结核分枝杆菌属
结核分枝杆菌
结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，
简称结核杆菌，首次由德国科学家Robert Koch于 1882年由肺结核病人的痰液中分离得到，并被证实为结 核病的病原菌核杆菌在分类上隶属于放线菌目、分支杆 菌科、分支杆菌属，是种不能运动、不产芽孢、专性需 氧的短小杆菌。菌体-般细长、略弯曲，端极钝圆，多呈 单个或分枝状排列，大小约1-4×0.4μm。
革兰氏染色呈阳性；Ziehl -neelsen抗酸染色呈红色 ，非抗酸性细菌则呈蓝色。结核杆菌的抗酸性主要取决 于其胞壁内所含的分枝菌酸残基，亦和其胞壁固有层的 完整性有关。
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02 治疗性结核病疫苗的种类 2.1 活载体疫苗 2.2 亚单位疫苗 2.3 DNA疫苗 2.4 全菌灭活疫苗 2.5 其他疫苗 03 结核病治疗性疫苗的研究现状 04 结核病治疗性疫苗的展望
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04 展望
结核疫苗快速发展，并能对致病性结核杆菌产 生保护性免疫应答，为TB的防治带来了希望。然而， 迄今还没有一个重组疫苗能达到BCG的免疫水平。 其原因在于，重组疫苗虽可激活免疫系统，但不能 引起长期特异性的细胞免疫记忆，所以开发一种与B CG协同的、可产生长效免疫应答的疫苗十分重要。 初免-加强免疫策略的出现，有效联合了BCG与新型 结核疫苗，为预防结核、诱导机体产生长期免疫保 护作用提供了可能。
等
MTB肝素结合血凝
素
DNA疫苗
HG85 A/B
临床前 中国人民解放军军事 嵌合 DNA疫苗 A 医学科学院（吴雪琼） g85A/Ag85B 等
结核分枝杆菌
耐异烟肼及其他抗结核药物的结核菌株日益增多
二、致病性和免疫性
（一）致病物质
1. 脂质：磷脂（phosphatide） 索状因子 (cord factor） 硫酸脑苷脂 (sulfatide) 蜡质 D (wax-D脂质：
磷脂：能促进单核细胞增生,增强菌体蛋白质的 致敏作用,抑制蛋白酶对病灶组织的溶解,形成 干酪样坏死；使炎症中的巨噬细胞转变为类上 皮细胞，从而形成结核结节。
疫功能低下者；艾滋病；肿瘤；用过免疫抑制剂 者。
5. 实际应用
(1) 选择接种BCG对象，了解BCG接种是 否成功
(2) 流行病学调查 (3) 婴幼儿结核病诊断的参考 (4) 细胞免疫功能的测定
四、微生物学检查法
1．采集标本（痰液） 集菌（4g/L NaOH处理15min）
2. 涂片镜检：抗酸染色法 3. 分离培养（罗氏培养基，3-4周） 4. 动物试验（豚鼠） 5. 快速诊断
结核分枝杆菌
(M. tuberculosis)
• 分枝杆菌属的主要特点：
– 直或微弯曲，分枝状生长 – G+,但不易着色:细胞壁含有大量脂质 – 又称抗酸杆菌 (acid-fast bacilli)
常用抗酸染色鉴定，呈抗酸染色阳性
• 分枝杆菌属细菌种类繁多，可分为：
– 结核分枝杆菌 – 牛分枝杆菌 – 麻风分枝杆菌
