转基因拟南芥培养
黄瓜转基因新方法
1、黄瓜无菌苗的培养2、外植体及预培养：取培养3-4d直立未张开的子叶,切去生长点和上部2/3的子叶,留取下部的1/3子叶节为外植体进行预培养。
预培养的培养基为MS+6-BA 1.0 mg/ L,预培养时间为1d。
预培养的培养基为MS+6-BA 1.0mg/L,预培养时间为1d。
3、农杆菌菌液的制备（MS液体培养基pH =5.2）4、微伤口处理及侵染：用刀片在子叶节的正表面轻划,制造微伤口,然后将子叶节投入悬浮好的菌液中。
侵染,侵染时间为20 min,期间轻摇几次。
5、共培养及洗菌处理：用滤纸吸去子叶节上多余菌液,转接到共培养培养基上,共培养培养基MS+6-BA 1.0mg/ L，pH 5.2, 26℃暗培养2-3d至有微菌落产生。
取出用含cef 500mg/L的无菌水洗4-5次(摇床，第一次30min，后面每次5min，200转)，捞出后用滤纸吸干水,转接到含有Hyg10mg/L或Glu2.5mg/L的选择培养基上筛选培养。
6、选择培养与植株再生;选择培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+AgNO3 2.0mg/L+Hyg10mg/L(或Glu2.5mg/L)+cef 500 mg/ L，pH =5.8。
每7d继代培养1次, 有丛生芽生出后, 将其切下,转入1/ 2 MS生根培养基,再生成完整植株。
1、黄瓜无菌苗的培养2、外植体及预培养自子叶身与子叶柄交界处切下子叶，在子叶中部横切成上（远轴端）、下（近轴端）半叶，弃去上半叶，在下半叶的中间纵切将子叶一分为二，或将下半子叶切去边缘，成5mm正方形子叶小切块，获得外植体。
子叶切块接入预培养基（MS+6-BA 0.5mg/ L+NAA0.5 mg/ L，pH 5.2）中，25℃，预培养2d。
2、农杆菌菌液的制备（MS液体培养基pH =5.2）。
3、侵染将子叶切块投入悬浮好的菌液中侵染，时间为20 min，期间轻摇几次。
用无菌滤纸吸干菌液，再接入预培养基中，黑暗条件下28℃共培养2~3天，至长微菌斑，洗菌，转接入诱导黄瓜愈伤组织的Hyg 5mg/L或Glu1.0mg/L筛选培养基(MS+6-BA 0.5mg/ L+NAA0.5 mg/ L+Hyg 5mg/L(或Glu1.0mg/L )+Cef 400 mg/ L，pH =5.8) 中，暗培养15-20天，观察有无抗性愈伤组织形成，有抗性愈伤组织生成，则将抗性愈伤组织转接入含Hyg 5mg/L或Glu1.0mg/L诱芽培养基(MS+6-BA 0.5mg/ L +AgNO3 2.0mg/L +Hyg 5mg/L(或Glu1.0mg/L )+Cef 400 mg/ L，pH =5.8)中培养，有抗性芽形成，待长到2-3cm时，切下转入生根培养基中生根，再移到土里。
拟南芥的遗传转化
XU E SHU TA N TA O学术探讨拟南芥的遗传转化河南农业职业学院刘晓丽魏楠摘要：通过构建重组表达载体，转化农杆菌制作浸染液，实现农杆菌介导法进行目的基因的拟南芥遗传转化，将目的基因转入到野生型拟南芥中。
通过筛选和鉴定后，得到阳性的转基因植株，最终得到纯合T3代转基因株系。
后续可以通过对纯合转基因株系和野生型拟南芥进行比较鉴定，即可推断目的基因在拟南芥中的功能。
关键词：拟南芥；遗传转化；实验一、实验材料（一）试验材料转基因所需的菌株：农杆菌EHA105；转基因所需的模式植物：野生型拟南芥；转基因所需的植物表达载体：pCAMBIA3301。
（二）试验试剂本实验所需试剂主要有：Mu⁃rashige Skoog（MS）培养基：M519（Phyto Technology Laboratories，LLC）；YEB、YEP液体培养基；YEP固体培养基；抗生素氯霉素（chlorampheni⁃col，Chl）、卡那霉素（kanamycin，Kan）；草铵膦（phosphinothricin，PPT）；v／v（1∶5）的次氯酸钠溶液；琼脂；蔗糖；表面活性剂silwet L－77等。
二、实验方法（一）超表达载体的构建采用质粒小提试剂盒提取扩增、测序结果均正确无误的pGM－T－目的基因的质粒，具体步骤如下：第一，取2ml过夜培养的含目的基因的大肠杆菌Trans5α转化菌液，12，000rpm 离心1min，吸除上清；第二，向留有菌体沉淀的离心管中加入150μl溶液P1（已加入RNase A和0.5％的TIANRed），使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；第三，向离心管中加入150μl溶液P2，温和地上下翻转6～8次，使菌体充分裂解；第四，向离心管中加入350μl溶液P5，立即快速地上下颠倒12～20次，充分混匀，将出现絮状沉淀，然后，12，000rpm离心2min；第五，将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。
6、GFP转基因拟南芥的筛选及荧光观察
卡那培养基上筛选tubulin-GFP转基因幼苗
生长一个月左右的GFP转基因植株
体式荧光显微镜观察GFP转基因植株
Bars= 100 μm
CONFOCAL荧光显微镜观察GFP-TUBULIN 在气孔保卫细胞中的定位
材料与试剂
• 材料：野生型拟南芥种子WT、 GFP转基因拟南芥种子
• 试剂：
75％乙醇； 50％84消毒液； 无菌水； MS培养基；
。 MS+kan(卡那霉素）培养基 1ml 移液器
实验操作注意事项： • 严格无菌操作！ • 消毒过程动作要快！ • 枪头不要重复使用，物品不要拿出超净 台！ • 点种时每个位置尽量只点一颗种子！ • 操作时尽量避免说话和人员走动！ • 注意小组内的配合和小组间的协调！
种子消毒及播种实验流程 （超净工作台中完成所有步骤）
1. 将培ห้องสมุดไป่ตู้皿做好标记， 2. WT和GFP两种类型的种子已春化（ 置于4℃冰箱48h）（已
做）； 3. 用1 ml量程的移液器去掉EP管中的ddH2O，加入新的500 ul
ddH2O ，再加入500ul 84消毒液，混匀；颠倒数次，孵育6 min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 4. 1 ml无菌ddH2O水，洗3遍后，去上清 5. 最后加入200 μl ddH2O 6. 用移液器吸取单颗种子，将种子点在培养基表面（每皿4-5 颗种子 尽量均匀）； 7. 封膜，正置平放于培养架上培养。
实验六、八
GFP转基因拟南芥的筛选及荧光观察
2019-11-13
实验六 拟南芥种子消毒及无菌培养
实验目的
1.建立无菌实验操作的概念； 2.掌握植物（拟南芥）无菌培养的方法。
GFP报告基因
转基因拟南芥步骤
转基因拟南芥步骤
转基因拟南芥啊，这可是个挺有意思的事儿呢！咱就一步步来瞧瞧。
首先呢，你得有拟南芥，这就好比做饭得有食材呀。
得挑那些长得
健康、精神的拟南芥植株。
然后呢，你得想好要转进去啥基因，这就
跟你决定给菜加啥调料一样重要。
接下来就是关键步骤啦！得把你想要的基因给弄出来，这可不是随
随便便就能做到的哦。
就好像从一堆宝贝里精准地挑出你最想要的那
一个。
挑出来基因后，还得找个合适的载体，让这个基因能跟着载体一起
进入拟南芥里。
这载体就像是一辆小车子，载着基因去它该去的地方。
然后呢，就是把带着基因的载体和拟南芥凑到一块儿啦。
这可不是
简单地放一起就行，得用一些特别的方法，就好像要把钥匙插进锁孔里，得找对角度和力度。
等基因进去了，还得让拟南芥好好长一长，看看基因是不是真的转
进去了。
这就跟等菜做好了，尝尝味道对不对一样。
哎呀，你说这过程是不是挺复杂的？但这也是科学的魅力所在呀！
每一步都得小心翼翼，就跟走钢丝似的。
要是有一步出了错，那可能
就前功尽弃啦。
你想想，要是能成功地把想要的基因转到拟南芥里，那多有成就感啊！就好像你自己创造了一个小小的奇迹。
而且这转基因拟南芥用处可大啦！可以帮助我们研究基因的功能，可以让我们更好地了解植物的生长发育，还能为农业生产带来新的希望呢！
总之呢，转基因拟南芥虽然步骤多，过程复杂，但只要你有耐心，有细心，就一定能做好。
你说是不是呢？可别小瞧了这小小的拟南芥哦，它里面蕴含着大大的科学奥秘呢！。
拟南芥遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在通过农杆菌介导法对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行遗传转化，将目的基因导入拟南芥基因组中，并通过筛选和鉴定得到转基因植株。
二、实验材料1. 拟南芥（T0代）植株2. 根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株3. 目的基因质粒（含有荧光素酶基因）4. 抗生素：卡那霉素、氯霉素5. 培养基：MS培养基、N6培养基、再生培养基6. 仪器：离心机、PCR仪、荧光显微镜等三、实验方法1. 构建重组表达载体将荧光素酶基因插入到农杆菌转化载体pCAMBIA1300中，构建重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化将重组表达载体转化根癌土壤杆菌GV3101菌株，通过平板划线法筛选阳性克隆。
3. 拟南芥转化将阳性克隆的农杆菌悬浮液与拟南芥（T0代）花序进行蘸花处理，将蘸花后的拟南芥放入MS培养基中培养。
4. 筛选和鉴定在含有卡那霉素的培养基上筛选转基因植株，通过PCR检测和荧光显微镜观察GUS 基因的表达情况，鉴定转基因植株。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，待植株生长稳定后，收集种子进行繁殖。
四、实验结果1. 构建重组表达载体成功构建了含有荧光素酶基因的重组表达载体pC1300-FRT::GUS。
2. 农杆菌转化通过平板划线法筛选到阳性克隆，表明重组表达载体已成功转化根癌土壤杆菌GV3101菌株。
3. 拟南芥转化蘸花处理后，部分拟南芥植株在含有卡那霉素的培养基上生长，表明转基因植株已成功筛选。
4. 筛选和鉴定通过PCR检测和荧光显微镜观察，发现部分转基因植株GUS基因表达阳性，荧光素酶活性明显。
5. 再生和繁殖将转基因植株移栽至N6培养基中培养，植株生长良好，繁殖成功。
五、实验讨论1. 本实验通过农杆菌介导法成功将荧光素酶基因导入拟南芥基因组中，获得了转基因植株。
2. 在实验过程中，农杆菌转化和拟南芥转化效果良好，表明该实验方法适用于拟南芥遗传转化。
实验三(1)通过根瘤农杆菌转化拟南芥
4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口 的器皿中（500ml烧杯）。 5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬 浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中 的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过 程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。 6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的 湿度。 7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条 件下使其正常生长。 8．大约三周后收取成熟种子。
人工改造后的Ti质粒
1.保留T-DNA的转移功能，去掉T-DNA的致瘤性， 有利于转化体再生植株； 2.在T-DNA左右边界序列之间构建一段DNA序列， 其上含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点、 即单克隆位点，以利于插入外源DNA和其后的操 作； 3.具有目的基因表达所需的启动子、终止子以及提 供重组细胞筛选的标记基因等； 4.具有使质粒能够在大肠杆菌中进行复制的DNA复 制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中 进行复制的起始位点。
思 考 题
1．目前拟南芥稳定表达有几种基本的方法？ 试分析不同转化方法的优缺点。 2．植物转基因技术有哪些应用? 3．拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株 之一，请问有哪些特性？
