志贺氏菌属诊断血清说明书
志贺氏菌
四、志贺氏菌检验标准操作程序11 范围本标准规定了食品中志贺氏菌（Shigella）的检验方法。
本标准适用于食品中志贺氏菌的检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 厌氧培养装置：41.5 ℃ 1 ℃。
2.4 电子天平：感量0.1 g。
2.5 显微镜：10×～100×。
2.5 均质器。
2.6 振荡器。
2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。
2.8 无菌锥形瓶：容量100 mL、200 mL、2 000 mL。
2.9 无菌培养皿：直径90 mm。
2.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.11 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂3.1 GN增菌液：见第A.1章。
3.2 志贺氏菌增菌肉汤：见第A.2章。
3.3 麦康凯（MAC）琼脂：见第A.3章。
3.4 木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）琼脂：见第A.4章。
3.5 志贺氏菌显色培养基3.6 三糖铁（TSI）琼脂：见第A.5章。
3.7 营养琼脂：见第A.6章。
、3.8 葡萄糖半固体管：见第A.7章。
3.9 葡萄糖铵培养基：见第A.8章。
3.10 尿素琼脂：见第A.9章。
3.11 β-半乳糖苷培养基：见第A.10章。
3.12 氰化钾（KCN）培养基：见第A.11章。
3.13 氨基酸脱羧酶试验培养基：见第A.12章。
3.14 糖发酵管：见第A.13章。
1顾启芳，郭云昌。
3.15 缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR和V-P试验用）：见第A.14章。
3.16 西蒙氏柠檬酸盐琼脂：见第A.15章。
3.17 醋酸盐培养基：见第A.16章。
3.18 粘液酸培养基：见第A.17章。
3.19 蛋白胨水、靛基质试剂：见第A.18章。
3.20志贺氏菌属诊断血清。
4 检验程序志贺氏菌检验程序见图1。
志贺氏菌检测流程
志贺氏菌属检验的标准操作程序【目的】指导检验伤寒、副伤寒沙门氏菌。
【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。
【标本的采集】由受检者将采便用已蘸有甘油盐水的棉棒自行插入肛门内，轻轻转动，然后取出，插入带有编号的塑料试管中，交给检验科人员。
【检验程序】采便→立即划线接种SS平板→培养后挑取可疑菌落接种三糖铁斜面及半固体培养基→生化学试验→血清学试验→报告检验结果。
【操作步骤】1. 分离培养采便后立即用采便棒划线接种SS琼脂平板。
36±1℃培养18-24小时，挑取无色半透明的光滑菌落分解乳糖或迟缓分解乳糖的光滑菌落，接种三糖铁斜面及半固体，36±1℃培养18-24小时。
2. 生化学试验凡是三糖铁反应符合志贺氏菌属特征者（斜面产碱或不变色，底层产酸，H2S（—），产气（—），但福氏6型产生少量气体）、无动力、革兰氏阴性杆菌、作V-P试验，苯丙氨酸，赖氨酸，柠檬酸盐，葡萄糖铵试验。
其结果全部阴性者，作血清学试验。
3. 血清学试验挑取三糖铁斜面上的培养物，按下列顺序作玻片凝集试验：四种志贺氏——→福氏————→宋内氏————→志贺氏————→志贺氏多价血清多价血清血清 2型血清 1型血清∣ + ∣ +∣ +∣ +∣—∣↓↓↓↓∣福氏菌宋内氏菌志贺氏2型志贺氏1型↓ 1-6型某型+鲍氏 7-11型某组+：组内分型血清———→鲍氏某型血清： 12-15型全部—：加热破坏K抗原，重做凝集试验16-18型福氏菌的鉴定：凡是与福氏多价血清凝集的菌株，可先用3、4，群6，群7，三种因子血清检查，根据群因子血清反应结果，再用型因子血清检查。
