实验二 普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色
2实验二显微镜油镜的使用、细胞形态的观察及革兰氏染色
（三）显微镜保养和使用中的注意事项
1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。 2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度 3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当
目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器， 以免压碎玻片或损伤镜面。 4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿， 更不可倾斜拿。 5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的 香柏油；第二遍擦镜纸蘸上乙醇再擦镜头；第三遍再用干净 的擦镜纸擦去多余的乙醇。 6.显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。
先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的 蓝紫色；
然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫—碘复 合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
然后再用乙醇脱色处理。
（四）、革兰氏染色原理
由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状 结构、壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩， 结晶紫—碘不易被洗脱而保留在细胞内，复染时 仍保持蓝紫色。
⑷ 初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为 宜）初染1--2分钟min，水洗。
⑸ 媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
初染
媒染
脱色
复染
（三）革兰氏染色的操作方法
⑹ 脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾 斜，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色 时为止，约20—30s，立即用水冲净酒精。
?而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄类脂含量高所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解细胞壁透性增大结晶紫由于细胞壁的肽聚糖层较薄类脂含量高所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解细胞壁透性增大结晶紫碘复合物被洗脱复染时细胞被染上复染剂的颜色碘复合物被洗脱复染时细胞被染上复染剂的颜色红色
细菌的简单染色和革兰染色实验报告
实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。
如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。
实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色
实验⼆普通光学显微镜的使⽤及细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊实验⼆普通光学显微镜的使⽤及细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊普通光学显微镜的使⽤⼀、实验⽬的以染⾊玻⽚及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使⽤⽅法。
⼆、显微镜油镜使⽤的原理1 普通光学显微镜的基本构造（1）光学部分: 接⽬镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。
它使检视物放⼤, 造成物象。
（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。
它起着⽀持、调节、固定等作⽤。
2 显微镜的放⼤倍数和分辨率（1）放⼤倍数=接物镜放⼤倍数×接⽬镜放⼤倍数（2）显微镜的分辨率：表⽰显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能⼒，可⽤公式表⽰为：D=λ/2n·sin(α/2 )式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。
λ：可见光的波长（平均0.55µm）n: 物镜和被检标本间介质的折射率。
a：镜⼝⾓（即⼊射⾓）。
3 油镜使⽤的原理油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻⽚与镜头之间的空⽓时，由于空⽓与玻⽚的密度不同，使光线受到曲折，发⽣散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是⼀层油（其折射率与玻⽚的相近），则⼏乎不发⽣折射，增加了视野的进光量，从⽽使物象更加清晰。
三、实验材料1 显微镜、⾹柏油、⼆甲苯、擦镜纸、吸⽔纸、盖玻⽚、接种环、酒精灯等。
2 细菌三种形态的玻⽚染⾊标本。
3 培养12-18h的枯草芽孢杆菌。
四、实验⽅法与步骤1 染⾊细菌玻⽚的油镜观查（1）⽤前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光亮度。
（3）低倍镜观察：先粗调再微调⾄物象清晰。
（4）转⼊中倍、⾼倍观察，每⼀不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。
（5）油镜观察：⾼倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴⼀滴⾹柏油，使油镜镜头浸⼊⾹柏油中，细调⾄看清物象为⽌。
（6）绘出所观察到的细菌形态图像。
（7）、换⽚：另换新⽚观察，必须从（3）步开始操作。
实验二+细菌的简单染色与革兰氏染色
滴加碘液 媒染1min; 碘液, (6)媒染 滴加碘液,媒染 ) ; 用水洗去碘液; (7)水洗 用水洗去碘液; ) 将玻片倾斜,连续滴加95%乙醇脱色 乙醇脱色 (8)脱色 将玻片倾斜,连续滴加 ) 乙醇脱色2 0-25s至流出液无色,立即水洗; 至流出液无色,立即水洗; 至流出液无色 滴加沙黄复染5min; 沙黄复染 (9)复染 滴加沙黄复染 ) ; (10)水洗 用水洗去涂片上的沙黄染色液; 用水洗去涂片上的沙黄染色液; ) (11)晾干 将染好的涂片放空气中晾干或者用吸 ) 水纸吸干; 水纸吸干; 镜检时先用低倍,再用高倍, (12)镜检 镜检时先用低倍,再用高倍,最后用油 ) 镜观察, 镜观察,并判断菌体的革兰氏染色反应 性.
