新编仪器分析第四版第三章分子发光分析法综述
分子发光分析法课件
1.5 激发光谱和发射光谱
荧光(磷光)：光致发光，照射光波长如何选择？
A.荧光(磷光)的激发光谱曲线
固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ） 。
激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光 强度最大；
B.荧光光谱(或磷光光谱)
固定激发光波长( 选最大激发波长), 化 合物发射的荧光(或磷 光强度)与发射光波长 关系曲线(图中曲线II 或III)。
Chemiluminescence
2.1 概论
化学发光是由化学反应提供的能量激发物质所产生的光 辐射。
优点：(1). 灵敏度很高。(2). 仪器设备简单，无须光源和 单色器，因而也消除了散射光和杂散光的干扰；(3). 线性范 围宽；(4). 分析速度快。
局限：目前可供应用的发光体系尚有限，发光机理有待 进一步研究，方法的选择性有待进一步提高。
1.6 荧光(磷光)强度与溶液浓度的关系
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia ) 及
荧光量子产率(Фf）有如下关系
If = f Ia
由Lambert-beer定律及吸收光强度的概念，可 推导出，当bc ≤0.05时，有：
If = 2.303 f I0 bc 与荧光类似，溶液的磷光强度(IP)与低浓度下磷 光物质浓度之间的关系可表示如下：
剂在液氮温度下应具有足够的黏度并能形成明净的 刚性玻璃体，且对分析物具有良好的溶解特性，在 所研究的光谱区内没有很强的吸收和发射，并容易 制备和提纯。
B. 室温磷光分析
固态基质表面室温磷光分析：分析物通过物理吸附或某 种化学作用力被束缚在固体基质表面，增大了刚性，减小了 碰撞失活的概率，在严格干燥试样的情况下限制了氧的猝灭 作用，显示室温磷光。
分子发光分析法总结
第12章分子发光分析法12.1.0发射光谱物质通过电致激发、热致激发或光致激发等激发过程获得能量，变为激发态原子或分子M*，当从激发态过渡到低能态或基态时产生发射光谱，多余能量以光的形式发射出来：M*→M+hν通过测量物质的发射光谱的波长和强度来进行定性和定量分析的方法叫做发射光谱分析法。
分子荧光和磷光分析法属于发射光谱法。
12.1.1分子荧光和磷光分析法1.荧光和磷光的产生1)Jablonski能级图2)多重度：M=2s+1（s为电子自旋量子数的代数和，其值为0或1）单重态（S）：分子中全部轨道里的电子自旋配对，即s=0，M=1三重态（T）：电子在跃迁过程中自旋方向改变，分子中出现两个自旋不配对的电子，即s=1，M=3三重态能级比相应单重态能级略低。
3)去活化：处在激发态的不稳定分子返回基态的过程。
振动弛豫：分子吸收光辐射后从基态的最低振动能级跃迁到激发态的较高振动能级，然后失活到该电子能级的最低振动能级上。
内转换：相同多重度等能态间的无辐射跃迁。
外转换（猝灭）：激发分子通过与溶剂或其他溶质间的相互作用导致能量转换而使荧光或磷光强度减弱或消失。
系间跨越：不同多重度等能态间的无辐射跃迁。
荧光发射：单重激发态最低振动能级至基态各振动能级的跃迁。
磷光发射：三重激发态最低振动能级至基态各振动能级的跃迁。
2.激发光谱和发射光谱及其特征激发光谱：以激发波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。
发射光谱：以发射波长为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。
荧光发射光谱的特点：1)Stokes位移：在溶液中，分子荧光的发射峰相比吸收峰位移到较长的波长。
2)荧光发射光谱与激发波长的选择无关。
3)镜像规则：荧光发射光谱和激发光谱镜像对称。
12.1.2荧光量子产率和分子结构的关系荧光量子产率（荧光效率/量子效率）：表示物质发射荧光的能力，荧光量子产率与分子结构的关系：1.跃迁类型物质吸收紫外-可见光发生π→π*或n→π*跃迁，然后经振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生π*→π或π*→n跃迁而产生荧光。
仪器分析作业03参考答案(第三、五章紫外可见分光光度法+分子发光分析法)华南理工大学仪器分析
01. 溶液有颜色是因为它吸收了可见光中特定波长范围的光。
若某溶液呈蓝色，它吸收的是什么颜色的光？若溶液无色透明，是否表示它不吸收光？答：溶液呈蓝色，表明其吸收了蓝光的互补光，即黄光（若答是吸收了黄光外的所有可见光，不能说错，但是这样的情况过于巧合，少见！）。
若溶液无色透明，仅能说明其不吸收可见波段的光。
2. 分别在己烷和水中测定某化合物UV-Vis 光谱，发现该化合物的某个吸收峰由285 nm （己烷）蓝移至275 nm （水），（1）判断产生该吸收峰的跃迁类型；（2）试估算该化合物与水生成氢键的强度。
答：（1）溶剂极性增大，λmax 蓝移，表明该吸收峰是由n →π*跃迁产生的。
