酶联免疫使用试剂盒检测过程中值得关注的问题
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤
酶联免疫吸附测定（ELISA）常见问题及步骤酶联免疫吸附测定（ELISA）的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。
结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。
实验步骤1.标准品的稀释：按表1在小试管中进行标准品的稀释。
2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。
在酶标包被板上标准品准确加样50µl，待测样品孔中先加样品稀释液40µl，然后再加待测样品1 0µl（样品最终稀释度为5倍）。
加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5次，拍干。
6.加酶：每孔加入酶标试剂50µl，空白孔除外。
7.温育：操作同3。
8.洗涤：操作同5。
9.显色：每孔先加入显色剂A50µl，再加入显色剂B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（O D值）。
测定应在加终止液后15分钟以内进行。
12.计算：以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
BDNF的ELISA结果显示为毫微克/毫克组织（ng / mg）或皮克/mL上清液（pg / mL），并表示为平均值±SEM。
常见问题一、白板现象：显色结束后，酶标板所有孔均无颜色，阳性对照不显色。
酶联免疫吸附试验中常见问题的产生原因及解决办法
２ ． ３ 实验 室环境温度控制 实验室温度过高或者
过低 都会 使 吸光值 偏差 。试 剂盒 使用 前后 没有 达到 规 定温 度 、 孵 育和 避光 显色温 度 时 间不达标 ， 实验 室 避 光条 件不 具备 ， 都会 导致 试验 误差 。
３ ． ３ 实验 室环境温度控制 良好
３ ５ ３ ０ ０ ０
用 酶标 记物 进行 免疫 学检 测 的方法称 为酶 联 免 疫 吸 附试 验 （ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ ） 。该技 术 诞 生于 ２ ０世 纪 ７ ０年 代初 ， 可进 行 定 性 或定 量 分 析 ， 主要有间接 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ、 阻断 Ｅ ＵＳ Ａ、 双 抗 体夹 心 Ｅ ｕＳ Ａ三 种 方法 。 目前 该 技术 在 猪瘟 、 口蹄 疫 、 高 致病 性 猪 蓝耳 病 、 猪 伪 狂 犬 病、 猪 乙型脑 炎 、 猪链 球 菌病 、 猪 圆环病 毒病 、 猪传 染
不规 范 的操作 环节 都会 对试 验结 果产 生影 响 ，出现
错 误 的结果 。 １ 常 见 问题
操作， 要 求血 清清 亮 、 无溶血， 避 免 使用 严 重 溶 血 的 血 清样 品 。 当血清 中有 凝块 时 ， 要 特 别小心 不 要吸 到 任 何凝 结 的材料 或者 血球 。被检 血清 保存 时 间不 能 太久 ， 冻 结 血清 解 冻后 ， 应 该 充 分混 匀 ， 稀 释 后 的血 清 样 品在添 加到 包被 板之 前也 要混 合均匀 。解冻 后 血清标 本争 取一 次性 检测 完成 ，血清 标本 如 需保 存 作多 次检 测 ， 宜 少量 分装 冷 冻保 存 。
检 测板 吸光 值偏 高及 出现假 阳性 ；检 测板 吸光 值 偏 低 及 出现 假 阴 性 ； Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检 测 板 避 光 显 色 后颜
酶联免疫试剂盒实验操作规程及注意事项
操作规程：溶液配制1、针对呋喃唑酮、呋喃它酮、氯霉素等试剂盒，他们的1X洗液、1X样品稀释液、终止液是通用的。
检测数量大的情况下可以大量配制洗液、样品稀释液等，一般建议一个礼拜重配一次。
2、可以或需要前处理前配制的溶液：呋喃类：缓冲溶液、样品稀释液、1M HCL、1M NaOH、10mM邻硝基苯甲醛、洗涤工作液氯霉素：样品稀释液、洗涤工作液3、检测时配制的溶液：呋喃类：A、B液需在洗板前配制好，并混合均匀。
氯霉素：酶结合物工作液、A B液样本处理呋喃类：1、1g组织样本+4ml水+0.5ml 1M HCL+400ul 10nM邻硝基苯甲醛，剧烈涡动1min；2、60℃温箱孵育1h，然后拿出来涡动30s，继续孵育0.5h；3、依次加入5ml缓冲溶液、400ul 1M NaOH、6ml乙酸乙酯；4、剧烈涡动1min后4000g离心10min；5、取3ml上清液50-60℃氮气吹干，加入2ml正己烷，再加入1ml样品稀释液，高速涡动30s；6、4000g以上，离心5min，去上层及中间层杂质，取下层液体待测。
氯霉素：1、3g样品+ 6 mL 乙酸乙酯，充分涡动1 min后4000 g 离心 10 min；2、取 4 mL 上层乙酸乙酯50-60℃氮气吹干，加入2 mL正己烷，充分涡动10 s，再加入 1 mL 样品稀释液，低速涡动 1 min；3、4000 g 以上，离心 5 min，完全弃去上层正己烷及中间层杂质，取50 µL 进行检测。
检测过程呋喃唑酮：1、加50ul标准品/样品+50ul酶标二抗+50ul抗体工作液后室温（23-27℃）反应30min；2、每孔加260ul洗涤工作液洗板，共洗4次，拍干，加入混合好的100ul AB液，室温下避光反应15-20min（看颜色深浅），加入50ul终止液后读板。
呋喃它酮：1、加50ul标准品/样品+50ul酶结合物后室温（23-27℃）反应30min；2、每孔加260ul洗涤工作液洗板，共洗4次，拍干，加入混合好的100ul AB液，室温下避光反应15-20min（看颜色深浅），加入50ul终止液后读板。
ELISA试验中常出现的问题及解决方法
ELISA试验中常出现的问题及解决方法作者：吴召坤，巩雪英，刘粉红来源：《兽医导刊》 2016年第8期吴召坤巩雪英刘粉红/陕西省丹凤县畜牧兽医中心ELISA试验，即酶联免疫吸附试验，具有敏感性高的特点，兽医实验实常用ELISA试验检测样品的抗原或抗体，ELISA试验中很多因素都会影响试验的结果，试验中常出现的有显色淡，灵敏度偏低、样品重复试验差异大、假阳性和假阴性等。
这些都会使我们对样品的真实结果做出误判，现就ELISA试验中非正常检测结果产生的原因进行分析，寻讨其解决的办法，以提高检测的准确性。
一、显色淡，灵敏度低1.查看试剂盒是否在有效期内，是否按照保存温度保存。
试剂盒过期或保存温度过高（正常保存温度2℃～8℃）都会影响显色。
2.试剂盒从2℃～8℃冰箱取出后在室温平衡至少20～30min。
3.温育时间不足或培养箱温度不足37℃，在ELISA试验中一定要注意温育时间和温度的重要性，在温育的过程中尽量不要打开温箱，僻免温度忽上忽下。
温育时间不足，温度过低都会影响显色。
4.严格按照试剂说明书要求的洗涤方法洗涤，洗涤时加洗涤液不能冲击过大，浸泡时间过长，要按照说明书上要求的洗涤次数洗涤。
5.加样不足，加样时要按照加样量调整好移液器的刻度，使用配套，内壁光滑清洁的吸头，吸头不能交叉使用，同时要对移液器进行校准，僻免加样不足使显色不足。
6.配制洗涤液的水要用纯水机过滤的水，水质应清洁无异常，不能用酸性过大或碱性过大的水，最好用新鲜合格的蒸馏水。
二、样品重复试验差异较大在检测过程中有时同一样品两次检测结果不一样，差异较大，这种情况可能存在以下几种原因。
1.两次检测样品数量可能不同，加样时间长短不一，反应时间长短不一，所以重复检测某一样品时，尽量与第一次加样时间一致。
2.加样量不一致，样品稀释倍数要准确，充分混匀，两次加样要使用同一个移液器。
3.温育时间和温度不一致，洗涤及操作人员不一致。
重复检测样品，操作条件，人员等检测过程应与上次保持一致。
酶联免疫吸附试验(ELISA)注意事项
酶联免疫吸附试验（ELISA）注意事项作者：任小龑来源：《新校园·上旬刊》2015年第07期摘要：本文主要探讨了酶联免疫吸附试验（ELISA）中常见的影响因素，对学生实验中常出现的问题进行原因分析，并总结解决办法。
ELISA试验操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，有可能导致显色不全、假阴性或假阳性结果。
关键词：酶联免疫;吸附试验;满版实验室常用固相酶免疫测定方法在1971年最初建立，称为酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunsorbent assay），简称ELISA。
原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体的酶标记，以酶催化底物显色来判断结果。
影响酶联免疫测定的因素较多，如标本的采集保存、试剂的准备、加样的技术、温度的控制、洗涤反应板的方式、显色反应时间的控制等，均可能对试验结果产生很大影响。
只有避免这些因素，才能保证试验结果的准确性和可靠性。
一、移液枪的使用我院免疫实验室常用手动单道移液器。
注意事项：（1）吸样前要保证枪头和液体处于相同温度;（2）若容量瓶中的液体太少，可倒入ep管中，方便吸取;（3）严格精确调节方法;（4）安装枪头要垂直插入，左右轻微转动上紧，上下敲击会引起内部的零部件因瞬间强烈撞击而松散;（5）垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2～4mm以下，一般液体，正向吸液1～2档，粘稠液可反向吸液2～1档，缓慢吸取，控制好弹簧的伸缩速度，太快会产生反冲和气泡，吸取后将移液枪提离液面，停顿1秒钟，观察是否有液滴流出，若有流出，说明有漏气现象;（6）放液时将吸嘴贴到容器内壁并保持10～400倾斜，平稳把按钮压到1档，停约一秒钟到2档，排出剩余液体。
吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，不能突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。
移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体的移液枪平放或倒置。
不要将按钮旋转出量程，否则会卡住内部机修装置而损坏;长时间不用时建议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，可延长使用寿命;定期对移液枪校准。
ELISA试剂盒常见注意事项
ELISA试剂盒常见注意事项LISA方法被广泛应用于各种抗原和抗体测定。
但ELISA测定中影响因素较多，而且其操作中有一定的技术要求，在检测过程中除正常反应外，有时常见到一些错误的结果。
引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。
下面就一些常见ELISA操作过程中的问题一一分析。
1．样品稀释酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。
因此，国外检测血清抗体的试剂盒，均规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应，使特异性的抗原抗体反应充分体现出来。
一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。
但是，有些用户未能严格按使用说明书操作，如某些产品应取10μl样品进行稀释，个别用户取5μl甚至1μl样品进行稀释，由于吸嘴上不可避免地沾有样品以及微量移液器的精度不够，因此造成样品稀释倍数不准确，检测结果出现问题。
2．试剂盒平衡3．样品和试剂的混匀稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。
4．加样5．温育温育是ELISA测定中影响测定成败zui为关键的一个因素。
ELISA作为一种固相免疫测定，抗原抗体的结合反应在固相上进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原完全结合，必须在一定的温度条件下反应一定的时间。
温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。
zui为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。
一些操作者，擅自改变说明书操作，使用自己喜欢的温育时间和温育温度，这样造成一些不必要的麻烦。
因为，不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。
6．洗板固相免疫测定技术是一种非均相免疫测定技术，需以洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。
酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题
酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题酶联免疫（ELISA）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题1、仪器质控为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（SOP），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。
◎移液器：ELISA加样量小（20-200μl），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在±5%以内；◎恒温箱：经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有±1℃的误差；◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2μl；人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞；◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
2、试剂盒选择◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。
◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。
◎特异性：常用交叉反应率表示。
含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。
◎精密度：ELISA试剂一般指其批内CV%，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。
◎准确度：通过添加回收实验进行评价。
◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简单明了，定量试验结果计算也应简单。
◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。
◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。
3、样本前处理注意事项3.1 均质组织样本:肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。
酶联免疫吸附实验常见问题分析
酶联免疫吸附实验常见问题分析Q1.标曲不显色或显色很弱，样本显色溶解标准品以及倍比稀释时，未涡旋震荡或不够充分。
标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀。
单纯依靠移液器反复吹打，效率较低、效果也不一定最佳。
Q2.标曲和样本均不显色在孵育阶段静置在桌面上，这样非常不利于抗原抗体之间的充分接触，导致显色偏弱。
推荐孵育阶段，使用ELISA专用的微孔板振荡器，调至合适的频率，使抗原抗体充分接触，保证结合效果。
如果排除上述原因，有可能是漏加了某个组分，如检测抗体、酶等。
对于比较马虎的新手，一定要做好标记和记录，或者使用添加染料的ELISA试剂盒。
Q3.标曲显色，样本不显色当样本中目的蛋白浓度极低或者样本中干扰因素较强，就无法检测到。
目前ELISA仍然是蛋白检测灵敏度最高的方法，与不同技术结合后，衍生出了多种类型的ELISA，提高了检测灵敏度。
对于目的蛋白浓度特别低的样本，可以尝试用高敏ELISA，但这也并不意味着一定能检测到样本浓度，只能说可以提高样本的可测率，并使结果更加可靠。
因为通常用普通ELISA检测的样本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高样本OD值，使之尽量位于标曲范围内，得到的数值也更加可信。
Q4.标曲和样本都显色，但复孔的CV大这个问题就跟移液器和实验者的操作有关了。
移液器的使用维护不规范，就会造成移液的误差较大；实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。
掌握移液器的正确使用和维护。
关于个人的操作可练习移液动作、加快速度，确保移液的精密度。
Q5.本底偏高，样本值测不到标曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(对于高敏ELISA可以适当放宽要求)。
尤其是样本值特别低的时候，本底过高会掩盖目的信号，导致无法测到样本值。
在加入TMB显色后，需实时观察标曲显色情况。
通常在S5孔有肉眼可见的微弱蓝色，即可终止反应。
Q6.样本经不同梯度稀释，计算得到的样本值差异较大有时候我们不清楚样本中目的蛋白的浓度如何，应该如何稀释，那么我们就会做下预实验，确定稀释倍数。
酶联免疫吸附试验(ELISA)操作注意事项
5 洗板
6 显色
在以HRP作为标记酶的ELISA试剂盒中，一 般显色反应条件为37℃或室温反应15－30 分钟。在一定时间内，阴性孔可保持无色， 而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。TMB （四甲基联苯胺）经HRP作用后，约40分 钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后 可完全消退至无色。 TMB的终止液有多种，酸性终止液（硫酸） 会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长 （450nm）测读吸光值。
2 试剂的准备
（1）在实验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出， 在室温下放置30分钟以上，再进行测定，以使 试剂盒在使用前与室温平衡。这样做的目的， 主要是为了缩短升温时间，使反应孔内的温度 能较快地达到所要求的高度，以满足测定要求。 （2）试剂盒中的洗涤液如需在使用时对所提供 的浓缩液稀释配制，稀释时所用的蒸馏水或去 离子水应保证质量。
在ELISA实验中一般有3次加样步骤，即加标本、加 酶结合物、加底物和显色剂。 加样必须注意的关键点是： （1）加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅 出和产生气泡。加样时如有气泡，抗原抗体不能有 效地结合会导致弱阳性甚至假阴性。 （2）每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染。 有些测定需用稀释的血清，应保证稀释液与血清混 合均匀。 （3）加酶结合物、加底物，应使加液量准确均一、 加液过程迅速完成。也可使用试剂盒提供的滴瓶直 接滴加。滴加时，除了要注意滴加的角度垂直、一 致外，滴加的速度也很重要。滴加太快，很容易出 现重复滴加或加在两孔之间的现象。
（4）单波长或双波长比色选择的问题。 所谓的单波长比色即是通常的以对显色具有最大 吸收的波长如450nm或492nm进行比色测定；
酶联免疫试剂盒实验操作注意事项
酶联免疫试剂盒实验操作注意事项
1. 检测试剂盒在使用前，需在室温下进行复温。
本试剂盒加样后室温反应时间为10分钟，环境温度对检测结果会有很大的影响，所以控制好环境温度（国际标准室温是20-25℃）是试剂盒检测性能发挥所必须的条件。
另外，所有反应过程需保持在水平位置，禁止倾斜放置。
2.样品提取尽量采用离心取上清的方法，对样品的稀释可以有效降低基质干扰，但稀释一定是要保证整个反应在同一体系下反应，对AFB1样品来说，甲醇的含量须始终保持与标准品一致（35%）。
3. 加样过程做重复孔是使检测结果更真实的接近于实际值，在确保加样精度的前提下，避免孔与孔之见的污染，每孔必须更换枪头，酶标板微孔中避免出现气泡，如不慎有气泡用干净枪头戳破，加样时确保用枪方法的一致性，减少非系统误差。
4. 洗板过程很重要，有条件建议使用洗板机，如人工洗板，则在加入洗液过程中，每孔中的液体尽量不要溢出到邻近板孔，如果洗板效果不好很容易造成本底偏高。
5. 加样过程一定要迅速准确，尽量保持每孔反应时间的均一性和加样顺序的前后一致性，如果样本超过20个，请用排枪做，避免造成前后反应时间不一致而导致的结果偏差。
6. 数据分析和处理，建议使用专门软件，根据具体情况选择合适的拟合方式，对AFB1试剂盒来说，建议使用CS曲线进行分析。
7.AFB1具有见光分解的特性，样品提取加样等过程请注意避光。
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酶联免疫（）使用试剂盒检测过程中值得关注的问题
1、仪器质控
为使仪器保持最佳工作状态，应建立维护和校正仪器的标准操作程序（），所要控制的仪器包括移液器（加样枪）、温箱、洗板机和酶标仪。
◎移液器：加样量小（20-200卩l ），其准确性直接影响实验结果，利用称重法检查：低、中、高三个刻度分别吸取指示量的水，万分之一天平称重后计算吸量是否准确，一般应在土5淋内；◎恒温箱：经常检查恒温箱温度计所示的温度和水中（或温箱内）实测温度是否一致，允许有土1C的误差；
◎洗板机：每个厂家设置洗板后的残留液有各自的规定，一般不超过2卩I ;人工扣板时，垫纸不湿；定期检查管孔是否堵塞；◎酶标仪：经常维护其光学部分，防止滤光片霉变，定期检测校正，使其保持良好的工作性能。
2、试剂盒选择
◎应尽量选择正规厂家，产品经相应政府部门审核认可，试剂应从灵敏度、特异性、精密度、稳定性、简便性、安全性及经济性全面评价。
◎灵敏度：有二层含义，1）为试剂检出被检物质的最低量的能
力；2）为试剂对大量样品中阳性检出的能力。
◎特异性：常用交叉反应率表示。
含有与待测物相近结构部份的物质可能存在交叉反应，使测定结果升高，可能导致假阳性，所以交叉反应是评价其质量的关键指标。
◎精密度：试剂一般指其批内，其值应小于15%；定量试剂应同时考察线性范围。
◎准确度：通过添加回收实验进行评价。
◎简便性：指在不影响试剂的前三项指标的前题下，实验和测定步骤越少越好，在定性实验中结果判断简单明了，定量试验结果计算也应简单。
◎安全性：指试剂对操作者和环境安全无害无传染性。
◎经济性：试剂在同等质量条件下通过大规模生产或技术进步降低成本，而市场价格比较合理。
◎试剂评价：需要有权威的确证方法和确证的样品进行检测。
3、样本前处理注意事项
3.1 均质
组织样本: 肉、肝食品类切细，用绞肉机反复绞碎，混合均匀。
水产样本：去除样品的非食用部分，食用部分切细，用均质器均浆；原料表面较脏时, 需适当用蒸馏水清洗。
蛋类：鲜蛋去壳，蛋黄和蛋白充分混匀。
水果、蔬菜类：先用水洗去泥沙，然后除去表面的水分，取食用部分。
3.2 振荡提取将提取溶剂加入到装有样品的具塞容器中，振荡，
使提取溶剂与容器内的样品充分接触以深入到样本组织内部，提取待测组分。
3.2.1 振荡方式：振荡器上进行上下、往返式振荡、手摇式上下振荡。
3.2.2 在组织样本中加入有机溶剂之间提取时，应边加边振荡，防止组织凝结成团，不利于提取。
3.3. 在用有机溶剂提取过程中，如果出现乳化现象，解决的方法有：
①用细头轻轻的搅拌，破坏乳化后，再重复离心。
②再加入适量的提取剂，重新振荡。
注意离心后要保证样本的稀释倍数不变。
3.4 浓缩
由于净化过程中引入的溶剂，可能会降低待测组分的浓度或者不适宜直接分析，需要去除全部有机溶剂。
即试剂盒前处理步骤中把样本在60C氮气下吹干，再用复溶液溶解干燥残留物。
浓缩方式：
氮气吹干除杂、压缩空气吹干除杂。
3.4.1 在吹干样本之前，用甲醇清洗针头，防止杂质干扰。
3.4.2 在吹样本时，针头应在液面上空，避免与样本接触，防止产生交叉污染。
3.4.3 样本吹干后应立即取下，避免吹的时间过长，影响最终检测结果。
3.4.4 不同的药物，吹干后样本的保质期不同，提倡待样本回到室温后立即复溶。
3.5 净化
经过提取的待测组分中通常含有一些会干扰试剂盒中抗原抗体反应的杂质或者是含有与待测物结构相似的杂质。
将待测组分与杂质分离的过程，我们称为试剂盒中样本的净化。
在我们现有的试剂盒前处理方法中涉及到的最常见的净化是：液液分配法。
比如：用复溶液溶解干燥残留物之前先加入适量的正己烷，在加入正己烷和复溶液涡动后如果出现乳化现象，可以60C水浴加热，至乳化现象消失或减弱后，加大离心转速进行离心。
实例：
A、氟喹诺酮类药物试剂盒现有的水产样本前处理方法中，用二氯甲烷作为提取剂。
(a) 二氯甲烷的密度比水大，离心完后，二氯甲烷在下层，须先用加样器吸尽上层废液后，再按要求取适量的下层吹干。
(b) 在用加样器吸取下层的有机相时，正常操作往往取量不准确，此时最好用带有刻度，且刻度较准确的玻璃管来定量。
(c) 上诉情况对有经验的试验员还可以通过灵活控制加样器来控制取样的准确性。
(d) 在振荡过程中要注意安全。
二氯甲烷在振荡的过程中，如果离心管密封性不是很好，往往容易爆开；在进行振荡时，不要让离心管口对准自己或者其他人，避免溅到自己或者他人身上。
(e) 试剂盒在使用前充分回温很必要，如回温不充分该项目曲线受影响较明显。
B 、硝基呋喃代谢物检测过程中常见问题
硝基呋喃代谢物有四种：3-氨基-2- 唑烷基酮() 、5-甲基吗啉-3- 氨基-2- 唑烷基酮() 、氨基脲() 和1-氨基-2- 内酰脲() 在检测过程中也需要同其它项目一样进行添加回收测评，其中需要注意以
下几个问题。
代谢物在组织中是与蛋白呈结合状态，采用普通的有机溶剂或缓冲液，是无法提取该代谢物的。
需要用盐酸水解后才能使呋喃类代谢物游离，所以在加入去离子水、盐酸和2- 硝基苯甲醛(2) 混合均匀后，其应在1-3 之间，否则不利用水解代谢物。
在衍生化过程中，温度和时间决定其衍生化产率，衍生化后在加入氢氧化钠和磷酸氢二钾时，其应在中性左右。
由于部分样本的缓冲能力不同，所以需对其进行测定，因为在酸性或碱性环境中，不利于呋喃类代谢物的提取回收，同时也容易出现假阳性。
添加回收的几种误区：呋喃类代谢物提取过程通常分三个关键步骤：水解衍生化提取
(1) 采用标准曲线的最大标准浓度进行添加回收。
如德国拜发和我公司试剂盒中的第6个标准点 4.05 ，试剂盒中的第 6 个标准点8.1 。
因为这些标准品是已经过衍生化后的标准品，不能代表样本前处理实验中的加酸水解和加衍生化试剂衍生这两个步骤，所以就算回收率很高，但失去了实际参考价值。
( 2)完全依赖未衍生的代谢物标准品进行添加回收。
因部分未衍生的代谢物在配制成标准品后有一定的有效期，会存在潜在的不稳定因素，而且添加回收仅能考证衍生化和提取两个关键点，不能验证从组织蛋白中水解呋喃类代谢物的过程，因此也有一定的局限性。
最好的评价方案：采用经确证的阴阳性样品，留作质控样品，对检测的样本和试剂盒进行质量评价。
这也是实验室所出数据可信度最具说服力的关键点。
4、酶标分析过程中的注意事项样本的检测是基于抗原抗体的反应，根据标准曲线，判定样本最终的药物含量。
它要求加样的准确性和洗板的一致性。
在整个加样的过程中注意实验室温度的恒定，保证反应在试剂盒所示的温度下进行。
4.1 常见加样方式
A、吸一打二
B、吸二打一
在实际操作过程中，提倡用“吸二打一”用这种方式，有如下
几个好处：
a、加样过程中在板孔内不出现或者很少出现气泡
b、提高加样速度，缩短前后样本反应的时间差。
在加样的过程中还应细心注意避免出现下列现象：
A、加样的过程中漏加或者重加；
B、加样的过程中忘记更换吸头；
C、样本的重加或者漏加；
D忘记记录样本的加样顺序。
4.2 常见的洗板方式
A、洗板机洗板；
B、多道孔加样器洗板；
C、多孔吸头洗板；
在洗板的过程中，确保每孔所加洗涤液量的均一，按说明书操作，不可过多，避免溢出板孔，污染其它样本；过少，则达不到洗涤的效果，容易出现曲线不成线性，花板等情况。
4.3 甩板
快速甩尽板孔内的液体，防止板孔里的液体对流或反溅回板孔中产生交叉污染。
4.4 拍板
轻轻的在吸水纸上扣干板孔内的液体，而且吸水纸只能使用一次。
4.5 显色
值得注意的是，并非试剂盒中所规定的显色时间是绝对的，因
为试剂盒的吸光度值会受环境中的温度、湿度、酶标板反应时所接触到的物品的导热度等有关，实验操作人员在加完显色液后，可根据颜色的深浅适当的延长或者缩短显色时间。
防止出现吸光值接近或高于酶标仪的最高检测灵敏度（值在 2.5-3.0 之间），这样会间接影响到检测结果，如出现曲线前半部份梯度不明显或颠倒数值等现象，也就造成了一些假阳性或部分检测结果偏低的现象。