鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞的培养
鸡胚原代细胞的培养{能力目标}·了解鸡胚的发育过程。
·掌握鸡胚原代细胞制备及培养技术。
{实验器材}(1)Hank's液、含10%~20%血清的细胞培养液、碘酊棉、酒精棉、0.25%胰酶。
(2)超净工作台或生物安全柜、细胞培养瓶、吸尔球、灭菌吸管、平皿、毛吸管、离心管、剪刀、小镊子、培养箱、倒置显微镜。
{实验内容及操作步骤}一、鸡胚的孵育受精鸡胚放在蛋托上，大头朝上，人温箱培养。
在温箱底部放上一盘水，将温度调至37.8℃即可。
二、鸡胚的发育过程(1)观察方法：将9~12日龄的鸡胚取出，放人平皿中进行观察。
(2)鸡胚的发育：要采用鸡胚进行细胞培养时，应对鸡胚的发育有一个初步了解。
鸡胚的发育是由受精卵开始的，它在通过输卵管时，已开始分裂，当产卵时已在卵黄上部形成一层细胞，名为胚盘，在适宜的条件下胚盘继续分裂生长。
在发育过程中由卵黄和卵白中获取养料和水分，由于胚体与卵黄分开的缘故，胚胎只通过卵黄带与卵黄相连。
发育的早期形成三个胚层，即外胚层、中胚层和内胚层，由此形成胚胎的各个器官和组织。
一般孵育至第3d出现尿囊，为直肠腹侧部分的膨出物，尿囊膜是由内胚层和中胚层构成的。
至第4~5d胚体为羊膜、尿囊膜及绒毛膜层包被。
羊膜系由外胚层和中胚层组成，开始时紧贴于胚体上，后来腔内逐渐充满羊水。
尿膜在生长发育的过程中，与绒毛膜相连而成绒毛尿囊膜，此膜为三层细胞组成。
外层为外胚层，内层为内胚层，中间为中胚层细胞，其中血管甚多有两条主动脉自卵黄囊延伸到此膜中，与此并行有两条主静脉，汇流成一较大的尿囊静脉。
绒毛尿囊膜系鸡胚的呼吸器官，位于壳膜之内。
此膜生长发育很快，第10d己包围了整个鸡胚，此时鸡胚己出现羽毛，呼吸道的发育在第12~15d之间出现。
'胚胎体积逐渐增大时，胚胎腔外体液亦日趋减少，孵出小鸡时已无胚胎腔外体液。
在发育早期，尿囊液及羊水的成分与生理盐水溶液相差无几，12d后羊水的蛋白含量及黏稠度增加，尿囊腔积累了肾脏的排泄物，因此，在12d或13d 后，尿囊液由于尿酸盐的存在，使原来透明的液体呈现混浊。
鸡胚细胞的原代培养
2.塑料篮子内：无菌袖套
操
1. 2. 3. 4. 5. 6.
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中清洗。
标记气室示意图
操
• • • • • •
作
照egg, 画气室线。 戴无菌袖套。点燃酒精灯，手部消毒。 台面消毒; 将egg置于蛋座（气室朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 小镊撕内膜，挑出鸡胚→培养皿A中用 Hank’s液清洗。
鉴定各种细胞产物的程序。
无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某
种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞 株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需 补加物也不同。
无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶
段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养 基使用时还需添加血清
人间充质干细胞无血清培养基:上海依科赛公司 CHO无血清培养基：维森特公司 树突状细胞无血清培养基：达优公司
肺
肝
腿部 肌肉
肾脏
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
注 意
清理台面,用品洗净,交回。酒பைடு நூலகம்灯和酒精棉球瓶要补 加酒精。 实验报告：这次的原代培养与细胞传代和冻存的实验 一起写一份细胞报告。 重点：要对实验结果进行分析和讨论。 实验考核：本次实验的实验结果记入一次实验课成绩 考核内容。无菌实验操作记入实验考核。
鸡胚细胞的原代培养
摘自 《细胞培养基本知识》-Invitrogen
细胞培养的用途
照片来自 《动物细胞培养-基本技术指南》
提
纲
1.培养基的类型及配制 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作
细胞生物学实验-细胞的原代培养
2017.10.12
一、实验原理
原代培养是直接从机体获取组织后,通过组织块长 出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单 个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培 养。
原代培养的方法主要包括组织块培养和分散细胞 培养。
组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶 壁上，加入培养基后进行培养。
养皿（或一次性无菌培养皿）中，并用D-Hanks液冲 洗鸡胚。
6. 用无菌眼科剪去除鸡胚的头部、四肢以及内脏，
然后用D-Hanks液充分洗涤躯干。