（2）()()⎪⎪⎭⎫⎝⎛λ-λ⋅⋅=己烷氢键max O H max A 11hc N E 2 ⎪⎭⎫ ⎝⎛⨯⨯⨯⨯⨯⨯⨯⨯=--99834-23102851-102751100.31063.61002.61mol J 28.15-⋅=3. 按从小到大顺序对下列化合物的λmax 排序，并简单说明理由（不要想得太复杂）A. NO 2B. NO 2t-C 4H 9t-C 4H 9 C.NO 2CH 3 D. NO 2C 2H 5答：B<D<C<A （空间位阻依次减小，共轭程度依次增加，λmax 红移）4. 某化合物分子式为C 10H 16，用其他仪器方法已经证明有双键和异丙基存在，其紫外光谱λmax =230 nm （ε=9000），1mol 该化合物只能吸收2 mol H 2，加氢后得到1-甲基-4异丙基环己烷，试确定该化合物的可能结构。
答： 1mol 该化合物只能吸收2 mol H 2，且其紫外光谱λmax =230 nm （ε=9000）可知该化合物含两个共轭但非同环双键（同环共轭双键基值为253 nm ）；该化合物含异丙基（双键不会出现在异丙基上），根据加氢后产物结构可推出该化合物可能结构如下：根据Woodward 规则可计算出该化合物的λmax =214+5（环外双键）+5⨯2（烷基取代）=229 nm ，与所测值相符。
分子发光分析法1
第一节 分子发光分析概述 第二节 荧光光谱法的基本原理 第三节 荧光分析仪器 第四节 荧光分析方法及其应用
第一节 分子发光分析概述
• 荧光（fluorescence）现象的第 George Gabriel Stokes (1819-1903) 一次记录： 1575年，西班牙内科医生和植 物学家N. Monardes，观察到 Lignum Nephriticum木头切片 的水溶液呈现天蓝色。 • 第一次被提议用于分析： 1864年，Stokes • 第一次用于分析： 1867年，Goppelsrö der根据 Al-桑色素配合物的荧光，建立 了Al 3+的荧光测定方法。
荧光量子产率与激发态能量释放各过程 的速率常数有关，凡是能使荧光速率常数升 高而使其它过程速率常数降低的过程，均能 提高量子产率。 Φ=
k f ki
kf
kf：荧光发射过程的速率常数，取决于化学结构。 Σki：其他有关过程（内转移、系间窜跃、外转移） 的 速率常数的总和。由化学环境和结构共同决定。
系间跨越
发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如 从S1到T1，该跃迁是禁阻的。 但当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时， 处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生 变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射 跃迁 S1 → T1
二、激发光谱曲线和荧光光谱曲线
1、荧光(磷光)的激发光谱曲线与发射光谱曲线
• 符号S0、S1、S2分别表示基态单重态，第一和第二电子 激发单重态；T1和T2分别表示第一和第二电子激发三重 态。 • 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相 应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态。
3、激发态→基态的能量传递途径
分子发光分析法
分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。
依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。
光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。
本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。
第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。
这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。
到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。
斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。
1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。
进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。
荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。
虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。
使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。
二、基本原理(一)分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子。
根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。
当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。
分子发光分析法
H C H C
C H C H
φF=0.75
φF=0.03
反式二苯乙烯 强荧光物质
平面构型
顺式二苯乙烯 非荧光物质
非平面构型
空间位阻对荧光发射的影响
立体异构体对荧光发射的影响
小结
强荧光的有机化合物具备下特征: • ①具有大的共轭π键结构； • ②具有刚性的平面结构； • ③具有最低的单重电子激发态为S1为 π * →π型； • ④取代基团为给电子取代基。
④火焰化学发光 a．一Βιβλιοθήκη 化氮在富氢火焰上燃烧时产生强的火焰化
学发光；二氧化氮事先还原为一氧化氮。
H＋NO→HNO＊ HNO＊→HNO＋hν（660~770nm） b．挥发性硫化物（SO2、H2S、CH3SH、 CH3SCH3等）在富氢火焰上产生蓝色发光。 SO2＋H2→S＋H2O S＋S→S2＊ S2＊→S2＋hν（350~460nm）
光学分析法
光谱法 原子光谱法 原 子 吸 收 光 谱 法 原 子 发 射 光 谱 法 分子光谱法 紫 外 可 见 分 光 光 度 法
非 光 谱 法
红 外 光 谱 法
分 子 发 光 分 析
分子发光分析法
物质的分子吸收一定的能量后，其电子 从基态跃迁到激发态，如果在返回基态 的过程中伴随有光辐射，这种现象称为 分子发光 (molecular luminescence)，以 此建立起来的分析方法,即利用物质分 子被激发后具有激发发光特性建立的分 析技术，称为分子发光分析法 分子发光分析法。 分子发光分析法
式中：F：荧光强度 K：仪器常数 Φ：样品的荧光效率 I0：激发光强度 ε：是物质的摩尔吸光系数 C：物质浓度 L：样品池的光径
荧光与化学结构的关系
仪器分析8张
取代基的影响
卤素取代基随卤原子序数增加荧光 减弱和磷光增强。所谓“重原子效应” 使系间窜跃速率增加所致。重原子中， 能级之间的交叉现象比较严重，容易发 生自旋轨道的相互作用，增大S1→T1系 间窜越的概率。
最低电子激发单重态的性质
比较π→π*或 n→π*跃迁：π→π*是自 旋许可的跃迁，摩尔吸收系数大，约为104， 激发态的寿命短，S1→T1系间窜越的概率较 小；n→π*属自旋禁阻的跃迁，摩尔吸收系 数小，约为102，S1→T1系间窜越的概率大， 激发态的寿命较长。因此π→π*跃迁将产生 更强的荧光，而n→π*跃迁相对有利于磷光 的产生。
碰撞猝灭
kf、kQ为相应的反应速率常数
荧光猝灭程度取决于 kf 和 kQ 相对大小 及猝灭剂的浓度。 碰撞猝灭还与溶液的黏度有关
碰撞猝灭将随温度升高而增加。
能量转移
猝灭剂与处于激发单重态的荧光作用 后，发生能量转移，使猝灭剂得到激发， 其反应如下：
M Q M Q
*
*
氧的猝灭作用
激发光谱和发射光谱
固定荧光或磷光的发射波长（或测定波长） 而不断改变激发光（即入射光）的波长，并记 录相应的荧光或磷光强度，所得到的发光强度 对激发波长的谱图称为荧光或磷光的激发光谱。
固定激发光的波长和强度而不断改变荧光 或磷光的测定波长（或发射波长） ，并记录相 应的荧光或磷光强度，所得到的发光强度对发 射波长的谱图则为荧光或磷光的发射光谱。
荧光寿命（τf ）：荧光分子处于 S1 激发态的平均寿命。 τf = 1/（k f +∑K） k f 表示荧光发射过程的速率常数， ∑K 表示各种分子内的非辐射衰变过 程的速率常数的总和。
荧光、磷光寿命和量子产率
磷光寿命（τp）：磷光分子处于 T1 激 发态的平均寿命。 荧光、磷光强度的衰变遵循以下方程 式： ln I0－ ln It ＝t /τ
新编仪器分析第四版第三章分子发光分析法
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
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光源 第一单色器 或滤光片
激发
F
记录仪
荧光 第二单色器 或滤光片
固定 ex 激发光波长
样品池
em
21
（2）荧光光谱的特性
a.发射光谱的形状与激发波长无关
分子无论被激发到哪一个激发态，最终均回到第一激发 单重态的最低振动能级再回到基态，产生分子荧光。 b.荧光光谱与吸收光谱有镜像关系 荧光发射光谱与它的吸收光 谱（与激发光谱形状一样） 成镜像对称关系 基态上的各振动能级分布与 第一激发态上的各振动能级 分布类似；
2）内转换（IC） 同一多重态的不同电子能级间振动能级部分重 叠，电子由高电子振动能级转移到低电子振动能
级的过程。产生时间10-11~10-13s
9
10
3）系间窜跃(ISC)
不同多重态间有振动能级的重叠，分子由激 发单重态（S1）跨越到激发三重态(T1)的过程， 电子需要自旋反转。所需时间10-6s
13
14
由于振动弛豫和内转换损失部分能量， 发射荧光的能量比激发光的能量小，波长要长，
这种现象称为斯托克斯位移（Stokes shift）
s 10 (
7
1
ex
1
em
)
λex—最大激发光波长； λem—最大发射光波长
斯托克斯位移越大，激发光对荧光测定的干扰越小
15
（2）分子磷光
受激分子降至S1最低振动荧光和磷光的产生及类型 （1）分子荧光
瞬时荧光(快速荧光)
分子由第一激发单重态（s1）的最低振动能级→单重基态(s0) 所产生的辐射光。为单重态间的跃迁，概率大，过程快10-8s
延迟荧光
分子跃迁至第一激发三重态（T1） 碰撞
激活
第一激发单重态（S1）
振动弛豫
单重基态(s0)
荧光
S1的最低振动能级
24
四、荧光强度的主要影响因素
1.荧光强度与浓度
荧光体浓度很稀
I f Kc
K K f I 0 b
荧光分析适用于微量组分或痕量组分分析
25
2.荧光与分子结构
1）共轭π键体系
跃迁类型：π* →π的荧光效率高，提高共轭度有利于 增加荧光效率，环越大，红移程度越大，发光越强
26
2）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂 的相互作用，故具有很强的荧光。
1、电子自旋状态的多重性
π* n π* n π π*→n π* n π π*→ π 单重态S S=0 M=2S+1=1
总 自 旋 量 子 数
π 激发单重态 S=0 M=2S+1=1
π* n π
π* n π
三重态T
S=1 M=2S+1=3
5
S2 S1
S2 S1 S0 单重第二激发态S2
S0
S2 S1 S0 单重基态S0 T2 T1 单重第一激发态S1
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
1→ 2
1→1 1→ 1
4 3 2 1
S0
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
T2
T1
S0
第一激发三重态 T1 能量： S2 ＞T2 ＞ S1 ＞ T1 ＞ S0
S0
第二激发三重态T2
6
hγ（荧光）
10-8s 几率小（禁阻）
hγ（磷光）
10-4~10s 能量： S2 ＞T2 ＞ S1 ＞ T1 ＞ S0
7
2、无辐射跃迁
辐射跃迁
8
1）振动弛豫（VR）
在同一电子能级内，激发态分子通过与周围分子碰 撞而将多余能量以热的形式传递给周围分子，自身由 高振动能级回到低振动能级的现象。产生时间10-12s
无荧光
发荧光
27
3）取代基效应
给电子取代基-OH,-CN，-NH2等，可扩大共轭双键体系加强荧光
得电子取代基=C=O, -NO2 -COOH，-SH等减弱荧光，加 强磷光。 重原子效应：芳环上取代F、Cl、 Br、I之后，系间窜跃加强，荧光 强度随卤素原子量增加而减弱，磷 光则增强。
光致发光（PL）
分子荧光 分子磷光
M+ h →M＊
h ’
分类
化学发光（CL） 电致发光（EL） 生物发光（BL）
M
高能态（激发态）Ei 吸收 发射
h
h ’
低能态（基态）E0
3
本章重点
掌握分子荧光分析法、化学发光分析法 了解生物发光分析和分子磷光分析
4
第二节 分子荧光分析法
一、分子荧光和磷光的产生
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
ex =290nm (MAX)
em= 620nm(MAX)
23
三、分子荧光的参数
1.荧光寿命τ
处于激发态的荧光体返回基态前停留在激发态的平均时间，
处于激发态的分子数目衰减到原来的1/e所需要的时间 2.荧光量子产率
发射荧光的光子数 f 吸收激发光的光子数
f
Kf K
Kf
0＜ Фf ＜1
振动弛豫
系间窜跃
单重基态(s0)
磷光
T1的最低振动能级
电子改变自旋，且在亚稳态T1停留较长时间以及分子碰撞能量 损耗大。磷光能量更低，波长更长。发光速度很慢： 10-4～10s
16
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320 380 440 500 560 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
样品池
ex
19
（2）激发光谱的特点
a.不论第二单色器选择何处作为固定测定波长，不
影响谱线的形状
b.激发光谱与该物质的吸收光谱非常近似，同一物
质最大激发波长与最大吸收波长一致。
20
2、荧光发射光谱（荧光光谱） （1）荧光光谱的测绘 固定第一单色器，保持激发光的波长和强度，
改变第二单色器，测定发射的荧光在各个波长下的相对强度，
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。