细胞生物学实验二细胞器的分级分离
细胞器的分离、纯化实验ppt课件
实验方法
玉米黄化幼苗线粒体的分别〔整个过程坚持在0-4℃ 〕
1.将玉米黄化幼苗剪下，称重每小组约5g，在冰箱中 放置1小时
2.将幼苗剪碎直接倒入研钵中以1:3(分量体积比g:ml) 比例参与离心匀浆介质，快速研磨，留意先参与少 许介质液，研碎后将余液参与
3.用双层尼龙网过滤，除去残渣。 4.取滤液在低温高速离心机伤2300rpm离心10min弃
该法的优点是：①分别效果好，可一次获得较纯颗 粒；②顺应范围广，既能分别具有沉淀系数差的颗 粒，又能分别有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会 积压变形，能坚持颗粒活性，并防止已构成的区带 由于对流而引起混合。
缺陷：① 离心时间较长；②需求制备梯度；③操 作严厉，不宜掌握。
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半径
方法： 两点一 线法
4. 试剂：
5.
① 线粒体离心匀浆介质。
6.
② 1%詹纳斯绿B的0.25M蔗糖溶液。
7.
③ 0.05M Tris-HCl液体 Ph=8.0
8.
④ 0.35mol/L NaCl
匀浆介质，普通为一定浓度的蔗糖溶液参与其它
9离. 子成分，可以维持亚细胞组分的浸透压。
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概述
离心机
！
制备性
分析性
普通离心机
细胞器的分别、纯化 — 细胞分级分别法
—秦川
实验目的
实验原理
实验用品
实验方法
运用范围： 1.病毒及亚细胞 组份分别 2.蛋白梯度分别 3.脂蛋白分别 4.RNA梯度沉淀 5.质粒DNA提纯
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实验目的
• 认识离心机及学习离心机的运用方法 • 学习细胞器的分别及纯化的普通原理和
方法
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细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离
实验二细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法.二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法.细胞组分的分离在等渗溶液〔0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液〕中进行.●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞.●在3000r/min的条件下离心5 min,即可获得沉淀的叶绿体〔混有部分细胞核〕.●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶,洗净搽干后去除叶梗和粗脉,称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中,放入组织捣碎机<间歇>；低速匀浆1min；间歇匀浆.2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中.3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体〔混有部分细胞核〕；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离.5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮.〔浓度不要太高,不利于观察〕➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,再滴加一滴0.01%吖啶橙染料,加盖玻片即可在荧光显微镜下观察.第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.收集沉淀涂片,用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟,线粒体为蓝绿色圆形颗粒.实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下,要迅速分离和观察.〔教师演示示X〕第三部分人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察一、实验目的：观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布.二、实验原理：线粒体是细胞进行呼吸作用的场所,其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同生理状态而发生改变.詹纳斯绿B是一种毒性较小的碱性染料,可专一性的对线粒体进行超活染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态〔即有色状态〕,呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基〔即无色状态〕.三、实验步骤：1、取清洁载玻片,滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液；2、用牙签宽头在口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞,将刮下的黏液状物放入载玻片的染液中,染色10-15 min；〔作用,染液不可干燥,必要时加滴染液〕；3、盖上盖玻片,置显微镜下观察.四、实验结果：在低倍镜下,选择平展的口腔上皮细胞,换高倍镜观察,可见扁平状上皮细胞内,核周围的胞质中,分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构,即为线粒体.实验作业：3 绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布.。