培养基配制
准备—下周筛转基因种子和萌发实验。每两个人一 组，准备下述平板： （1）1个含有卡那霉素（50 mg/L）的 1/2 MS固体 平板； （2）1个1/2 MS固体平板（不含任何抗生素或者是 激素）； （3）一个加200 mM NaCl 1/2 MS固体平板（不含 抗生素）； （4）一个加1µM ABA 2 MS固体。 灭菌后将平板倒好并再4 ℃保存备用。
《生物节律钟基因LHY、CCA1调控拟南芥营养生长时相转变的研究》
《生物节律钟基因LHY、CCA1调控拟南芥营养生长时相转变的研究》摘要：本文探讨了生物节律钟基因LHY（LATE ELONGATED HYPOCOTYL）和CCA1（CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1）在拟南芥营养生长时相转变过程中的调控作用。
通过对LHY和CCA1基因的表达模式及功能进行深入研究，揭示了它们在植物生长发育中的重要作用，为进一步理解植物生物节律钟的分子机制和植物生长调控提供了理论依据。
一、引言生物节律钟是生物体内的一种内在时间计量系统，它控制着生物体在时间上的生理和代谢活动。
在植物中，生物节律钟对于调节植物的生长、发育和适应环境变化具有重要意义。
拟南芥作为一种模式植物，其生物节律钟的研究对于理解植物生物节律钟的分子机制具有重要意义。
LHY和CCA1是植物生物节律钟中的关键基因，它们在调控植物生长发育中发挥着重要作用。
二、LHY和CCA1基因的表达模式LHY和CCA1基因在拟南芥中的表达具有明显的节律性。
通过实时荧光定量PCR技术，我们发现在不同生长阶段，LHY和CCA1基因的表达水平存在显著差异。
在营养生长阶段，LHY和CCA1的表达呈现高峰与低谷的周期性变化，而在从营养生长向生殖生长转变的过程中，其表达模式也发生相应的变化。
这表明LHY和CCA1基因在拟南芥的营养生长时相转变中起着重要的调控作用。
三、LHY和CCA1基因的功能分析为了进一步探究LHY和CCA1基因在拟南芥营养生长时相转变中的具体作用，我们通过转基因技术构建了LHY和CCA1的过表达和抑制表达植株。
实验结果表明，过表达LHY和CCA1基因的拟南芥植株表现出提前进入生殖生长阶段的趋势，而抑制表达LHY和CCA1基因的植株则表现出延迟进入生殖生长阶段的趋势。
这表明LHY和CCA1基因在调控拟南芥营养生长向生殖生长转变的过程中具有关键作用。
四、LHY和CCA1基因的调控机制通过分析LHY和CCA1基因的上下游调控元件，我们发现了一些与光周期、温度等环境因素相关的调控元件。
MTI2和Bt转基因拟南芥的鉴定及筛选
内蒙古农业大学硕士学位论文MTI2和Bt转基因拟南芥的鉴定及筛选姓名：王晓娟申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：于卓;杨丽梅20070501１８ＭＴｌ２和Ｂｔ转基因拟南芥的鉴定及筛选试验设定了７个卡那霉素浓度梯度，分别为：５０、１００、２００、３００、４００、５００１１１９／Ｌ。
由表ｌ可见，卡那霉素对试验材料的发芽率没有显著影响，而对幼苗白化率有显著影响，随着浓度的增大，幼苗白化率逐渐增高。
说明卡那霉素不影响种子萌发却能抑制芽的生长。
当浓度达到３００ｍｇ／Ｌ时，未转化基因的野生型拟楠芥种子３个处理全部白化，无一株成活的绿茁，而转基因Ｔｌ代种子仍有部分幼苗正常生长。
本试验采用的卡那霉素筛选浓度定为３００ｍｇ／Ｌ。
图２卡那霉素浓度从左至右分别为５０、２００，３００ｍｇ／Ｌ时对照Ｃｏｌｏｍｂｉａ筛选２０ｄ的表现Ｆｉｇ．２Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｎｏｎ·ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｓｅｅｄｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ表５ａ００ｍｇ／Ｌ卡那霉素对ＴＩ代种子筛选结果Ｔａｂｌｅ５ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＴ５ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｅｄｓｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ３００ｍｇ／Ｌ图３卡那霉素浓度３００ｍ∥Ｌ时Ｔｓ代转基因种子和未转化亲本筛选２０ｄ时的对比Ｆｉｇ３ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＬｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｏｅｄｓａｎｄｎｏｎ－ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｓｅｅｄｓ∞ｌｅ，ｃｔｅｄｂｙｋａｎａｍｙｃｉｎ内蒙古农业大学硕士学位论文１９将试验中得到的Ｔｌ代８７株抗性苗编号移栽到苗钵中，在人工气候培养室培养。
待到收获时严格单株收获种子，即Ｔ２代种子。
继续用３００ｍｇ／Ｌ的卡那霉素进行筛选，直到抗性不再发生分离时，结束试验。
试验中，在Ｔ３代就已经有全部呈现抗性的材料出现，后又对其进行了两代筛选，确保抗性基因达到了纯合。
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10％NaClO润洗一遍，再用10％NaClO消毒 10min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）； 无菌水洗五遍，用牙签将种子点在培养基表 面（每皿4-5颗种子 尽量均匀）； 封膜，做好标记，平放于培养架上培养。
注意事项： 严格无菌操作！ 消毒过程动作要快！ 枪头不要重复使用，物品不要拿出超净 台！ 点种时每个位置尽量只点一颗种子！ 操作时尽量避免说话和人员走动！ 注意小组内的配合和小组间的协调！
目的基因
目的基因tubulin 拟南芥叶片表皮细胞、保卫细胞中微管骨 架的分布情况 根部细胞
目的基因与载体简介
导入农杆菌自我复制 浸染花粉转入拟南芥
pGMAP65-1::GFP植物表达载 导入成功? 体的构建
KAN 1 EcoRV PstI StuI MAP65-1
pGMAP65-1-GFP 8658bp
卡 那 培 养 基 上 筛 选 转 基 因 幼 苗 GFP
生 长 一 个 月 左 右 的 转 基 因 植 株 GFP
体式荧光显微镜观察GFP转基因植株
生 长 两 个 月 左 右 的 转 基 因 植 株 GFP
Confocal荧光显微镜观察GFP-tubulin 在气孔保卫细胞中的定位
材料与试剂
GFP转基因拟南芥的培养 及荧光观察
GFP报告基因
发现： 绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein， GFP） 水母中发现发光蛋白（20世纪60年代）
GFP报告基因
性质： 238氨基酸组成的单链多肽 在蓝光或紫外光激发下发出绿色荧光
有什么用呢?
蛋白质在活细胞中的准确定位及动态变化观 察（分泌蛋白的分选、亚细胞定位）
NOS GFP
tubulin
转染成功?
35Spromotor
BamHI H3 XbaI
பைடு நூலகம்
如何判定载体转化成功，植株内是否有目 的基因的表达？ ——载体及植株的筛选
卡那霉素抗性培养基筛选
卡那霉素: 抗生素 影响植物细胞叶绿体和线粒体的蛋白合成, 引起植株黄化死亡.
卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上 是通过卡那霉素抗性基因起作用的。转基 因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制 了卡那霉素的作用，所以通过卡那霉素,转 化体就很容易从非转化体中筛选出来。
材料：GFP转基因拟南芥种子及幼苗 试剂：MS培养基(wild type) ；
MS卡那抗性培养基(GFP-MAP65)； 75％乙醇； 10％NaClO；
无菌水。
种子消毒及播种实验流程
种子春化（ 加蒸馏水放入4℃冰箱中过夜）； 75％乙醇润洗一遍，再用75％酒精消毒1min （混匀，尽量将液体吸净，动作要快）；