索状因子：抑制白细胞游走引起慢性肉芽肿。 蜡质D：具有佐剂作用,可激发机体产生迟发型
超敏反应。 硫酸脑苷脂：使细菌在吞噬细胞中长期存活。
2.蛋白质
与蜡质D结合产生迟发型超敏反应,并 引起组织坏死病理过程及全身中毒症状, 促进结核结节形成。
(二)所致疾病
所致疾病
结核病 以肺结核（痨病）常见
病原微生物学,第13章分枝杆菌属,包括(第一节结核分枝杆菌,第三节麻风分枝杆菌)
L型变异
二、致 病 性
（一）致病物质
致病与细菌结构成分有关
(1)脂质（占胞壁干重的60%） 磷脂: 结核结节、干酪样坏死 脂肪酸（其中索状因子）: 破坏线粒体、抑制中性粒细胞 游走和吞噬、慢性肉芽肿 硫酸脑苷酯和硫酸多酰基化海藻糖: 使结菌在吞噬细胞中 长期存活（抑制吞噬体与溶酶体的结合） 腊质D : 超敏反应、佐剂 (2)蛋白质：结核菌素与腊质D结合后使机体发生超敏反应 (3)荚膜: 黏附、抗吞噬、保护细菌
慢性纤维空 洞性肺结核
致病性
肺外感染
• 免疫力低下患者 • 常见于脑、肾、骨、关 节、生殖系统 • 少数形成全身粟粒性结 核或播散性结核
结核病患者
临床症状
• 全身症状：发热（低热），疲倦、乏力、 夜间盗汗,消瘦 • 呼吸系统症状：咳嗽、咳痰 咯血、胸痛、气急
三、免疫与超敏反应
免疫特点
有菌免疫（菌体或成分消失，免疫也消失）
抗青霉素等抗生素
（四敏）
• 对紫外线敏感
• 对热敏感
• 对乙醇敏感
• 对抗痨药物敏感
“变”：毒力、耐药性、形态等均可变异
卡介苗（Bacille Calmette-Guerin，BCG）：卡— 介二人将有毒的牛型分枝杆菌培养于含胆汁、甘油、 马铃薯的培养基中，经230次传代，历时13年，使 其毒力发生变异，成为对人无致病性，而仍能保持 良好免疫原性的疫苗株
Robert Koch
• 1882年3月24日科 霍在德国柏林生 理学會上宣布了 结核菌是结核病 的病原菌。
•1995年起将每年的3月 24日定为“世界防治结 核病日”
Robert Koch 1843-1910
20世纪30年代，“十痨九死”的悲惨状况。
临床执业医师知识热点：分枝杆菌属
临床执业医师知识热点：分枝杆菌属2017年临床执业医师知识热点：分枝杆菌属分枝杆菌属是一类细长略弯曲的微生物，有时有分枝或出现丝状体。
目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中。
对人致病的放线菌可分含和不含分枝菌酸两类。
分枝杆菌属于含分枝菌酸类。
1.形态与染色结核分枝杆菌简称结核杆菌，菌体细长略弯曲，直径0.4μm，长1～4μm，聚集成分枝状排列繁殖，抗酸染色阳性(由于结核分枝杆菌细胞壁中含有大量脂质而不易着色，故一般不用革兰染色，而用齐-尼抗酸染色法染色，阳性菌被染成红色)，无菌毛、鞭毛和荚膜，不形成芽胞。
2.培养特性(1)专性需氧;(2)营养要求较高，培养常用罗氏培养基，内含蛋黄、甘油、天门冬素、马铃薯、无机盐及抵制杂菌生长的孔雀绿等物质;(3)生长缓慢，繁殖一代需18～24小时，分离培养需经2～4周才可见米黄色菜花状菌落生长。
3.抵抗力该菌对酸、碱、自然环境和干燥抵抗力强，在干燥痰内可存活6～8个月。