细胞器的分级分离
[注意事项]
• 1．组织匀浆时，既要尽可能使细胞完全破
碎，又要尽量快速。 • 2．在细胞器分离过程中，所有操作应尽可
能在1～4℃下进行。 • 3．实验过程应注意保持细胞器的完整性，避免操
作过于剧烈。另线粒体进行的是活体染色，要 求样品制备好后尽快染色。
再 见
(2)线粒体的鉴定
于洁净载玻片上滴1滴0.02％～1％的詹纳斯 绿B染液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中， 染色5～10 min，盖上盖玻片，镜检。
[结果与分析
光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿-派洛宁染 色，DNA呈蓝绿色，核仁和胞质RNA呈红色。观 察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经詹 纳斯绿B染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸酶显 示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征，但 可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果分 离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而且 没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，反 之则为失败。
2.细胞器的分级分离
(1)细胞核的分离： 第一次:1000rpm,8min。
上清保留于Ep管1.0处
加0.25M蔗糖至4ml，混 匀
第二次:1300rpm,8min。弃上清 (2)细胞核的纯化
在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2至2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻 轻加入2ml 的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2 溶液。尽量使两种溶液明显分层。 2000rpm离心 8min。
(3)细胞核鉴定：
。
涂片：在离心后的沉淀中加入几滴PBS， 混匀后涂片，空气干燥
固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾 干 染色：滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min
细胞组分的分级分离
离心机机型 低速离心机 高速离心机 超速离心机
转速 8 000转/分 8 000~25 000转/分 25 000 ~ 80 000转/分
分离方法
❖ 差速离心分离法：利用不同离心速度产生的不同离 心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分开。
❖ 密度梯度离心分离法：将要分离的细胞组分铺放在密 度逐渐增加的介质表面，在超速离心力的作用下， 不同的组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的 沉降带。
❖ 离心技术：
1. 是分离细胞器（如细胞核、线粒体、高尔基体）及各种大分子基 本手段。
2. 转速为10-25kr/min的离心机称为高速离心机。
3. 转速>25kr/min，离心力>89Kｇ者称为超速离心机。
4. 目前超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。
颗粒直径 103nm 102~104nm 102nm
线粒体含量较多；长度适合观察，约5μm；肝脏较软，易 于破碎，并且适于快速提取，因而利于保持线粒体活性。
细胞器沉降先后顺序先后是细胞核、线粒体、溶酶体和其 他微体、核糖体和大分子。
詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线 粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持 氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹 纳斯绿B被还原成无色的化合物。
差速离心法differential centrifugation
匀浆
离心
1 000G20分钟
细
胞
细胞骨架
细胞骨架
核
离 心 10 000G
20
分 钟
核 糖 体 等
离心0.26%脱氧胆酸钠 微
离心
15 000G20分钟
分级实验报告
一、实验背景与目的随着细胞生物学研究的不断深入，对细胞内不同结构和功能区域的了解日益重要。
细胞器分级分离技术作为一种重要的细胞生物学研究方法，能够有效地将细胞内各种细胞器分离纯化，从而便于研究其形态结构、化学组成和生理活性。
本实验旨在通过分级离心法，分离纯化细胞内线粒体、内质网、高尔基体等细胞器，并对其形态和生化特性进行观察和分析。
二、实验原理细胞器分级分离法是利用细胞器大小、形状、密度等物理性质的差异，通过离心力将细胞器分离纯化的方法。
根据细胞器的大小和密度，选择合适的离心速度和时间，可以将细胞器分离成不同的层次。
