临床医学检验四、免疫标记技术名词解释(2016.04.09)
1.名词解释荧光寿命参考答案
荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。
2.名词解释亲和素参考答案
是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，和生物素结合后十分稳定。
每个亲和素能结合4个分子的生物素。
3.名词解释免疫放射分析(IRMA) 参考答案
是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争方法。
4.名词解释荧光免疫技术参考答案
将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方法。
5.名词解释封闭参考答案
是指在抗原或抗体包被ELISA板后，用1%～5%牛血清蛋白或5%～20%小牛血清等再包被，以防止非特异性吸咐的过程。
临床医学检验四、免疫标记技术名词解释（2016.04.09）
临床医学检验四、免疫标记技术名词解释（2016.04.09）
1.名词解释荧光寿命参考答案
荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。
2.名词解释亲和素参考答案
是从卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，和生物素结合后十分稳定。
每个亲和素能结合4个分子的生物素。
3.名词解释免疫放射分析(IRMA) 参考答案
是用放射性核素标记的过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争方法。
4.名词解释荧光免疫技术参考答案
将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法，是免疫标记技术中发展最早的一种检测方法。
5.名词解释封闭参考答案
是指在抗原或抗体包被ELISA板后，用1%～5%牛血清蛋白或5%～20%小牛血清等再包被，以防止非特异性吸咐的过程。
免疫标记技术名词解释
免疫标记技术名词解释免疫标记技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的技术。
它利用特异性抗体与待检测的分子结合，然后利用这些抗体上的标记物（如酶、荧光剂或放射性同位素）来检测和定量目标分子的存在和表达水平。
下面是一些常见的免疫标记技术及其解释：1. 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）：在组织切片或细胞上，利用抗体与特定抗原结合，再利用染色剂（如酶、荧光剂）将目标抗原可视化，从而研究和分析细胞或组织中特定蛋白质的表达和定位情况。
2. 免疫荧光（Immunofluorescence，IF）：通过与荧光素结合的抗体，将特定蛋白质或其他目标分子在细胞或组织中可视化。
这种技术不仅可以用于检测蛋白质的表达和定位，还可以用于研究细胞的功能、相互作用和信号通路等。
3. 免疫酶标记（Immunoenzymatic labeling）：利用酶标记（如辣根过氧化物酶-HRP）结合抗体，形成特定酶抗体复合物。
通过加入合适底物和显色反应，可以观察到酶的活性，从而实现对目标分子的检测和定量。
4. 免疫原位杂交（Immunohistochemical In Situ Hybridization，IHC-ISH）：结合免疫组化和原位杂交的技术，可以同时检测细胞或组织中的蛋白质表达和基因表达情况。
通过使用标记有荧光或酶的核酸探针，可以在组织切片或细胞上可视化特定基因的表达位置。
5. 流式细胞术（Flow cytometry）：该技术利用荧光标记的抗体与细胞中的特定分子结合，经过流式细胞仪检测细胞的荧光强度和分布情况。
这种技术可以用于检测和分析细胞表面标记物、细胞周期、凋亡等多种细胞特性。
免疫标记技术的应用范围非常广泛，可以用于癌症诊断、药物研发、免疫学研究和疫苗开发等领域。
通过免疫标记技术，科研人员可以更加准确地了解分子的功能、定位以及其在疾病中的变化，从而为疾病的早期诊断和治疗提供重要的依据。
《免疫标记技术》课件
胶体金标记抗体和抗原的制备
胶体金颗粒的制备： 通过化学方法将金 离子还原为胶体金 颗粒
抗体或抗原的制备： 通过生物技术方法 制备特异性抗体或 抗原
