结核分枝杆菌(1)

• 致敏淋巴细胞可产生多种淋巴因子，如IL-2、 IL-6、INF- α，他们与TNF-α的共同作用可 杀死病灶中的结核分枝杆菌。淋巴因子中INFα是主要的，有多种细胞能产生INF- α，浸润 的先后为NK、Ts/Th和CD4+、CD8+α/βT细 胞。上述细胞有的可直接杀伤靶细胞，有的产 生淋巴因子激活巨噬细胞，使吞噬作用加强引 起呼吸暴发，导致活性氧中介物和活性氮中介 物的产生而将病菌杀死。
菌阴结核
• 三次涂片及一次培养阴性的肺结核，诊 断标准：①典型临床症状和胸部x线表现； ②抗结核治疗有效；③临床可排除其他 非结核性肺部疾患；④PPD强阳性，结 核抗体阳性；⑤痰结核菌PCR和探针检 测阳性；⑥肺外组织病理证实结核病变； ⑦支气管肺泡灌洗液检出分枝杆菌；⑧ 支气管或肺部组织病理证实结核病变。 具备①～⑥中3项或⑦、⑧中1项可确诊。
• 故结核标本用4% NaOH消化时，一般 细菌很快杀死，但结核分枝杆菌可耐受 数十分钟。结核分枝杆菌入侵后荚膜还 可抑制吞噬体与溶酶体的融合。
脂质
• 据实验研究细菌毒力可能与其所含复杂的脂质 成分有关，特别是糖脂更为重要。 • ①索状因子 ： 是分枝菌酸和海藻糖结合的一 种糖脂。能使细菌在液体培养基中呈蜿蜒索状 排列。此因子与结核分枝杆菌毒力密切相关。 它能破坏细胞线粒体膜，影响细胞呼吸，抑制 白细胞游走和引起慢性肉芽肿。若将其从细菌 中提出，则细菌丧失毒力。 • ②磷脂：能促使单核细胞增生，并使炎症灶中 的巨噬细胞转变为类上皮细胞，从而形成结核 结节。
• 结核的免疫属于感染免疫(infection immunity)，又称有菌免疫，即只有当 结核分枝杆菌或其组分存在体内时才有 免疫力。一旦体内的结核分枝杆菌或其 组分全部消失，免疫也随之不存在。 • 随着机体对结核分枝杆菌产生保护作用 的同时，也可以看到有迟发型超敏反应 的产生，二者均为T细胞介导。
• 2.试验方法与意义：常规试验分别取2种PPD 5个单位注射两前臂皮内，48～72h后: 硬结≤4mm者为阴性； 5-9mm为弱阳性； 10-19mm为阳性； ≥20mm或虽＜20mm，但局部出现水 泡和淋巴管炎，为强阳性。 若PPD-C侧红肿大于BCG-PPD侧为感染。反 之，BCG-PPD侧大于PPD-C侧，可能系卡介 苗接种所致。
浓缩集菌
• 先集菌后检查，可提高检出率。培养与动物试 验也必须经集菌过程以除去杂菌。脑脊液和胸、 腹水无杂菌，可直接离心沉淀集菌。痰、支气 管灌洗液、尿、粪等污染标本需经4% NaOH （痰和碱的比例为1:4,尿、支气管灌洗液和碱 的比例为1:1）处理15min，时间过长易使结 核分枝杆菌L型与非结核分枝杆菌死亡。尿标 本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于锥形量 筒内静置，取沉淀物处理。处理后的材料再离 心沉淀。取沉淀物作涂片染色镜检。若需进一 步作培养或动物接种，应先用酸中和后再离心 沉淀。
• 常用的有罗氏 （LowensteinJensen）固体培养基， 内含蛋黄、甘油、马铃薯、 无机盐和孔雀绿等。孔雀 绿可抑制杂菌生长，便于 分离和长期培养。蛋黄含 脂质生长因子，能刺激生 长。根据接种菌多少，一 般2～4周可见菌落生长。 菌落呈颗粒、结节或花菜 状，乳白色或米黄色，不 透明。
抵抗力
• 近来研究表明结核分枝杆菌诱导机体产 生免疫和超敏反应的物质不同。超敏反 应主要由结核菌素蛋白和蜡质Ｄ共同引 起，而免疫则由结核分枝杆菌核糖体 RNA引起。二种不同抗原成分激活不同 的T细胞亚群释放出不同的淋巴因子所致。
结核菌素试验
• 结核菌素试验是应用结核菌素进行皮肤试验来 测定机体对结核分枝杆菌是否能引起超敏反应 的一种试验。 1.结核菌素试剂：旧结核菌素：系将结核分枝 杆菌接种于甘油肉汤培养基，培养4～8周后加 热浓缩过滤制成。稀释2 000倍，每0.1ml含 5u。目前都用纯蛋白衍化物，PPD有二种： 人结核分枝杆菌制成的PPD-C和卡介苗制成的 BCG-PPD。每0.1ml含5u。 •
• 阴性反应表明未感染过结核分枝杆菌， 但应考虑以下情况： ①感染初期，因结核分枝杆菌感染后 需4周以上才能出现超敏反应 ②老年人 ③严重结核患者或患有其他传染病， 如麻疹，水痘导致的细胞免疫低下 ④获得性细胞免疫低下，如艾滋病或 肿瘤等用过免疫抑制剂者。
涂片法
• 抗酸杆菌（－）：连续观察300视野未 发现； • 抗酸杆菌（±）：连续观察300视野发 现1-3条; • 抗酸杆菌（1＋）：1-9条/100视野 • 抗酸杆菌（2＋）：1-9条/10视野 • 抗酸杆菌（3＋）：1-9条/1视野 • 抗酸杆菌（4＋）：≥10条/1视野