福氏菌抗原成分如下。
第四节_志贺氏菌
http://www.bioberedskab.dk /agens/shigella/shigel6.jpg
8
4．抗原构造与分型
抗原构造: 有 O抗原和K 抗原
志贺氏菌扫描电镜照片
/ diseases/shigella.php
(1) O抗原： *菌体表面主要的脂多糖蛋白复合物，耐热，稳定。 分类（分群、血清型和亚型）的依据 *血清型分型用血清凝集试验 （2）K 抗原 菌体表面抗原，不耐热，100℃1 h即被破坏。 K 抗原与分型无关； 此抗原可阻止0抗原和O抗体的凝集。加热破坏K抗原后，0抗 原和O抗体仍可凝集。
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含乳糖（-）、胆盐、染料指示剂
含乳糖、伊红＋美蓝
4．6 初步生化实验用培养基
4．6 三糖铁琼脂(TSl)：按GB／T4789.28--2003中4.26、 4.27规定。 硫化氢实验和糖分解实验。乳糖和蔗糖10，葡萄糖1，斜面菌多，穿刺菌少，分解糖慢。
二 选 一
4．7
4．8
葡萄糖半固体管：按GB／T4789．28--2003中4．31规定。 鞭毛动力测定实验用。 半固体管：按GB／T4789．28—2003中4．30规定。 鞭毛动力测定实验用。
三糖铁琼脂(TSI)成分： 蛋白胨 20.0g 牛肉膏 3.0g 乳 糖 10.0g 蔗 糖 10.0g 葡萄糖 1.0g 硫酸亚铁铵(含6个结晶水) 0.5g 酚 红 0.025g或5g/L溶液5mL 氯化钠 5.0g 硫代硫酸钠 0.5g 琼 脂 12.0g 蒸馏水 1000.0mL
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原理分析：
审判长 审判员 代理审判员 二00三年六月五日 书记员 书记员
3
第二节
志贺氏菌检验
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志贺氏菌检验
1 宋内氏典型菌落
XLD
志显
2 福氏典型菌落
XLD
志显
3 鲍氏典型菌落
XLD
志显
4 痢疾典型菌落
XLD
志显
5 熟肉制品中宋内的分离效果
R&F志显
XLD
6 蔬菜制品中宋内分离效果
XLD
志显
7 鲍氏在生肉中的分离效果
XLD
志显
8 熟肉制品中福氏的分离效果
志显
（四）初 步 生 化
• 选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种TSI、葡萄糖 半固体、营养琼脂斜面，36 ℃1 ℃培养20 h～24 h， 观察结果。
白色不透明圆形边缘不整齐直mm3mm菌落周围琼脂颜色变为紫红色宋内氏典型菌落xldxldxld熟肉制品中宋内的分离效果rf志显xld蔬菜制品中宋内分离效果xld鲍氏在生肉中的分离效果xld选取平板上5个或5个以上可疑菌落接种tsi葡萄糖半固体营养琼脂斜面36培养20h24培养物中出现以下情况可以弃去a
（二）、培养特性
1 、 需 氧 或 兼 氧 性 厌 氧 ， 最 适 温 度 37℃ ， PH7.2~7.4
2、在普通琼脂和SS平板上，能形成圆形、微凸、 光滑湿润、无色半透明、边缘整齐、在中等大小 的菌落
3、宋氏志贺氏菌菌落较大，较不透明，粗糙而扁 平，在SS平板上可迟发酵乳糖，菌落呈玫瑰红色。
4、在肉汤中呈均匀混浊生长，无菌膜。
• 若出现的菌落不典型或菌落较小不易观察， 则继续培养至48 h再进行观察。
菌落特征
• MAC琼脂 ：无色至浅粉红色， 半透明、光滑、 湿润、圆形、 边缘整齐或不齐，直径2～3 mm
• XLD琼脂 ：粉红色至无色，半 透明、光滑、 湿润、圆形、边缘整齐或不齐， 直径1 ～2 mm
志贺氏菌检验操作规范
上海味泽生物科技有限公司志贺氏菌检验1 范围本标准规定了食品中志贺氏菌的检验方法。
本标准适合用于各类食品和食物中毒样品中志贺氏菌的检验。
