开发及各种检测仪器的发展，使人们对微生物群体多样性有了更科学、更直接的认识，而且对微生态群落结构的分析能够更精确的定量。
通过以上各种方法的比较，我们有理由相信实时荧光定量PCR技术应用于肠道菌群的定量研究将会使我们逐渐了解到微生态系中微生物群体的多样性及实际生存状态，而且通过方法学评价，相信FQ－PCR技术必将在肠道微生态研究中发挥越来越重要的作用。