培养
• 罗氏培养基，一般需2-6周，阳性结果随 时报告，8周无菌生长，报为阴性结果， 阳性结果按生长菌落占斜面1/4,1/2,3/4 和全部划分1+到4+
快速诊断
• 一般涂片检查菌数需5x103～4/ml,培养需 1x102/ml,标本中菌数少于此数时不易获得阳 性结果，且培养需时较长。目前已将多聚酶链 反应（PCR）扩增技术应用于结核分枝杆菌 DNA鉴定，每ml中只需含几个细菌即可获得 阳性，且1-2d得出结果。操作中需注意实验器 材的污染问题，以免出现假阳性。细菌L型由 于缺壁并有代偿性细胞膜增厚，而一般常用的 溶菌酶不能使细胞膜破裂释出DNA，以致造 成PCR假阴性。用组织磨碎器充分研磨使细胞 破裂后，则可出现阳性。
• 结核分枝杆菌细胞壁中含有脂质，故对乙醇敏 感，在70%乙醇中2min死亡。此外，脂质可 防止菌体水分丢失，故对干燥的抵抗力特别强。 粘附在尘埃上保持传染性8～10d，在干燥痰 内可存活6～8个月。结核分枝杆菌对湿热敏感， 在液体中加紫外线敏感。直接日光照 射数小时可被杀死，可用于结核患者衣服、书 籍等的消毒。
• ③硫酸脑苷脂：可抑制吞噬细胞中吞噬 体与溶酶体的结合，使结核分枝杆菌能 在吞噬细胞中长期存活。 • ④蜡质D:是一种肽糖脂和分枝菌酸的复 合物，可从有毒株或卡介苗中用甲醇提 出，具有佐剂作用，可激发机体产生迟 发型超敏反应。
蛋白质
• 有抗原性，和蜡质D结合后能使机体发生 超敏反应，引起组织坏死和全身中毒症 状，并在形成结核结节中发挥一定作用。
一、 生物学性状
• 形态与染色 结核分枝 杆菌为细长略带弯曲的 杆菌，大小1～ 4X0.4m。牛分枝杆菌 则比较粗短。分枝杆菌 属的细菌细胞壁脂质含 量较高，约占干重的 60%，特别是有大量分 枝菌酸包围在肽聚糖层 的外面，可影响染料的 穿入。
分群（Mitchson假说）
• A菌群：快速繁殖， 巨噬细胞外和肺空洞 干酪液化部分； • B菌群：半静止状态， 巨噬细胞内和空洞璧 坏死组织中； • C菌群：半静止状态， 可突然间歇生长。 • D菌群：休眠状态， 不繁殖，数量很少。
• 结核分枝杆菌不产生内、外毒素。其致 病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖 引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒 性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤 有关。 • 致病物质与荚膜、脂质和蛋白质有关。
荚膜
• 荚膜的主要成分为多糖，部分脂质和蛋 白质。其对结核分枝杆菌的作用有： • ①荚膜能与吞噬细胞表面的补体受体3结 合，有助于结核分枝杆菌在宿主细胞上 的粘附与入侵； • ②荚膜中有多种酶可降解宿主组织中的 大分子物质，供入侵的结核分枝杆菌繁 殖所需的营养； • ③荚膜能防止宿主的有害物质进入结核 分枝杆菌，甚至如小分子NaOH也不易 进入。
耐药性
• 在固体培养基中对常用的含异烟肼1mg、 链霉素10mg、利福平50mg能生长的 结核分枝杆菌为耐药菌。耐药菌株毒力 有所减弱。异烟肼可影响细胞壁中分枝 菌酸的合成，诱导结核分枝杆菌成为L型, 此可能是耐异烟肼的一种原因。药物敏 感试验表明对异烟肼耐药，而对利福平 和链霉素大多仍敏感。
二、致病性
免疫性
• 免疫机制 结核分枝杆菌是胞内感染菌， 其免疫主要是以T细胞为主的细胞免疫。 T细胞不能直接和胞内菌作用，必须先与 感染细胞反应，导致细胞崩溃，释放出 结核分枝杆菌。机体对结核分枝杆菌虽 能产生抗体，但抗体只能与释出的细菌 接触起辅助作用。
• 结核分枝杆菌侵入呼吸道后，由于肺泡 中80%～90% 是巨噬细胞，10% 是淋 巴细胞（T细胞占多数）；原肺泡中未活 化的巨噬细胞抗菌活性弱，不能防止所 吞噬的结核分枝杆菌生长，反可将结核 分枝杆菌带到他处。但可递呈抗原，使 周围T淋巴细胞致敏。
染色
• 分枝杆菌一般用齐尼（ZiehlNeelsen)抗酸染色法，以5% 石炭酸 复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸 乙醇不易脱色。若再加用美蓝复染，则 分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中 的物质为蓝色。
培养特性
• 专性需氧。最适温度为37℃，低于30℃ 不生长。结核分枝杆菌细胞壁的脂质含 量较高，影响营养物质的吸收，故生长 缓慢。在一般培养基中每分裂1代需时 18～24h，营养丰富时只需5h。