通常，线粒体、内质网、高尔基体等细胞器在离心过程中分别位于不同的层。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 人胚胎肝细胞- 生理盐水- 0.25%胰蛋白酶- 10%Triton X-100- 线粒体提取缓冲液- 内质网提取缓冲液- 高尔基体提取缓冲液- 1%戊二醛固定液- 磷酸盐缓冲液（PBS）2. 实验仪器：- 离心机- 显微镜- 电子天平- 移液器- 离心管四、实验步骤1. 细胞悬液的制备：- 将人胚胎肝细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，待细胞生长至80%汇合度时，用生理盐水洗涤细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成细胞悬液。
2. 细胞器的分离：- 将细胞悬液按1:1比例加入预冷的生理盐水，用移液器吹打细胞，使细胞分散均匀。
- 将细胞悬液转移至离心管中，在4℃、1500g下离心10分钟，弃去上清液，得到细胞沉淀。
- 向细胞沉淀中加入预冷的线粒体提取缓冲液，重悬细胞，在4℃、1500g下离心10分钟，弃去上清液，得到线粒体沉淀。
- 重复上述步骤，分别得到内质网和高尔基体沉淀。
3. 细胞器的观察和分析：- 将线粒体、内质网和高尔基体沉淀分别用1%戊二醛固定，进行电子显微镜观察。
- 对分离得到的细胞器进行生化分析，如酶活性测定、蛋白质含量测定等。
五、实验结果1. 细胞器的形态观察：- 线粒体：呈棒状、椭圆形或圆形，外被双层膜，内部有嵴和基质。
实验3.ppt细胞器分离
(6)细胞核鉴定： (6)细胞核鉴定： 细胞核鉴定
。
悬浮：在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混匀 涂片,空气干燥． 固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干 染色： 滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min 分色:快速放入丙酮中20s，蒸馏水漂洗，擦干水 分
镜检：观察先用低倍镜。 （7）镜检：观察先用低倍镜。再用高倍镜
差速离心： 差速离心
采取逐渐提高离心速度的方法分离大小不同的细胞器。 被分离的分子越小，需要的离心速度越高。
大颗粒首先沉到管底
较小颗粒沉降
速度区带分离法： 速度区带分离法：
预先装入有一定密度梯度的材料（蔗糖或甘油）， 利用各种颗粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同 沉降速度的颗粒处于同一梯度层内。
(2)匀浆: (2)匀浆: 匀浆
每组取适量剪碎组织，放入匀浆器中,加入3ml的 0.25mol/L蔗糖溶液进行匀浆。
过滤： (3) 过滤：
将组织匀浆完毕，用尼龙网过滤，每组取 2ml的过滤液移入离心管中。
(4)离心： (4)离心： 离心
第一次: 1000rpm 1000rpm,8min。
上清保留于试管1.0处
[作业 作业] 作业 绘制细胞核及线粒体的基本形态 [思考题 思考题] 思考题 本次实验中用了哪些离心方法，原理是 本次实验中用了哪些离心方法， 什么？ 什么？ 注意事项 1、染色时间要充分。 、染色时间要充分。 2、丙酮分色时要迅速，以防细胞核脱色。 、丙酮分色时要迅速，以防细胞核脱色。
注：待分离颗粒密度比介质密度都要大： 不能离心太久，否则两种颗粒都会沉到底部
[内容与方法 内容与方法] 内容与方法
内容： 内容：
大鼠肝细胞细胞核及线粒体的分离
方法： 方法：
分离细胞器的方法
分离细胞器的方法细胞器是细胞内的重要结构，它们在细胞的生存和功能执行中起着至关重要的作用。
分离细胞器是细胞生物学和生物化学研究中的重要操作，可以帮助科研人员更好地了解细胞器的结构和功能。
下面将介绍几种常用的分离细胞器的方法。
一、差速离心法。
差速离心法是一种常用的分离细胞器的方法，通过利用细胞器的不同密度来进行分离。
首先，需要将细胞悬液置于离心管中，然后进行低速离心，使细胞器沉淀到离心管底部。
接下来，将上清液转移到另一个离心管中，进行高速离心，这样可以将不同密度的细胞器分离出来。
通过这种方法，可以获得相对纯净的细胞器样品。
二、梯度离心法。
梯度离心法是利用密度梯度离心离心细胞器的方法。
首先，需要制备密度梯度离心液，然后将细胞悬液均匀地加在离心管上，进行超速离心。
在离心过程中，不同密度的细胞器会在密度梯度中分层沉淀，从而实现分离。
这种方法可以得到高纯度的细胞器。
三、超声破碎法。
超声破碎法是一种利用超声波对细胞进行破碎，分离细胞器的方法。
首先，将细胞悬液置于超声破碎仪中，经过超声波的作用，细胞膜会破裂，释放出细胞器。
然后，通过差速离心或梯度离心的方法，可以将细胞器分离出来。
这种方法操作简单，适用于一些对纯度要求不高的实验。
四、亲和层析法。
亲和层析法是利用生物分子之间的特异性相互作用来分离细胞器的方法。
通过将含有特定亲和基质的层析柱与混合细胞器悬液一起进行层析，利用细胞器与亲和基质之间的特异性结合来实现细胞器的分离。
这种方法可以得到高纯度的细胞器样品，适用于对细胞器纯度要求较高的实验。
五、离心上清法。
离心上清法是一种简单快捷的分离细胞器的方法。
首先，将细胞悬液进行差速离心，将上清液收集起来。
然后，通过连续的离心步骤，可以逐渐将不同密度的细胞器分离出来。
这种方法操作简单，适用于一些对纯度要求不高的实验。
总结。
以上介绍了几种常用的分离细胞器的方法，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际操作中，可以根据实验的需要选择合适的方法进行细胞器的分离，以获得满意的实验结果。
细胞组分的分级分离方法
细胞组分的分级分离方法