简单染色法是只用一种染料使细菌着色以 简单染色法 是只用一种染料使细菌着色以 显示其形态, 显示其形态,简单染色不能辨别细菌细胞 的构造. 的构造. 革兰氏染色法是 年由丹麦病理学家C.G 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 年由丹麦病理学家 ram所创立的.革兰氏染色法可将所有的 所创立的. 所创立的 细菌区分为革兰氏阳性菌( G+ ) 和革兰 细菌区分为革兰氏阳性菌 ( 氏阴性菌( 两大类, 氏阴性菌(G-)两大类,是细菌学上最常 用的鉴别染色法. 用的鉴别染色法.该染色法所以能将细菌 分为G 菌和G 是由这两类菌的细胞 分为 + 菌和 - 菌 , 是由这两类菌的 细胞 壁结构和成分的不同所决定的 所决定的. 壁结构和成分的不同所决定的.
六 思考题及作业题
1,当对未知菌进行革兰氏染色时 , 如何保 , 当对未知菌进行革兰氏染色时, 证操作正确及结果可靠? 证操作正确及结果可靠? 2,简述革兰氏染色的原理和步骤. ,简述革兰氏染色的原理和步骤.
球菌
普通光学显微镜的使用单染色及革兰氏染色修订版
普通光学显微镜的使用单染色及革兰氏染色 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998【实验题目】普通光学显微镜的使用，单染色及革兰氏染色【实验目的】1. 学习并掌握显微镜的结构功能和使用。
2.学习微生物涂片、染色的基本技术。
3.学习掌握革兰氏染色法。
4.初步认识细菌的显微形态。
【实验器材】1、菌种：金黄色葡萄球菌（G+）、大肠杆菌（G-）、枯草芽孢杆菌以及自选菌种两种2、溶液和试剂：a) 草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及碘液、95%乙醇、无菌水等b) 香柏油、二甲苯3、仪器及其它用品：普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿等【实验原理】A、普通显微镜的基本原理1、基本原理现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来昂达成像，故又称为复式显微镜。
它们包括机械部分和光学部分两部分。
机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。
光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等。
显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为，和载片玻璃的折射率（）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
2、油镜微生物学使用的显微镜的物镜通常有低倍镜（10×）、高倍镜（40×）和油镜（100×），油镜是三者中放大倍数最大的，油镜的焦距和工作距离最短，油镜与其他物镜不同的是载玻片与物镜之间隔的不是一层空气（干燥系），而是一层油脂，称为“油浸系”。
光学显微镜的使用及革兰氏染色
光学显微镜的使用及革兰氏染色显微镜是研究微生物所必不可少的工具。
由于显微镜的发明，帮助人类揭开了微生物世界的奥秘。
随着科学技术的不断发展，光学显微镜已从利用可见光的范围扩大到利用紫外光源及非光源的电子显微镜，从而大大地提高了显微镜的放大率和分辨率。
当今微生物学实验室中最常用的是普通光学显微镜，无论是观察微生物的个体形态还是测量微生物细胞大小都必须使用它。
因此我们应了解显微镜的构造和原理，以达到正确使用和保养的目的。
除暗视野显微镜和相差显微镜可用于观察活的细菌细胞外，其他普通光学显微镜大都用来观察经染色后的细菌细胞，只有经过染色的细胞才能看清其形态和构造。
因此各种染色法也是微生物工作者应掌握的基本技术。
1普通光学显微镜的使用【目的】1．了解普通光学显微镜的构造和原理。
2．正确掌握使用显微镜的方法。
【概述】微生物是肉眼看不见的微小生物，必须借助光学显微镜和电子显微镜，才能观察到。
因此，显微镜是研究微生物最基本和最重要的工具之一。
所以，掌握显微镜的使用与维护是进行微生物实验研究的基本技能。
【普通光学显微镜的基本结构】普通光学显微镜由两大部分组成，即机械部分和光学部分。
机械部分包括镜座、镜臂、载物台及台上的标本推进器、镜筒、物镜转换盘、升降调节器等，其主要作用是支撑、固定镜头、调节物象焦距、搁置和移动标本。
光学系统包括反光镜（或电光源）、光圈、聚光器、物镜、目镜等，作用是收集光源并聚集于标本上，然后通过透镜放大成像，使人眼可以分辨在裸眼时不能看见的细节。
物镜一般有4×、10×、40×、100×（或90×）等几种。
100×的是油镜，是微生物实验最常用的物镜。
因为目镜多为10×，所以使用油镜观察标本时，放大倍数为1000×，可以将1μm左右的细菌放大至1mm左右。
1．机械装置(1)镜座和镜臂：它们是显微镜的基本骨架，起稳固和支持显微镜的作用。
微生物实验二细菌的简单染色和革兰氏染色_图文_图文
染色结果
金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果
染色结果
大肠杆菌革兰氏染色结果
染色结果
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果
四、实验结果
显微镜放大倍数＝物镜放大倍数×目镜放大倍数
绘图记录观察结果
思考题
1、在制作涂片中，为什么要进行固定这 一步？
2、革兰氏染色中哪一步关键，为什么？