7.将躯干部置于小平皿盖中。用D–Hanks液至少洗涤3 次，充分弃除红细胞。
8.用无菌眼科小剪刀将鸡胚躯干剪成1mm3的碎块。
9.在胚胎组织碎块中加入1毫升（1滴管）胎牛血清， 用滴管吸取组织块，将组织碎块接种到培养瓶内。 在培养瓶中放置10-15个组织块，静置3-5 min，然 后反转培养瓶，使接种组织块的培养瓶面在上。
四、注意事项
1.原代培养材料的选择,尽量选取胚胎或幼小的生物体组织或 者繁殖能力较强的组织，如肿瘤组织等。 2.要注意无菌操作。其要求应高于外科手术。 3.如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能粘附于瓶壁时 再使之与培养液接触。翻转培养瓶时要轻，勿使组织块漂浮 起来。如果组织块没有粘壁，则细胞不易生长，既使生长也 因没有贴在瓶壁上，而无法收集到。
分散细胞培养则是将组织块用机械法或化学法使细 胞分散成为单细胞。
鸡胚（chick embryo or embryonated egg）
பைடு நூலகம்对鸡胚的研究可以追溯到古希腊亚里士多德， 鸡胚在疫苗的开发和研究中有着不可替代的作用。
二、实验目的
1.了解原代细胞培养的一般方法与步骤 2.了解鸡胚的基本结构 3.巩固无菌操作技术
实验三、鸡胚细胞的原代培养
原代培养的概念
原代培养 （primary culture）：也叫初代 培养，指直接从体内取出的细胞、组织 和器官进行的第一次的培养。在首次传 代前的培养可认为是原代培养。原代培 养的细胞生长比较缓慢。
原代培养
• 优点：组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未 发生很大变化，在一定程度上能反映体内状 态。在供体来源充分、生物学条件稳定的情 况下，采用原代培养做各种实验，如药物测 试、细胞分化等，效果很好。
• 2．操作前要洗手，进入超净工作台后手要 用75%酒精擦试，试剂瓶等也要擦试。
• 3. 凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用 盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
• 4. 在超净台中，组织细胞、培养液等不能 暴露过久，以免溶液蒸发。
• 5. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐 热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧 灼时间不能太长，并冷却后才能夹取组织， 吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧 焦形成碳膜。
• 二、 培养细胞的生长方式 • 1、贴附生长：必须贴附于支持
物表面才能生长。见于各种实体 瘤细胞 • 2、悬浮生长：于悬浮状态下即 可生长，不需要贴附于支持物表 面。各种造血系统肿瘤细胞
每代贴附生长细胞的生长过程
• 潜伏期 • 对数生长期 • 停止期（平台期）
• 游离期：
• 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也 称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆 球形。
• A.切取合适大小的组织块或者器官，在平 衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污， 剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组 织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保 持湿润；
• B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中， 剪碎，（接种），组织碎块和培养液一 起移到离心管中，吸去上清液；
C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ；
鸡胚成纤维细胞的培养2008
细胞数/mL=4大格细胞总数/4×10 000×稀释倍数 注意事项 1、 务必使细胞分散成单个细胞，取样计数前，应充 分混匀细胞悬液。 2、 对于分布在刻线上的细胞，依照“数上不数下， 数左不数右“的原则进行计数。计数时，如发现各中方格 的细胞数目相差20个以上，表示细胞分布不均匀，必须 重新计数
[实验内容及操作程序] 1. 取胚及剪碎 将胚蛋气室端向上直立于蛋座上， 用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，撕破卵膜， 继撕破绒尿膜、羊膜，取出胚胎于灭菌平皿中。剪去 头部、翅爪及内脏，用PBS液(简称P液)洗去体表血液， 移入另一灭菌平皿中，用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使成为 约1mm3大小的碎块，加3mL P液轻摇，后将P液与组 织碎块一起用滴管移入细胞瓶中。
6．分装到细胞瓶后放入37 ℃中进行培养.
防止污染是决定细胞培养是否成功的首要条件:
1. 在实验前,操作室,无菌工作台等实验场所需用紫外灯消 毒30分钟.
2. 实验前先洗手,并用75%的酒精消毒手及放入无菌台的 器具.
3. 在进入无菌台后,先点燃酒精灯.吸管在吸液体前,瓶口在 打开和关闭前都应在火焰上旋转灭菌,以免附在瓶口的细菌污染 液体.烧过的金属器械要待冷后才能接准确,敏捷,但不必太快,以 免引起空气流动过大,增加污染机会.为拿取方便,工作台面上的 用品要合理摆放.液体在未用前不要过早打开瓶盖,用后应及时 封闭瓶口.操作时不要向着无菌台讲话或咳嗽,以免把口腔中的 微生物带入工作台而发生污染.
1、用镊子敲碎气室的蛋壳部，掀开各层膜，取出胚体。 2、放进平皿中，去头，去肢，去内脏，用PBS洗涤。 3、洗好的组织放进另外一半平皿，加一管PBS，一起剪 碎组织。 4、静置一段时间，吸出一部分清液，将组织和少量的清 液一起移入细胞瓶。 5、吸取胰酶到细胞瓶中，放入水浴锅消化，5min摇动一 次，到液体混浊，20-30分钟。 6、加入两管PBS，吹打，静置1min，吸出上层的清液， 再加入PBS,重复1-2次。 7、加两管培养基到另外一个细胞瓶中，盖好盖子备用。 （旧瓶）加一管培养基，吹打，静置少许时间，吸取适 量的悬液（此时是细胞悬液），放入加好了培养基的新瓶 中，稍微吹散。 8、放入37℃温箱培养。
鸡胚原代细胞培养
鸡胚原代细胞培养鸡胚原代细胞培养细胞是一微小而完整的生命单位，它组成各种生物体并生长、繁殖。
在生命体外，如果提供类似生物体内的环境条件，细胞也能生长繁殖。
要使每个细胞都能从人造环境中获得营养物质，必须将组织块分散成单个细胞。
组织培养法是目前培养病毒应用最广的一种方法，其优点是：一般没有隐性感染，没有免疫抵抗力，便于选择易感细胞，实验条件易于控制，成本便宜，经济适用。
组织培养法多应用于病毒的分离、鉴定、病毒感染细胞的机制、生产疫苗和抗原等。
很多组织，包括鸡胚，各种动物的肾脏组织，人胎羊膜细胞或流产胎儿组织等均可作组织培养的来源。
细胞来源的选择，主要是根据细胞对病毒的敏感性而定。
组织培养的方法中以单层细胞培养是最常用的方法，它又有原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系三种类型。
原代培养是指将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。
本试验介绍原代细胞的鸡胚成纤维细胞培养方法。
（一）实验目的了解单层细胞培养方法（二）实验材料1、10日龄鸡胚。
2、1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒。
3、无菌组织培养瓶、吸管、滴管、剪子、镊子、超净工作台、CO2培养箱、蒸水器、纯水器（生物级）、滤器、真空泵、高压灭菌锅、培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）。
（三）实验方法1、用碘酒消毒鸡卵气室端外壳，并将鸡胚直立于卵架上。
以镊子将小鸡取出放在无菌培养皿内，去头，爪、内脏和骨骼，用Hanks氏溶液洗2-3次。
2、用小剪在小烧瓶内将鸡胚剪成小块（1～２mm3），加Hankr 氏溶液（约１０ml）冲洗2-3次，静置１～２分钟，用毛细吸管吸去液体，依同法再洗涤２次，将血球充分洗去。
实验一——鸡胚成纤维细胞的培养PPT课件
拔出瓶塞、塞上瓶塞时瓶口和塞子要灼烧；倾 倒液体前后都要灼烧瓶口，并且瓶口向下，低 于瓶底；倾倒液体时两瓶口之间不能接触。