但对湿热、酒精和紫外线敏感，抵抗力弱，如75%酒精作用数分钟、液体中加热62～63℃，15min、直接日光照射数小时均可被杀死。
对抗结核药物易产生耐药性。
结核菌感染的免疫特点1.抗结核免疫属于感染免疫，或称有菌免疫，体内的结核杆菌一旦被清除，免疫力即随之消失;2.机体抗结核免疫主要依赖细胞免疫，激活的致敏T细胞可释放白细胞介素-2、肿瘤坏死因子和干扰素等多种淋巴因子，使巨噬细胞聚集于炎症部位，并增强巨噬细胞对结核杆菌的杀伤作用而机体产生的特异性抗体无保护作用;3.抗结核免疫与机体迟发型变态反应同时并存，因此测定机体对结核杆菌有无变态反应即可判定其有无免疫能力。
结核菌属试验的原理结果判断和应用1.原理结核菌素(OT)试验原理是测定机体对结核杆菌的迟发型超敏反应，以此判断机体有无抗结核免疫力。
2.结果判断取OT(结核杆菌培养液的浓缩物)或PPD(结核杆菌纯蛋白衍生物)5单位，注射于前臂皮内。
48～72小时观察结果，局部出现红肿和硬结，且大于5mm者，为阳性，表示机体细胞免疫功能正常，曾感染过结核杆菌。
结核分枝杆菌
实养法、分子生物 学方法、免疫学方法和噬菌体法。 痰涂片直接镜检是检测抗酸杆菌（AFB）最普遍 的实验室诊断方法，特异性较高，但灵敏性较低， 涂片中分枝杆菌要达到103-104cfu/ml才可检测出 阳性结果，且仅能检出1/2—3/4的活动性结核患 者，漏检率相当高 。
罗氏（LÖwenstein Jensen）培养法是目前检测 MTB的“金标准”，但其检测周期长（8周）， 导致无法及时确诊结核患者，并无法及时治疗； 新近发展起来并广泛使用的快培检测技术无疑大 大缩短了检测周期，但确诊仍需2-3周，依然无 法实现结核病快速诊疗； 基于免疫学的检测方法快速，操作简单，成本低 廉，但灵敏度有限； 基于核酸扩增的检测方法快速、准确，但成本高 昂、技术要求高，难以在发展中国家常规实验室 中广泛开展。
分枝杆菌属
1982年，Robert Koch首次发现结核分枝杆菌为 结核病德致病菌。在微生物分类上，分枝杆菌归 属原核生物界，厚壁菌门，放线菌目，分枝杆菌 科，分枝杆菌属。 临床将分枝杆菌分为结核分枝杆菌，非结核分枝 杆菌，麻风杆菌及腐物寄生性分枝杆菌。
致病性
肺结核是一种因感染结核分枝杆菌（MTB）， 偶尔为牛分枝杆菌，非洲分枝杆菌而引发的传染 病，在低收入地区发病率相对较高。据WHO统 计，全球约1/3的人口感染MTB，每年新增患者 900万，并有300万人死于该病。
结核分枝杆菌的消
4、光线和射线 结核分枝杆菌对光线和射线 敏感，痰内分枝杆菌在阳关直射下2小时可死 亡，紫外线照射下10-20分钟死亡。结核病房 常用紫外线进行空气和物体表面消毒。因紫外 线穿透力较弱，不适合物体内部和液体的消毒 5、酸、碱 结核分枝杆菌对酸、碱的抵抗力 比较强，15%~30%硫酸或10%~15%苛性钠 溶液作用30分钟不能杀死结核分枝杆菌。
一、结核分枝杆菌对理化因素的抵抗力
1、环境 结核分枝杆菌在干燥环境中存活时 间较长，在室温和暗处的干痰内可生存6-8个 月，飞扬于空气尘埃中的结核分枝杆菌8-10天 才死亡。-8—-6℃下可存活4-5年。因此，常 在低温下保存菌株。 2、干热 结核分枝对于抵抗力较强，在 100℃干燥箱内4-5小时才能杀死痰内结核分枝 杆菌，160-180℃需1-2小时
一、结核分枝杆菌对理化因素的抵抗力
3、湿热 湿热对结核 分枝杆菌有较强的杀伤 力，煮沸消毒和压力蒸 汽灭菌是杀灭结核分枝 杆菌最有效的方法。湿 热对结核分枝杆菌纯培 养物的杀灭时间。 附表1湿热对结核分枝杆菌 纯培养的杀灭时间
温度 60 70 80 95 100 /℃ 10 杀灭 时间 /分 钟 30 5 1 即 刻
一、结核分枝杆菌对理化因素的抵抗力
实际消毒过程中，消毒效果受有机物等因素影 响，消毒时间应延长。对痰液及污染医疗器械 进行煮沸消毒，应持续10分钟以上。85℃巴 氏消毒法可用与杀灭牛奶中的结核分枝杆菌。 121℃压力蒸汽20分钟、132℃预真空压力蒸 汽4分钟可用于所以耐热物品的灭菌首选。
一、结核分枝杆菌对理化因素的抵抗力
结核分枝杆菌的消毒灭菌方法
概述
结核分枝杆菌属分枝杆菌属，是致病力较强的 革兰阳性需氧菌，它是一种具有复杂细胞壁的 小型棒状杆菌。结核分枝杆菌生长缓慢，适宜 生长的PH是6.7~7.0，温度是37℃。细胞壁及 DNA脂类含量高，具有蜡质外膜和疏水性，有 比较强的坚韧性和弹性。结核分枝杆菌对消毒 因子的抵抗力较一般细菌强仅次于芽孢。
结核分支杆菌
结核分支杆菌结核分支杆菌是一种引起结核病的重要病原微生物。
它属于革兰氏阳性菌门，酸杆菌目，分支杆菌科。
结核分支杆菌主要包括结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和波氏分枝杆菌（Mycobacterium bovis）等两个物种。
这两个物种在致病性、传播途径和临床病症上存在差异。
结核分支杆菌是一种耐酸菌，这意味着它可以抵抗胃酸，穿过人体的自然防御屏障。
当结核分支杆菌进入人体后，它们会通过空气飞沫传播至呼吸道，例如咳嗽、打喷嚏或说话时。
此外，结核分支杆菌还可以通过经验性接触传播，例如与结核病患者共用衣物、餐具或通过亲密接触等方式。
结核分支杆菌感染人体后，通常会进入休眠状态，形成所谓的原发感染灶。
这时的病者可能没有任何临床症状，但仍具有传染性。
当人体的免疫力下降时，例如长期患有艾滋病、接受器官移植或使用免疫抑制剂等情况下，结核分支杆菌可能重新激活，引起所谓的继发性结核病。
结核病主要通过肺部感染，但也会影响其他器官，如骨骼、淋巴结、肠道和脑膜等。
典型的肺结核病症状包括咳嗽、咳痰、胸痛、乏力、发热以及体重下降等。
但需要注意的是，临床表现因个体差异而有所不同，有些患者可能没有明显的症状，或症状非特异，容易被误诊。
结核分支杆菌的诊断主要依靠临床症状、影像学检查以及实验室病原学检测，如菌落培养和PCR等。
目前，结核分支杆菌对常规抗生素的敏感性逐渐下降，多重耐药结核病（MDR-TB）和极耐药结核病（XDR-TB）的发生率也在上升。
因此，选择合适的抗结核药物方案非常关键。
此外，结核病的治疗通常需要长期使用药物，患者需要依从治疗计划以避免耐药菌株的产生。
为了控制结核病的传播，各国纷纷采取了多种措施，包括强化结核病的监测和报告、提供免费的诊断和治疗服务、推广结核疫苗接种（如卡介苗）、加强感染控制和教育宣传等。
全球结核病联盟和世界卫生组织在这方面发挥了重要的作用。
总之，结核分支杆菌是一种具有严重危害性的病原微生物。
结核分枝杆菌与麻风分枝杆菌
➢多发生于成人 ➢病灶局限，不易扩散 ➢易形成结核结节，易发生干酪样坏死和空洞
2、肺外感染
结核分枝杆菌可进入血液循环引起肺内、外播散， 如脑、肾结核、脊柱结核等。 结核分枝杆菌进入消化道可引起肠结核、结核性 腹膜炎等。
（三）免疫性
结核的免疫属于感染免疫，又称有菌免疫。即 此种免疫力随结核分枝杆菌或其成分在体内存 在而存在。一旦体内病菌或其组分全部消失， 免疫力也随之消失。 属胞内感染菌，其免疫主要是以T细胞为主的细 胞免疫。
旧结核菌素（old tuberculin，OT) 每0.1ml含5单位
纯蛋白衍化物(purified protein derivative，PPD) 人结核分枝杆菌制成的PPD-C 卡介苗制成的BCG-PPD 每0.1ml含5单位 目前都用PPD
方法
PPD 5个单位两前臂皮内注射 48～72h后红肿硬结超过5mm者为阳性≥15mm
磷脂：促使单核细胞增生，与结核结节的形成及干酪
样坏死有关。
蜡质D：是肽糖脂和分枝菌酸的复合物，可激发机体产
生迟发型超敏反应。
硫酸脑苷脂：抑制吞噬细胞中吞噬体与溶酶体的结合，
使细菌能在吞噬细胞中长期存活。
2、蛋白质
是结核菌素的主要成分，本身无毒，和蜡质D 结合后能使机体发生超敏反应。
在形成结核结节中发挥一定作用。
培养特性
专性需氧，生长缓慢 营养要求高，在罗氏固 体 培 养 基 （ P112 ） 中 生 长良好，2-4周后呈乳白 或米黄色、干燥菜花状 菌落。
花菜样菌落
抵抗力 （四怕） （四不怕）
对乙醇敏感 对湿热敏感 对紫外线敏感 对抗结核药物敏感
抗干燥 抵酸碱 抗碱性染料 对青霉素等抗生素耐药
变异性
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鉴定试验
接种小白鼠 豚鼠
脏器涂片 镜检
菌种鉴定
结核分枝杆菌－－涂片检查
直接涂片 薄涂片 厚涂片
集菌涂片 沉淀集菌法 漂浮集菌法
荧光显微镜检查法： 金刚胺O染色→荧光显微镜下检查
抗酸染色－－报告方式 报告方式
镜检结果
-
仔细检查300个视野未发现抗酸杆菌
±
300个视野内发现1~2条抗酸菌
＋
100个视野内发现1~9条抗酸菌
＜5mm为阴性≥ ＞ 5mm为阳性 ＞ 15mm为强阳性 应用：选择卡介苗接种对象；判断卡介苗接种效果；辅助诊断婴幼儿结核病；测定肿瘤患者 细胞免疫状态
结核分枝杆菌－－检验程序 标本
涂片抗酸 染色镜检
标本前处理
核酸 检测抗体 检测接种液体 源自养基接种固体培养基 可疑菌落
慢性生长菌
快速生长菌
抗酸染色
谢谢！
25
报告方式
培养结果
＋
斜面20个菌落以上，占斜面1/4以下
2＋
斜面上菌落生长面积占1/4以上，1/2以下
3＋
斜面上菌落面积占斜面1/2以上，3/4以下
4＋
斜面上菌落生长密集，成菌苔
非典型分枝杆菌
是指结核分枝杆菌与麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌。 大多为环境中的腐生菌 对酸碱比较敏感 对常用抗结核药耐受 为条件致病菌，艾滋病患者易感染鸟复合分枝杆菌
麻风杆菌
犰狳
抗酸染色
染液组成： 石炭酸复红、3％盐酸酒精、美兰
染色步骤 ※石炭酸加温染5分钟，水洗 ※ 3％盐酸酒精脱色致无红色脱下为止，水洗 ※美蓝染1分钟，水洗，干后镜检
染色结果 ※抗酸菌：红色 ※非抗酸菌：蓝色
染色意义：区别抗酸菌与非抗酸菌
结核分枝杆菌菌落
结核分枝杆菌（抗酸染色）
麻风病人
孔雀绿等 生长现象： ※生长缓慢 ※改良罗氏培养基菌落特征：干燥、淡黄色、 质地较硬的R型菌落 ※液体培养基：形成菌膜，有毒株呈索状生长
结核分枝杆菌－－生化反应
生化反应不活泼，不发酵糖类 与非结核分枝杆菌鉴别： 耐热触酶试验－；（非结核分枝杆菌＋） 与牛分枝杆菌鉴别 烟酸试验＋；（牛分枝杆菌－）
结核分枝杆菌－－抵抗力与变异性
麻风分枝杆菌－－生物学性状
为抗酸杆菌 细胞内寄生 有麻风杆菌寄生的细胞呈泡沫状，称为麻风细胞 体外人工培养尚未成功 犰狳是动物感染模型
麻风分枝杆菌－－临床意义与微检
经呼吸道、接触感染 引起麻风病 瘤型麻风（开放型）：传染性强 结核样型（闭锁性）：传染性弱 微检：标本涂片抗酸染色是诊断麻风的主要依据
麻风分枝杆菌
结核分枝杆菌 牛分枝杆菌、 非洲分枝杆菌 田鼠分枝杆菌
光产色分枝杆菌 暗产色分枝杆菌 不产色分枝杆菌 迅速生长分枝杆菌
结核分枝杆菌－－形态染色
细长略弯，分枝生长趋势 无芽孢，无鞭毛，部分菌株有荚膜 革兰染色阳性，不易着色 抗酸染色阳性
结核分枝杆菌－－培养特性
生长条件： 专性需氧、细胞内寄生菌、最适pH6.5～6.8、营养要求高、培养基含鸡蛋、马铃薯粉、甘油、
结核分枝杆菌属
1
分枝杆菌属主要特点
是一类直或微弯曲、有分枝生长趋势的杆菌。 细胞壁脂质含量高，主要为分枝菌酸。 具有抗酸性，革兰染色不易着色，常用抗酸染色。 专性需氧营养要求特殊，大多数生长缓慢。 不产内、外毒素和侵袭性酶等致病物质，所致疾病呈慢性。
分枝杆菌属种类 结核分枝杆菌复合群
分
枝
杆
菌
属
非典型分枝杆菌
抵抗力特点：“三耐四敏” ※耐干燥、耐酸碱、耐孔雀绿（1：13000） ※对湿热、70％乙醇、紫外线、常用抗结核药物（但长期使用易产生耐药性）
变异性 ※典型形态－→多形性 ※ R型菌落－→S型菌落 ※有毒－→无毒（用于制备疫苗） ※抗结核药敏感－→耐药
结核分枝杆菌－－致病物质
脂质 索状因子:与该菌毒力有密切关系 磷脂: 分枝菌酸：与抗酸性有关 蜡质D:具有佐剂作用 硫酸脑苷脂
蛋白质 糖类 结核杆菌不产生内、外毒素，不产生侵袭性酶
结核分枝杆菌－－所致疾病与免疫性
经多途径感染，引起结核病，以肺结核多见 类型：原发感染和继发感染 免疫性 ※抗结核免疫以细胞免疫为主 ※抗结核免疫属带菌免疫 ※抗结核免疫与Ⅳ型超敏反应同时出现
结核分枝杆菌－－结核菌素试验
原理：用结核菌素进行皮肤试验，以检测受试者对结核杆菌是否有细胞免疫及迟发型超敏反 应的试验。 结果：根据注射部位是否出现红肿判断结果
2＋
10个视野内发现1~9条抗酸菌
3＋
每个视野内发现1~9条抗酸菌
4＋
每个视野内发现9条以上抗酸菌
结核分枝杆菌－－分离培养
标本前处理： ※目的：杀死杂菌；液化标本 ※方法：
4％NaOH法； 4％H2SO2法； 胰酶-新洁尔灭法等 培养基选择：罗氏培养基、米氏培养基、小川培养基等 接种 培养
培养结果记录与报告方法