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳 性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁 的结构和组成不同决定的。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂 结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用 乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红 )复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂 蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞 中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染 剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌 。
2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂
面染色1-2分钟。 5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的
水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 7、镜检：油镜观察并绘图。
二、实验原理---简单染色
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原 有的形。
二、实验原理---革兰氏染色
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染 色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
光学显微镜的使用及革兰氏染色法的实验收获
光学显微镜的使用及革兰氏染色法的实验收获
光学显微镜是一种常用的显微镜，用于观察微小物体的光学仪器。
使用光学显微镜时，首先需要将待观察的样品放置在载物片上。
然后，将载物片放置在显微镜的样品台上。
调节显微镜的照明系统，使样品得到适当的光源和光强。
接下来，调节目镜与物镜的对焦，使样品清晰可见。
通过调节物镜的倍率可以放大样品，并利用目镜观察样品细节。
革兰氏染色法是一种常用的细菌染色方法，用于区分细菌的形态特征。
革兰氏染色法包括以下步骤：
1. 取一片已涂制细菌液的载玻片。
2. 用火焰或消毒器加热使菌液固定在玻片上。
3. 滴加革兰氏染色液（由紫色的碘锕溶液和甲基紫溶液组成）在细菌上。
4. 具有吸附作用的碘锕溶液将染色液中的紫色结晶固定在细菌细胞质内。
5. 用洗涤溶液洗去多余的染色液。
6. 滴加酒精洗涤玻片，使染色细菌板根清晰可见。
7. 用洗涤溶液冲洗掉酒精，并使玻片表面干燥。
8. 傾倒碳素閃光粉從上方入光孔並從邊角掃入细菌上空显紫色。
9. 最后，用显微镜观察细菌的形态及染色情况，常见为革兰氏阳性细菌呈紫色，革兰氏阴性细菌呈红色。
革兰氏染色法的实验收获是区分细菌的形态特征。
通过革兰氏染色后，可以观察到不同类型的细菌细胞壁的反应，从而可以区分细菌属于革兰氏阳性细菌还是革兰氏阴性细菌。
这对于细菌鉴定和分类具有重要意义。
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实验二普通光学显微镜的使用及细菌的简单染色和革兰氏染色普通光学显微镜的使用
一、实验目的
以染色玻片及活菌为例，熟练掌握显微镜油镜的使用方法。
二、显微镜油镜使用的原理
1 普通光学显微镜的基本构造
（1）光学部分: 接目镜、接物镜、照明装置(聚光镜、虹彩光圈、反光镜等)。
它使检视物放大, 造成物象。
（2）机械部分: 镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。
它起着支持、调节、固定等作用。
2 显微镜的放大倍数和分辨率（1）放大倍数=接物镜放大倍数×接目镜放大倍数
（2）显微镜的分辨率：表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：
D=λ/2n·sin(α/2 )
式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。
λ：可见光的波长（平均0.55μm）
n: 物镜和被检标本间介质的折射率。
a：镜口角（即入射角）。
3 油镜使用的原理
油镜，即油浸接物镜。
当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。
若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。
三、实验材料
1 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、盖玻片、接种环、酒精灯等。
2 细菌三种形态的玻片染色标本。
3 培养12-18h的枯草芽孢杆菌。
四、实验方法与步骤
1 染色细菌玻片的油镜观查
（1）用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。
（2）调节光亮度。
（3）低倍镜观察：先粗调再微调至物象清晰。
（4）转入中倍、高倍观察，每一不只需调微调旋纽即可看到清晰的物象。
（5）油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，旋转转换器，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。
（6）绘出所观察到的细菌形态图像。
（7）、换片：另换新片观察，必须从（3）步开始操作。
（8）、用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去油镜头上的香柏油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。