瓶内是严格无菌的，所以要保证吸管不接触到 瓶口的外壁。若一旦接触，更换新的吸管。
1 5
3
实验材料
预加10%FCS和双抗的1640培养液；消化液 (0.25%胰蛋白酶- 0.02%EDTA溶液)；DHanks平衡盐溶液；
灭菌培养皿、青瓶、细胞培养瓶各1个； 巴氏吸管若干支、纱布若干；眼科镊1把，剪
刀1把； 碘酒，75％酒精棉球；酒精灯1台；废液缸。
4
实验设备
（1） 37℃-CO2培养箱 （2）倒置显微镜 （3）超净台
5.培养 于37℃-CO2温箱内培养。24-48h后可长成 单层细胞。
1 0
实验结果
1、观察原代细胞的形态和生长状况；
2、如出现细胞培养液浑浊情况，请鉴别是否细 菌污染。
1 1
注意事项
1. 切割组织块时务必要切成小块 2. 整个操作过程要严格保持无菌 3.严格控制胰酶消化时间 4. 放入孵箱前应在培养瓶表面标明细胞名称、日期 和组别 1 5. 实验用品放回原处，摆放整齐
2
无菌操作的一般要求
用75％酒精擦拭消毒双手。 超净台台面应整洁，用0.1％新洁尔灭擦净。 打开超净台的紫外灯照射台面30min左右。使用
超净台时，打开风机，点燃酒精灯。
1 3
严格在酒精灯无菌范围之内操作。 使用巴氏吸管以及其他吸管时，取出后要手拿末端
安上橡皮头后，过酒精灯火焰略烧后插在无菌盐水 瓶或试管内。 操作时，严禁说话，尽量不用手直接拿无菌的物品， 如瓶塞等，而要用器械，如镊子等去拿。 不能用手接触瓶口、吸管口以及镊子和剪刀的头部。
原代细胞培养
鸡胚原代细胞的培养[实验目的]掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序，观察单层细胞生长情况。
[实验材料]9~10日龄鸡胚，Hank`s液（已含0.5%乳蛋白水解物），0.25%胰蛋白酶，NaHCO，双抗，3牛犊血清，手术剪，眼科镊，培养皿，细胞瓶，三角瓶，玻璃珠（置于三角瓶内），漏斗，纱布（置于漏斗中），30ml注射器，10ml注射器，塞子若干，蛋座，水浴锅。
[实验内容及操作程序]1、配液在Hank`s液中加入青、链霉素，使其含量为青霉素1000IU/ml，链霉素100ug/ml。
胰蛋白酶用含有青链霉素的Hank`s液（简称H液）按1:9比例稀释。
用7.5%NaHCO调整pH至7.2~7.4（玫瑰红色）。
32、取胚及剪碎将胚蛋气室端向上竖直于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并弃之，注意不能让蛋壳碎屑掉入气势内，撕破卵膜并揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，用镊子夹住或勾住鸡胚脖子部位，取出胚胎于平皿中。
剪去头部、翅爪及内脏，用H 液洗去体表血液。
用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使其成为约1mm3大小的碎块，用H液小心洗涤2次。
3、消化将洗涤好的胚胎碎块转移入三角瓶中，尽量不要让组织块沾到平皿壁上，按组织块量约3~5倍胰酶，加上瓶塞，37℃水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次。
待液体变混而稍稠，中止消化。
4、分散取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后轻轻倒去胰酶，塞好瓶塞，用力振摇三角瓶，以使细胞分散下来。