标记反应：将胶体 金颗粒与抗体或抗 原进行标记反应， 形成胶体金标记抗 体或抗原
纯化：通过离心、 过滤等方法对胶体 金标记抗体或抗原 进行纯化，去除杂 质和未结合的胶体 金颗粒
确性
实验室安全与防护
实验室环境：保持清洁、通风 良好
实验操作：遵守操作规程，避 免交叉污染
防护设备：使用防护服、手套、 口罩等防护设备
废弃物处理：妥善处理废弃物， 避免环境污染
07
免疫标记技术的未来发 展
新技术的应用和展望
免疫标记技 术在疾病诊 断中的应用
免疫标记技 术在药物研 发中的应用
免疫标记技 术在食品安 全检测中的 应用
镜ห้องสมุดไป่ตู้察等。
04 免疫酶技术
酶标抗体和酶标抗原的制备
酶标抗体的制 备：通过免疫 反应，将酶与 抗体结合，形
成酶标抗体
酶标抗原的制 备：通过化学 方法，将酶与 抗原结合，形
成酶标抗原
酶标抗体和酶 标抗原的纯化： 通过色谱法、 电泳法等方法
进行纯化
酶标抗体和酶 标抗原的保存： 低温保存，避 免酶的活性降
交叉学科融合与创新
免疫标记技术与生物医学的融合：提高疾病诊断和治疗效果
免疫标记技术与纳米技术的融合：开发新型免疫标记材料和检测方法
免疫标记技术与人工智能的融合：实现自动化、智能化的免疫标记检测和 分析 免疫标记技术与大数据、云计算的融合：提高免疫标记数据的处理和分析 效率，为疾病预防和治疗提供更准确的信息支持。
荧光免疫标记应用： 细胞标记、蛋白质 标记、DNA标记 等
免疫标记技术课件
2.胶体金法无污染，不含危害操作者即污染环境;
3.胶体金标抗体在冻干状态下室温储存较稳定,有 效期长; 4.灵敏度高，10-25IU/L。
免疫标记技术
Immunolabeling technique
免疫标记技术
用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）
进行抗原-抗体反应。 标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变 抗体或 抗原的免疫学特性，且极大的提高了反应的灵敏度，可以对 微量物质进行定量、定性 或定位检测。
免疫标记技术 = 免疫技术+ 标记技术
常用底物： 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高于HRP，但不易获得纯品，且稳定性低于HRP、 价高，故应用不如HRP普及。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性；
②酶促反应专一性，保证特异性；
③底物反应放大作用，提高敏感性； ④酶标试剂保存稳定；
⑤操作简便，安全易行。
常用方法: 酶联免疫吸附试验
一、双抗体夹心法检测HBsAg
实验材料
1.HBV诊断试剂盒； 2.HBsAg阳性对照品，阴性对照品，待检品。
HBV感染后的血清学指标: HBsAg, HBsAb
乙肝表面抗原,存在于 HBV感染的急性期及慢 性期的血清中,为感染 指标。
HBeAg, HBeAb
HBcAb(IgG,IgM)
实验步骤
层析流方向
G：金标鼠抗人HCG单抗
T：鼠抗人HCG单抗
C：羊抗鼠IgG抗体 B：吸水纸
HCG金标试纸
滴加标本 复溶 固定
反应条带
质控条带
A
G 层析流方向
免疫标记技术-精品
(二) HRP标记抗体的方法
1、原理 戊二醛为一种双功能试剂，通过其
醛基分别与酶和免疫球蛋白上的氨基 共价结合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋 白结合物。
2、 试剂及器材
(1)0.1M PH6.8磷酸缓冲盐水(PBS)：取 0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl 1.8g，加蒸馏 水至200ml。
第二节 免疫荧光标记技术
一、荧光基础知识简介 （一）荧光的产生
一些化学物质能从外界吸收并储存能 量（如光能、化学能等）而进入激发 态，当其从激发态再回复到基态时， 过剩的能量可以电磁辐射的形式放射 （即发光）。
荧光种类
致荧光：光激发产生 化学荧光
X线荧光 阴极射线荧光
荧光免疫技术一般应用致荧光物质进 行标记。
第十一章 免疫标记技术
第一节 免疫标记技术简介