2 活菌制片观察
取一张干净的载玻片，在其中央滴上一滴干净的蒸馏水，取培养12-18h的枯草芽孢杆菌一小环，在水滴上反复涂抹至菌体充分分散，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余的水分，按照油镜的使用步骤，观察草芽孢杆菌形态，边观察边绘图。
五、实验报告
油镜使用的原理
六、思考题
1 油镜与普通物镜在使用方法上有何不同？应特别注意些什么？
2 使用油镜时，为什么必须用镜头油？
3 镜检标本时，为什么先用低倍镜观察，而不是直接用高倍镜或油镜观察？
七、实验注意事项
1 不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。
2 镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度。
3 观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。
当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。
4 观察时，两眼睁开，养成两眼能够轮换观察的习惯，以免眼睛疲劳，并且能够在左眼观察时，右眼注视绘图。
5 拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。
6 显微镜应存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。
细菌的简单染色和革兰氏染色
一、实验目的
1 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法及革兰氏染色。
2 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、实验原理
1 简单染色的原理
大多数微生物细胞质是带负电荷，简单染色时采用已知的、带正电荷的碱性染料。
染料适用于热固定的涂片，染料与菌体细胞质黏附使菌体着色。
经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明对比。
2 革兰氏染色的原理
革兰氏阳性菌的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁的通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。
革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。
三、实验材料
1 大肠杆菌24h的斜面培养物。
2 葡萄球菌24h的斜面培养物。
3 简单染色液（美蓝染色液、黑色素液或炭素墨水）
4 革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石碳酸复红）
5 载玻片、盖玻片、接种环、镊子、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、蒸馏水等。
6 显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸等。
四、实验方法和步骤
1、简单染色
(1) 涂片:取两块干净的载玻片，各滴一小滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌于二载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。
注意滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。
(2) 干燥：自然气干或酒精灯高处微微加热。
(3) 固定:于火焰上通过2—3次。
(4) 染色：在整个涂面上滴加齐氏石炭酸复红，染色１分钟。
（5）水洗：倾去染液，用自来水细流冲洗至流下的水中无染料颜色为止。
（6）干燥：空气中自然干燥或在酒精灯高处微微加热。
（7）镜检：在油镜下观察细菌形态。
2革兰氏染色
（1）涂片。
（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
（3）媒染：先用新配的卢哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
（4）脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约30秒，后立即用流水冲洗。
（5）复染：滴加番红染色液，染1分钟，水洗后用吸水纸吸干。
（6）镜检：观察染色结果。
附1 细菌染色法分类
附2 微生物染色常用染料
A 酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑等。
B 碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。
C 中性（复合）染料：如伊红、美兰等，Wright染料和Gimsa染料等（常用于细胞核染色）。
D 单纯染色：这类染料物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudan b）的染料五、实验报告
1 革兰氏染色的基本原理和意义
2 革兰氏染色成败的关键
六、思考题
1 根据实验体会，你认为制备染色标本时，应注意哪些事项？
2 制片为什么要完全干燥后才能用油镜观察？
3 做革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？
4 当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠。