多标记免疫荧光染色
免疫荧光双标操作方法及注意事项
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。
(1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。
直接法简便可靠，但灵敏度较低。
(2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。
使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。
免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。
2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。
3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。
4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。
条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。
6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。
二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。
2、每次试验均需设置以下三种对照：(1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物;(2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物;(3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。
三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。
免疫荧光双染
免疫荧光双染 Revised by Hanlin on 10 January 2021免疫荧光双染在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。
双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。
冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液（蛋白酶K储存液用PBS?1:9稀释）覆盖组织，37度温箱孵育30min。
将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1(TdT)和试剂2(dUTP)按2:29混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。
（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。
去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
免疫荧光染色(多标)步骤
免疫荧光染色(多标)步骤一、免疫荧光染色的多标技术简介免疫荧光染色的多标技术是通过同时使用多个荧光染料，标记不同的抗体，从而实现对多个目标分子的检测。
该技术广泛应用于生物医学研究、免疫组化和细胞生物学等领域，可以提供更全面的信息和更准确的结果。
二、免疫荧光染色的多标步骤免疫荧光染色的多标步骤主要包括标本处理、抗原修复、非特异性结合阻断、一级抗体处理、荧光二抗处理和显微镜观察等。
1. 标本处理将待检样品制备成组织切片或细胞涂片，并固定在载玻片上。
可以使用多种组织固定剂，如乙醛、甲醛等。
固定后，需进行脱水、透明化处理，以便后续步骤的进行。
2. 抗原修复组织样本经过固定处理后，可能导致抗原的空间结构发生改变，影响后续的抗原-抗体结合。
因此，需要进行抗原修复处理，如热解、酶解等方法，以恢复抗原的免疫原性。
3. 非特异性结合阻断为减少假阳性结果的产生，需要对标本进行非特异性结合阻断。
可使用一些蛋白质，如牛血清蛋白、鱼胶蛋白等，与标本中的非特异性结合位点结合，阻断后续试剂的非特异性结合。
4. 一级抗体处理将标本与一级抗体一起孵育，使一级抗体与目标抗原结合。
一级抗体通常是由小鼠、兔子等动物制备的，可以识别与特定抗原结合的抗体。
一级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
5. 荧光二抗处理将与一级抗体不同动物来源的荧光标记的二级抗体与标本一起孵育。
荧光二抗能与一级抗体特异性结合，从而实现对目标抗原的荧光标记。
不同荧光染料的荧光二抗可以同时使用，以实现多标的目的。
6. 显微镜观察将处理好的标本放置在显微镜下观察，可使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等设备进行观察。
通过不同的荧光染料，可以同时检测多个目标分子的位置和表达水平。
三、免疫荧光染色的多标技术应用免疫荧光染色的多标技术广泛应用于生物医学研究中，如疾病诊断、蛋白质定位和分析、细胞信号通路研究等。
通过同时检测多个目标分子，可以提供更全面的信息，有助于深入了解生物过程的机制。
双标记免疫荧光染色
双标记免疫荧光染色一、实验目的：1.检测MT, IGF-1/FGF5与两个目的基因所表达的蛋白的共表达。
2.检测目的基因所表达的蛋白定位。
3.检测褪黑激素或细胞因子对目的基因高表达的影响以及表达规律。
二、实验材料：1.试剂：多聚甲醛，目的基因一抗，自带荧光的二抗（地高辛－地高辛抗体，生物素－链霉亲和素）细胞核染料DAPI2. 器材：激光共聚焦显微镜显微镜专用玻片，共聚焦专用培养皿。
三、实验步骤：1.细胞培养：取对数期细胞于6孔板培养24小时，放入共聚焦专用玻片，贴壁细胞爬片需要24小时，细胞数目达到4×104个细胞，设置两个以上六孔板分别为对照组和实验组；2.实验组加药处理：加入MT或IGF-1或FGF5处理24小时或48小时，72小时。
3.上镜前处理：将玻片取出，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15min；PBS洗多次，加0.1%Triton-X100透化10min；PBS洗3次，5%FBS室温封闭一到数小时；PBS洗3次，将MT、FGF-5、IGF-1抗体(1：200)和目的基因(工作液)两两组合，共六组，按体积比1：1混匀，一起加到切片上，4℃过夜；第二天，PBS洗3次，加入荧光二抗[加入TRITC(罗丹明)标记羊抗兔IgG(1：100)；37℃孵育30 min；加人FITC标记山羊抗鼠IgG(1：100)]，室温避光45min；（之后均为避光操作）PBS洗3次，加入核染料，n分钟；PBS洗3次，灭菌水洗2次；取处理好的载玻片，写好组别，在正中央滴约30ul防猝灭剂，小心将盖玻片夹起，缓慢放下，不要产生气泡，避光晾干。
以PBs代替一抗作为阴性对照，省略一抗作空白对照。
4.镜检四、结果预测：1.共表达：两个基因分别为阳性红色，绿色。
共表达出现红绿重叠而呈现黄色荧光，显示蛋白定位。
2.正负表达：看荧光强弱。
免疫荧光染色方法介绍
细胞免疫荧光-多重染色1. 原理介绍我们现在来考虑一下多重染色。
使用多个标签进行免疫染色的目的，是在同一细胞或组织切片里，同时对两个或多个抗原进行染色定位。
各个抗原分别使用不同的标签，以便区分。
抗原可以是共定位的，即它们的亚细胞定位一致，或者是分开的。
荧光的作用原理。
荧光分子能吸收特定波长的光，然后发射更长波长的光。
在发出荧光之前，荧光分子跟环境相互作用失去能量，从而达到这一目的，这一现象叫内转换。
电子可以是基态或静止态 S0，也可以是较高能量的激发态 S1 和 S2。
在每一个电子态，荧光染料存在的振动能级可以有多种，包括 0 级、1 级和 2 级。
室温下，能量不足以使电子激发到激发态 S1 和 S2 或基态的较高振动能级。
所以，只有当光存在时，吸收才发生在振动能态最低的分子上。
荧光染料在吸收光后，通常被激发至一个较高的振动能级 S1 或 S2，然后再回到S1的最低振动能级，从而完成内转换过程。
此过程与光子发射过程结合形成荧光。
荧光染料可多次重复这一激发发射循环，直至荧光消失，也就是光漂白。
相较而言，有些荧光素更容易发生光漂白。
例如，FITC 重复激发发射循环约 30000 次后发生光漂白。
而第二代荧光染料，如 Alexa Fluor® 系列的光漂白没有这么快，由于它们有较高的消光系数，比较明亮，更适合用于多标记实验，如本幻灯片图像所示常用到的一种传统染料的组合是：DAPI 蓝色染料、FITC 绿色染料、TRITC 黄色染料和 Cy5® 红色染料。
而相应的第二代染料组合是：DAPI 蓝色染料、Alexa Fluor® 488 绿色染料、Alexa Fluor® 555 黄色染料和 Alexa Fluor® 647 红色染料设计荧光多重标记实验时，可以采取以下几个步骤，以最大限度的减小或消除串色现象。
首先，分析待选荧光素的吸收光谱和发射光谱，结合显微镜滤光片组的特点，评估是否兼容。
免疫荧光双标原理
免疫荧光双标原理免疫荧光双标原理是一种生物分子标记技术，主要用于分析和检测细胞和组织中的蛋白质等分子。
该技术结合了免疫学和生物荧光学的原理，基于细胞或组织中特定分子与特异性抗体结合的反应，将其标记荧光染料，从而实现对细胞或组织中分子的探测和定位。
免疫荧光双标原理的基本步骤包括抗体标记、标本制备、光学检测和数据分析等几个方面，下面将逐一介绍。
1. 抗体标记抗体标记是免疫荧光双标技术中最关键的一个环节。
通常采用的方法是将荧光染料与抗体分子关联，制成荧光标记的免疫调控试剂盒。
这些试剂通常被称为“荧光标记抗体”，标记染料有多种不同的荧光颜色，以适应不同的检测需求。
标记抗体的荧光染料通常是有机染料或金属螯合剂，如罗丹明（Rodamine）、荧光素（Fluorescein）和荧光钴（Fluorescent Co）等。
2. 标本制备标本制备是免疫荧光双标技术中的一个关键步骤，它决定了标本质量的好坏。
通常先将标本切片或离心，然后用甲醛或其他交联剂固定细胞和组织样品，使其保持原来的形态，并同时固定荧光抗体标记。
之后，需要将细胞膜孔洞或核孔进行透射和渗透，以使标记分子能够穿过细胞膜，进入细胞内部或核内。
这样，形成的免疫荧光双标标本就可以被用于后续的检测和分析。
3. 光学检测光学检测是免疫荧光双标技术中的另一关键步骤。
它利用激光束或正常的光源激发标记染料产生荧光，从而实现对标本分子的检测和分析。
光学检测通常基于荧光显微镜、光谱仪或光电显微镜等设备，这些设备可以直接观察和记录样品中的荧光信号，获取图像信息和/或光谱数据。
4. 数据分析数据分析是免疫荧光双标技术中的最后一个步骤。
它涉及对荧光信号数据的处理和解释，以提取有用的生物学信息。
数据分析通常基于计算机软件，可以将荧光信号转化为图像、数字和/或图形表示，以实现对标本中分子数量、定位和相关性的计算和分析。
总之，免疫荧光双标技术是一种高灵敏度、高精度、高通量的生物分子探测和定位技术，已广泛应用于细胞和分子生物学研究、临床诊断和药物研发等领域。
免疫荧光单标记和双标记的方法
免疫荧光单标记和双标记的方法免疫荧光单标记和双标记的方法l免疫荧光单标记方法免疫荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。
但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。
具体染色方法如下。
1)所需材料与试剂(1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60％一70％的细胞。
(2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗。
(3)4％多聚甲醛固定液或冷丙酮固定液(一20℃预冷20min)。
(4)封闭液。
(5)0．01mol／LPBS缓冲液。
2)染色方法(1)取出培养有细胞的盖玻片或glass—bottom培养皿，用0．01MPBS洗2—3遍。
(2)加入0．3％的TritonX—100，37℃，30rain。
(3)加入4％多聚甲醛室温固定30min或冷丙酮4℃固定10min。
(4)正常阻断血清1：20封闭室温20～30min，抑制IgG的非特异性结合。
阻断血清必须选择与二抗同一种属的正常血清。
(5)去掉正常血清，直接加入一抗，37C孵育1h或4℃过夜。
抗体以0．01mol／LPBS稀释(理想的抗体浓度需经试验而定)。
(6)0．3％TritonX—100洗5min，0．01mol／IPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01MPBS洗5rain。
(7)加入FITC—二抗或TRITC—二抗，37℃，孵育1h。
(8)0．3％TritonX—100洗5rain，0．01mol／LPBS洗5min，0．3％TritonX 5min，0．01mol／LPBS洗5mln，用滤纸吸干。
(9)90％甘油(PBS配制)封片。
(10)激光扫描共焦显微镜下观察，或于4℃避光保存。
2．免疫荧光双标记方法免疫荧光的双标记是指同时标记细胞内两种蛋白质分子，当怀疑某种配体与已知受体结合后可用此方法加以证明。
此方法稍微复杂一些，首先应注意所用的一抗必须是来自不同种属动物的两种特异性抗体(例如：A抗体为多克隆抗体，来自家兔；B抗体为单克隆抗体，来自小鼠)。
三重免疫荧光染色原理
三重免疫荧光染色原理
三重免疫荧光染色是一种用于检测细胞或组织中多种蛋白质表达的方法。
其原理是利用多种荧光标记的抗体同时与待检测的蛋白质结合，通过荧光显微镜观察不同荧光标记的抗体在细胞或组织中的分布情况，从而实现对多种蛋白质的定位和表达水平的检测。
在进行三重免疫荧光染色时，首先需要选择适当的一抗（primary antibody），这是针对待检测蛋白的特异性抗体，它将与待检测蛋白结合。
然后使用不同荧光标记的二抗（secondary antibody）结合到一抗上，这些二抗将分别与不同颜色的荧光染料结合。
最后，通过荧光显微镜观察样品，可以根据不同颜色的荧光信号来确定不同蛋白质的位置和表达水平。
三重免疫荧光染色的原理基于多种抗体和荧光标记的选择，以及对不同荧光信号的识别和分析。
通过合理设计实验方案和选择合适的抗体和荧光标记，可以同时检测多种蛋白质在细胞或组织中的表达情况，为细胞生物学和病理学研究提供重要的信息。
总的来说，三重免疫荧光染色原理是利用多种荧光标记的抗体同时与不同蛋白质结合，通过荧光显微镜观察不同荧光信号的位置
和强度，从而实现对多种蛋白质的定位和表达水平的检测。
这种方法在细胞生物学和病理学研究中具有重要的应用意义。
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多标记免疫荧光染色+多光谱采集技术的优势
多重免疫组化技术优点多多：
1，有助于转化医学的研究；
2，最大限度的从样本中获取至关重要的信息，尤其是组织样本很少时；
3，相比于其它方法，能更好的分析组织样本中多重靶标的共表达及空间信息；
4，信号显著增强，从而可以检测低表达的靶标；
5，无需考虑一抗种属及isotype，实验灵活设计。
话不多说，直接给大家展示一张可以呈现7个靶标染色的mIF结果图：Opal是一套基于酪酰胺信号放大技术(TSA，TyramideSignal Amplification)的多标记免疫组化染色方案，为组织样品特别是FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)样品进行染色，并且允许同一样本中使用同一种属来源的不同一抗进行多标记复合染色。
并且，配合多光谱成像分析系统，可以获得高信噪比(扣除背景自发荧光)的图像，甚至是多达7种标记的同步染色和共定位及定量分析。