细胞组分的分级分离方法包括密度梯度离心法、贴壁培养法、超速离心法、层析法和电泳法。
密度梯度离心法是根据细胞密度的不同，在高速离心机中经过长时间离心，使细胞分层沉淀，形成密度梯度。
根据密度梯度的不同，可以将不同密度的细胞分开。
这种方法分离效果好，可以获得较为纯的细胞，适用于大多数细胞类型的分离。
但这种方法需要使用大型设备，操作也比较复杂，需要专业人员操作。
贴壁培养法是根据细胞贴壁生长速度的不同，将不同种类的细胞分离。
这种方法需要在培养皿中加入适量的培养液，然后将待分离的细胞悬液加入培养皿中，让其在培养液中贴壁生长。
由于不同种类的细胞贴壁生长速度不同，因此经过一定时间的培养，可以观察到不同种类的细胞在培养皿中形成的“岛屿”状分布。
根据不同种类的细胞形成的“岛屿”状分布的不同，可以将它们分离出来。
此外还有超速离心法、层析法和电泳法等方法。
这些方法各有特点，可以根据实验需求选择合适的方法进行细胞组分的分级分离。
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• 高等植物叶绿体制备 • 动物细胞线粒体的分离
实验目的
• 通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞 的组分，以了解其原理及过程。
实验原理
•
细胞内不同细胞器的比重和大小都不相同，
在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一
原理，用不同转速的离心法，将细胞内各种组分
分级分离出来。
•
（一）差速离心 Differential centrifugation
• 特点：
– 介质密度均一； – 速度由低向高，逐级离心。
• 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 • 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——
内质网与高基体——核蛋白体。 • 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分
离纯化。
Differential centrifugation
High speed
Low speed
（二）密度梯度离心
• 用介质在离心管内形成一连续或不连续的 密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质 的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、 分离。
• 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。
Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation
各种匀浆、研磨器
分级分离(Fractionation)
• 由低速到高速离心逐渐沉降细胞器。 • 先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的
转速将上清液中的小颗粒沉淀下来。 • 由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在
离心开始时均匀分布在整个离心管中，所 以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯 的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以 纯化。
即是叶绿体。 • 7、悬浮叶绿体：沉淀中加入制备液适量，用吸管吹打悬浮、混匀： • 8、镜检分离效果： • （不做）9、叶绿体被膜完整度的测定 ：铁氰化钾光还原的Hill反应
叶绿体的分离应该注意哪些问题？
• 1、选材 • 2、低温 • 3、缓冲系统：渗透压、PH、防氧化 • 4、研磨程度 分，可用细胞化学和生 化方法进行形态和功能鉴定。
实验用品
• 见指导。
一、叶绿体的分离
细胞中及匀浆中的叶绿体
叶绿体的分离步骤
• 1、采样、洗涤、去叶脉：最好在晴天上午10时左右选取生长正常的 菠菜叶子（菜心、白菜、豌豆也可）洗干净，用吸水纸擦干，去柄及 粗脉
• 2、预冷：放入4C冰箱预冷1h； • 3、研磨匀浆：称2克叶子在玻璃研钵中剪碎，先加1－2m1制备液，
• 分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆， 在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其 过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步， 这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理 化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)
• 低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入 等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一 0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成 为各种细胞器及其包含物的匀浆。
快速磨成匀浆，然后再加8m1制备液，磨匀； • 4、过滤：把匀浆倒在6层沙布上过滤入小烧杯； • 5、离心去完整细胞、细胞核等：上述滤液转入10ml离心管，平衡后
在约500rpm（每分钟的转速）离心2分钟，上清转入另一离心管； • 6、离心收集叶绿体：上清液在2600rpm离心5分钟，弃上清液，沉淀