加入H液，轻轻振荡，待组织块下沉后，通过漏斗中的纱布将H液过滤于细胞瓶中，小心不让组织块一并倒出。
继续用力振摇三角瓶，加H液过滤，重复两次，最后一次连同组织块一起倒入漏斗。
5、加入血清在过滤好的细胞悬液中加入牛犊血清，使血清含量为10%。
塞好瓶塞，轻摇细胞瓶混匀。
6、分装将加入血清的细胞悬液分装至各个细胞瓶中，约占细胞瓶容积的10%左右。
塞紧瓶塞，将细胞瓶横卧，瓶上注明组别、日期，置37℃温箱培养。
4h后细胞可贴附于瓶壁，每隔24h观察一次，24~36h生长成单层细胞，此时可吸取培养液，更换维持液，并接种病毒。
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鸡胚原代细胞培养
［实验材料］
9~１0日龄鸡胚,Hanｋ”s液5０mL,０.5％水解乳蛋白液或MEＭ培养液20ｍL(内含犊牛血清１mL,双抗0。
2ｍL,ｐH7、2),O。
25％胰蛋白酶5mL、7％Ｎa ＨC031mＬ,手术剪,镊子,灭菌得培养皿,５0ｍL三角瓶,滴管若干,链霉素小空瓶若干(加入细胞悬液培养用),高压灭菌塞子若干,培养盘,蛋座,95%酒精,水浴锅。
［实验内容及操作程序]
１。
配液制备细胞前先在Hｎａk＂s液中加青、链霉素,使其含量为青霉素1０0ＩU／mL,链霉素10０μｇ/mＬ,用7％NａＨC０3调整pH至7.２～7.４,将胰蛋白酶调整ｐＨ7.6(玫瑰红色)、置3７℃水浴锅中预热备用、
2。
取胚及剪碎将胚蛋气室端向上直立于蛋座上,用碘酊消毒气室,以镊子击破卵壳并弃之,撕破卵膜揭之,继撕破绒尿膜、羊膜,取出胚胎于灭菌平皿中、剪去头部、翅爪及内脏,用Hａnｋ"s液(简称Ｈ液)洗去体表血液,移人灭菌三角瓶中,用灭菌剪刀剪碎鸡胚,使成为约1mm3大小得碎块,加5mＬH液轻摇,静止1～２min,使其组织块下沉。
吸去上层悬液,依同法再洗2次,至上悬液不混浊为止,吸干H液留组织。
3.消化自水浴锅内取出预热得胰酶,按组织块量约３～5倍加入三角瓶中,１个鸡胚约需5mL胰酶,三角瓶上加塞,以免CＯ２挥发及污染、37℃水浴约２0mｉn 左右,每隔５ｍiｎ轻轻摇动1次,由于胰酶作用,使细胞与细胞之间得氨基与羧基游离,待液体变混而稍稠,此就是再轻摇可见组织块悬浮在液体内而不易下沉时,
则需中止消化,如再继续消化下去可破坏细胞膜而不易贴壁生长,如果消化不够,
则细胞不易分散。
4.洗涤取出三角瓶后静置１miｎ,让组织块下沉后,吸去胰酶液,用10mL Hａnk”ｓ液反复轻洗３次,以洗去胰酶,吸干上清液,留组织块。
５.吹打加２mL含血清得0.5％水解乳蛋白营养液或:MEＭ培养液,以粗口吸管反复吹吸数次,使细胞分散,此时可见营养液混浊即为细胞悬液、静置１ｍin,使未冲散得组织块下沉后,小心地将细胞悬液吸出1mＬ于20mL营养液中,此液细胞数约5０万~７0万/mＬ、如需大量细胞,可继续加营养液冲打,一个鸡胚约可做10０ｍＬ细胞悬液。
6。
细胞计数取上述细胞悬液0.５mL加入0.１％结晶紫一柠檬酸(0。
1mol/L)溶液2mL,置室温或37℃温箱中５~10mｉn,充分振动混合后,用毛细管吸取滴
人血细胞计数板内,在显微镜下计数。
计数方法按白细胞计数法,计算四角大格内完整细胞得总数。
如３～５个聚集在一起,则按1个计算,然后将细胞总数按下法换算成每毫升中得细胞数、
细胞数/ｍＬ=4大格细胞总数／4×10 00０×稀释倍数
例如:4大格得细胞总数为2８4个,而稀释倍数为5(０。
5mL染色液),则每毫升细胞悬液得细胞数为２84／４×10000×5=3。
5×１04个。
7。
稀释按照每毫升50万~70万个细胞密度得标准,将细胞悬液用营养液稀释之。
(计数时,可见到大部分细胞完整分散,3~5个细胞成堆,且细胞碎片很少,说明消化适度;如分散细胞少,则消化不够;如细胞碎片多,则消化过度。
)
活细胞计数法取2％台盼蓝溶液１滴,细胞悬液1滴,混合计数,活细胞不着色,死细胞呈蓝色。
8.分装培养分装于链霉素瓶中,每瓶约１mL,瓶口橡皮塞要塞紧。
不合适者弃去,以免漏气造成污染或C0２跑掉而营养液变碱。
将细胞瓶横卧于培养盘中,于瓶上面划一直线,以表示直线得对侧面为细胞在瓶内得生长位置。
瓶上注明组别、日期,置3７℃温箱培养,４ｈ后细胞即可贴附于瓶壁,24～3６h生长成单层细胞,此时可吸去培养液,更换维持液,并接种病毒。
附:细胞培养所需得常用培养基与试剂
1。
Hanｋ’s液配制
原液甲
NａＣl8g
ＫCl 2g
ＭgSO4·7H20 2ｇ
MgCｌ2·６H2０2g
２、8％CaＣl2 10０mL
双蒸水加至1 00０mL
先将固体成分加于800mL双蒸水中,加温到５０~60℃加速溶解,再加入ＣaCl2溶液,最后加双蒸水补足到１0０0mL。
加氯仿２ｍL,摇匀后于４℃贮存。
原液乙
Na2HＰO4·2H2０1。
2g
KH2PO4·２H20 １.２g
葡萄糖2０g
0。
4％酚红lOOmL
双蒸水加:1000mＬ
将上列各物混合后使其溶解,加氯仿2ｍL,摇匀后于4℃贮存、
Ｈanｋ"s工作液
原液甲1份
原液乙１份
双蒸水１８份
工作液分装１00mL,或５０0mL盐水瓶中,115~C灭菌10min,使用前以7％NaHCO３调节
pＨ至07.２~7。
6。
2.0.４%酚红溶液配制
酚红0。
4g
0。
1%NａOＨ溶液11。
28mＬ
将酚红置于研钵中,加磨边缓缓加NaＯH溶液,直到所有颗粒完全溶解,置于至ｌOOmL量杯中,最后加双蒸水至lOOｍL,摇匀后,保存于4℃冰箱内备用。
3、0.５％乳蛋白水解物溶液配制
乳蛋白水解物5g
Ｈａnｋ"s液l 000mL
将乳蛋白水解物放入１000mL Ｈanｋ”s液中,待完全溶解后,摇匀分装于ｌＯOmL得盐水瓶中,每瓶９5mL,115℃lOmｉn灭菌,4℃贮存备用。
4。
营养液(生长液)配制
O.5％乳蛋白水解物９５mL
犊牛血清5mL
青霉素、链霉素lmL
将上述溶液混合后,以7％NａＨＣO３适量调节pH到７、2～7。
4。
维持液按上述方法,加
犊牛血清２。
５mL即成。
5.ＭＥM培养液MＥＭ培养基一袋,加1 000mL双蒸水,过滤除菌或高压灭菌,分装于100ｍl盐水瓶中,每瓶90ml,用前以7%ＮaHC03调pH到7.2~7、4,并加１０％犊牛血
清、
6、双抗配制
青霉素１00万IＵ
链霉素１g
Hａｎk"s液１00mＬ
将青、链霉素溶解于:1０0mL Haｎk”s溶液中,此为双抗溶液,无菌操作,分装小瓶,每瓶:lmL,内含有青霉素IIＵ,链霉素10000μg,低温冻结保存、
使用时每１00ｍL营养液中加双抗lｍL,即每mL营养液中含青霉素１0０IU,链霉素
1０0ｇμg。
7、７% NaHCＯ3溶液配制
ＮaHCO３7g
双蒸水1００ｍL
将NaHＣ03溶于双蒸水中,置水浴锅中加热溶解,1１５℃10mｉn灭菌后,无菌操作分装
小瓶,每瓶lmL,4℃保存。
8. 0。
25%胰蛋白酶配制
胰蛋白0、25g
Ｈａｎg’s液100mＬ
将胰蛋白酶溶于Ｈank＂s液中,待完全溶解后,用0、２μm滤膜过滤,检验无菌后才能使用、无菌分装小瓶,每瓶5mＬ,低温冻结保存、使用时,以7％NaHＣ０3调节pH到7.６-7、8。