2 术语和定义2.1志贺氏菌志贺氏菌shigella是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌dyseatery bacteria。
致病性较强，感染10-200个即可发病，人类是唯一的患者和带菌者。
3设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。
3.2冰箱：2℃～5℃。
3.3恒温水浴箱：46℃±1℃。
3.4天平：感量0.1g。
3.5震荡器。
3.6无菌吸管:1ml（具0.01ml刻度）、10ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。
3.7无菌锥形瓶：250ml 500ml。
3.8无菌培养皿：直径90mm。
4 培养基和试剂4.1 GN增菌液4.2 HE琼脂4.3 SS琼脂4.4麦康凯琼脂4.4伊红美蓝琼脂（EMB）4.5三糖铁琼脂（TSI）4.6葡萄糖半固体管5 操作步骤5.1增菌以无菌操作取检样25g(ml),加入装有225mlGN增菌液的广口瓶内，固体食品用均质器以8000r/min打碎1min,或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃±1℃培养6h～8h。
培养时间视细菌生长情况而定，当培养液出现轻微混浊时即应中止培养。
5.2分离和初步生化试验5.2.1取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板一个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板一个，于36℃±1℃培养18h～24h，志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明不发酵乳糖的菌落。
5.2.2挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各一管。
一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃±1℃培养18h～24h，分别观察结果。
5.3判定下述培养物可以弃去：a)在三糖铁琼脂斜面上呈蔓延生长的培养物；b)在18h～24h内发酵乳糖、蔗糖的培养物；c）不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培养物；d）产气的培养物；e）有动力的培养物；f）产生硫化氢的培养物。
志贺氏菌检测
志贺氏菌的检验（国标法）一、增菌称取检样25g ,加入装有225mLGN增菌液的500mL广口瓶内，固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎lmin ,或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培育6〜8h。
培育时间视细菌生长状况而定，当培育液消失稍微混浊时即应中止培育。
二、分别和初步生化试验取增菌液1环，划线接种于HE琼脂平板或SS琼脂平板1个；另取1环划线接种于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板各1个，于36工培育18~24h e志贺氏菌在这些培育基上呈现无色透亮不发酵乳糖的菌落。
挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和葡萄糖半固体各1管。
一般应多挑几个菌落，以防遗漏，经36℃培育18~24h ,分别观看结果。
下述培育物可以弃去：a.在三糖铁琼脂斜面上呈扩散生长的培育物；b.在18~24h内发酵乳糖、蔗糖的培育物;C.不分解葡萄糖和只生长在半固体表面的培育物；d.产气的培育物；e.有动力的培育物；f.产生硫化氢的培育物。
凡是乳糖、蔗糖不发酵，葡萄糖产酸不产气（福氏志贺氏菌6型可产生少量气体），无动力的菌株，可做血清学分型和进一步的生化试验。
三、血清学分型挑取三糖铁琼脂上的培育物，做玻片凝集试验。
先用4种志贺氏菌多价血清检查，假如由于K抗原的存在而不消失凝集，应将菌液煮沸后再检查；假如呈现凝集，则用Al、A2、B群多价和D群血清分别试验。
如系B群福氏志贺氏菌，则用群和型因子血清分别检查。
福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原见表10可先用群因子血清检查，再依据群因子血清消失凝集的结果，依次选用型因子血清检查。
4种志贺氏菌多价血清不凝集的菌株，可用鲍氏多价1、2、3分别检查，并进一步用1~15各型因子血清检查。
假如鲍氏多价血清不凝集，可用痢疾志贺氏菌3~12型多价血清及各型因子血清检查。
四、进一步的生化试验在做血清学分型的同时，应做进一步的生化试验，即：葡萄糖镀西蒙氏柠檬酸盐赖氨酸和鸟氨酸脱竣酶pH7.2尿素KCN生长水杨昔和七叶昔的分解除宋内氏菌和鲍氏13型为乌氨酸阳性外，志贺氏菌属的培育物均为阴性结果。
志贺氏菌的检验
HE平板原理及反应
发酵乳糖的肠杆菌
不发酵乳糖的某种肠道菌，而且产生 硫化氢，可能是沙门氏菌
（一）进一步生化试验 即：葡萄糖铵，西蒙氏柠檬酸盐，赖氨酸和 鸟氨酸脱羧酶，pH7.2尿素，KCN生长，以 及水杨苷和七叶苷的分解， 36℃培养。 志贺氏菌属的培养物均为阴性结果。
（二）生化分群试验
接种生化培养基 从三糖铁琼脂上挑取培养物上,接种到： 5%乳糖发酵、甘露醇、棉籽糖和甘油发酵、靛基质 试验。 见P167：根据不同生化反应结果，可分为A群（痢 疾志贺氏菌）、B群（福氏志贺氏菌）、C群（鲍 氏志贺氏菌）、D群（宋内氏志贺氏菌）。
GB/T4789.5-2003 中志贺氏菌检验程序
（一）实验内容
样品处理→→选择性增菌→→选择性平板分 离→→生化学试验→→结果报告
第一次 样品处理和增菌培养
预先准备并灭菌的器材 规格名称 • 1、18×180mm试管
数量
6支
• • • •
2、10ml移液管 1支 3、直径为90mm平皿 2套 4、250ml量筒与500毫升广口瓶 酌情 7 、不锈钢汤匙1把 ，玻璃珠，杜氏小管 酌情
（三）生化反应
1、发酵葡萄糖，产酸不产气，除宋氏志贺氏 菌外，均不发酵乳糖。 2、不发酵侧金盏花醇、肌醇、水杨苷。 3 、不产生 H2S ，不分解尿素， V-P 试验阴性， 不能利用柠檬酸盐。 4、甲基红阳性，靛基质不定。 5、痢疾志贺氏菌不分解甘露醇，其它（福氏、 鲍氏、宋内氏）均可分解甘露醇。
志贺氏菌属(参照模板)
志贺氏菌属志贺氏菌属（Shigella）的细菌（通称痢疾杆菌），是细菌性痢疾的病原菌。
临床上能引起痢疾症状的病原生物很多，有志贺氏菌、沙门氏菌、变形杆菌、大肠杆菌等，还有阿米巴原虫、鞭毛虫、以及病毒等均可引起人类痢疾，其中以志贺氏菌引起的细菌性痢疾最为常见。
人类对痢疾杆菌有很高的易感性。
在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。
一、生物学性状志贺氏菌属细菌的形态与一般肠道杆菌无明显区别，为革兰氏阴性杆菌，长约2-3µm ,宽0.5-0.7µm 。
不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。
DNA的G+C 为49-53克分子%（Tm法）。
需氧或兼性厌氧。
营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为37℃，最适pH为6.4-7.8。
37℃培养18-24小时后菌落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、边缘整齐，直径约2nm，宋内氏菌菌落一般较大，较不透明，并常出现扁平的粗糙型菌落。
在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成。
本菌属都能分解葡萄糖，产酸不产气。
大多不发酵乳糖，仅宋内氏菌迟缓发酵乳糖。
靛基质产生不定，甲基红阳性，VP试验阴性，不分解尿素，不产生HS。
根据生化反应可进行初步分类。
2志贺氏菌属的细菌对甘露醇分解能力不同，可分为二大组。
A、不分解甘露醇组：主要为志贺氏菌。
又根据能否产生靛基质，进一步分靛基质阳性（1、3、4、5、6、9、10型）和靛基质阴性（2、7、8型）的志贺氏痢疾菌。
B、分解甘露醇组：包括福氏、鲍氏、宋内氏菌。
再按乳糖分解情况，分为迟缓分解乳糖的宋内氏和不分解乳糖的福氏和鲍氏菌。
后者进一步再根据靛基质产生与否，分靛基质阳性（福氏菌1、2、3、4、5型和鲍氏菌5、7、9、11、13、15型）和靛基质阴性（福氏菌6型和鲍氏菌1、2、3、4、6、8、10、12、14）二类（见表一）表一志贺氏菌属生化反应的分类葡萄糖（+）甘露醇（-）甘露醇（+）志贺氏菌志贺氏菌乳糖（-）乳糖（+）（1、3、4、（2、7、8型）5、6、9、10型）靛基质（-）靛基质（+）靛基质（-）福氏菌6型福氏菌（1、2、宋内氏菌鲍氏菌（1、2、 3、4、5型），3、4、6、8 鲍氏菌（5、7、9、10、12、14型） 11、13、15型）抗原构造与分型：志贺氏菌属细菌的抗原结构由菌体抗原（O）及表面抗原（K）组成。
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志贺氏菌属诊断血清学试验操作程序
1.目的
制定标准化的志贺氏菌属诊断血清操作程序，指导对志贺氏菌属的检测2.原理
用志贺氏菌属的代表菌株制成灭活菌抗原分别或混合免疫家兔所得的血清，经吸收出去非特异性凝集素后制成，通过凝集试验原理诊断各型志贺氏菌。
3.试剂及实验设备
3.1志贺氏菌属诊断血清：宁波天润生物药业有限公司生产的规格为22种的志
贺氏菌属诊断血清
3.2试剂保存：2~8°C避光保存，防止冻结，在有效期内使用。
3.3实验设备：玻片、吸样枪、接种环、水浴箱、玻璃管、血平板、营养琼脂、
电热高温接种灭菌器。
4.程序步骤
4.1将诊断血清于冰箱取出后平衡至室温。
4.2选择符合志贺氏菌属培养特性，并经初步生化检测符合志贺菌属生物特性的
疑似菌落。
4.3菌群分析
将经18~24h血平板上纯培养的待检菌，分别用志贺氏菌属4种多价血清做玻片凝集试验，凝集阳性时，再分别用群多价血清做玻片凝集试验，群多价血清凝集阳性时，再分别与相应的单价血清做玻片凝集试验，最终确定其血清分型。
如果志贺氏菌属4种多价血清做玻片凝集试验均为阴性，可能有以下3种可能性：①K抗原的存在，处理方法：取待检菌的纯菌落于生理盐水中制成浓度约2麦氏单位的菌悬液，置于100°C水浴中煮沸30min，泠却至室温后再用诊断血清进行玻片凝集试验；②非典型菌落，处理方法：通过在营养琼脂平板上的传代让其恢复抗原性，再用诊断血清进行玻片凝集试验；③诊断血清型以外的可送市或省CDC检测。
4.4玻片凝集试验法取18~24h血平板上纯培养的待检菌，用生理盐水制成2麦
氏单位的菌悬液，取诊断血清20μL于洁净玻片上，然后取20μL待检菌悬
液与血清混匀，轻轻摇动玻片，1min内呈现明显凝集者为阳性，呈均匀浑浊者为阴性，每次凝集试验均应以生理盐水作为阴性对照试验。
若与福氏志贺氏菌单价血清呈现凝集可参照福氏志贺氏菌诊断抗原表（见附表）及生化特性做菌型诊断。
5.质量控制
志贺氏菌属4种多价血清选择福氏志贺氏菌属为阳性对照株；选择大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照菌株。
同一批号每月进行一次质控试验，新批号试剂进行质控试验。
6.质量记录
7.参考文献
[1]卢锦汉主编.医学生物制品学.北京.人民卫生出版社.1995
[2]中国生物制品规程（2000年版）.北京.化学工业出版社.2000
附表：志贺氏菌属国内常见菌型诊断抗原表。