免疫标记技术概念 将某种可微量或超微量测定的物质 （如放射性核素、荧光素、酶、化发 光剂等）标记于抗原（抗体）上制成标 记物，加入到抗原抗体的反应体系中与 相应的抗体（抗原）反应，以检测标记 物的有无及含量的多少，间接反映被测 物的存在。称做免疫标记技术 （immunolabelling technique）。
其主要优点是： ①人眼对黄绿色较为敏感， ②通常切片标本中的绿色荧光
少于红色。
2、四乙基罗丹明
（rhodamine,RIB200）
橘红色粉末，易溶于酒精。性质稳定， 可长期保存。
最大吸收光波长为570nm，最大发射 光波长为595nm～600nm，呈橘红色 荧光。
3、四甲基异硫氰酸罗丹明 （tetramethylrhodamineisothiocya nate,TRITC）
四 操作步骤
常用的免疫标记技术
常用的免疫标记技术免疫标记技术是一种用于检测和分析生物分子的方法，其中利用特定的抗体或其他免疫物质标记目标分子，从而使这些分子能够被观察和测量。
以下是一些常用的免疫标记技术：1.免疫荧光技术（Immunofluorescence）：在这种技术中，用于检测目标分子的抗体被标记上荧光染料。
通过荧光显微镜观察样本，可以定位和定量目标分子的位置和数量。
2.免疫酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）：这是一种广泛用于检测抗体或抗原的技术。
ELISA 利用酶标记的抗体或抗原与目标分子结合，然后通过酶的底物反应来产生可测量的信号。
3.免疫印迹技术（Western Blot）：Western Blot用于检测蛋白质。
蛋白质被电泳分离，然后通过免疫印迹将其转移到膜上。
接着使用特定抗体标记的酶或荧光物质来检测目标蛋白质。
4.免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）：IHC用于在组织切片中检测特定抗原的存在。
切片上的抗原与标记有酶、荧光染料或其他标记的抗体结合，通过显微镜观察抗原的分布。
5.流式细胞仪技术（Flow Cytometry）：该技术通过激光照射细胞，测量细胞表面或内部的荧光标记物，以分析细胞的类型、状态和功能。
6.蛋白质质谱法（Mass Spectrometry）：将样品中的蛋白质离子化，并通过质谱仪测量质量。
免疫质谱结合了免疫标记和质谱技术，可用于检测和鉴定蛋白质。
7.免疫电镜技术（Immunoelectron Microscopy）：在电子显微镜下观察样本，通过标记的抗体来可视化细胞或亚细胞结构中的特定蛋白质。
8.免疫磁珠技术（Immunomagnetic Bead Assay）：使用带有磁珠的抗体，通过磁场将目标分子分离出来。
常用于细胞分离和分析。
这些免疫标记技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域发挥着关键作用，可以用于检测和定量各种生物分子，如蛋白质、抗体、核酸等。
第九章免疫标记技术2016
讨论课：学会阅读免疫标记技术涉及到的抗体说明 书、文献资料免疫标记技术图片和熟悉免 疫荧光技术的使用。
文献
Targeting estrogen receptor β in microglia and T cells to treat experimental autoimmune encephalomyelitis
2
免疫学依据
＋
抗原
抗体
抗原–抗体复合物
抗原（antigen）:一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应 免疫应答产物(抗体)在体内外发生特异性结合的物质。通常是一种蛋白质，但多糖 和核酸等也可作为抗原。 抗体（antibody）：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
酶
分 解
底物
抗原抗体免疫结合反应 + 酶组织化学反应
某种物质 + 生色原
有色反应物沉淀
辣根过氧化物酶
H2O2
O- + DAB
棕黄色反应物沉淀
ABC法实验步骤
①TBS漂洗3次，每次5 min；用新鲜配制的3%H2O2溶液与切片在室温下孵育20 min，以消除组 织内源性的过氧化物酶的活性； ②0.05 M TBS漂洗3次，每次5 min；加入supermix（0.05 M TBS、0.9%NaCl、0.25%明胶和 0.5%Triton X-100， pH=7.6）稀释的一抗，室温下孵育2 h后于4℃孵育过夜（大于14 h）； ③TBS漂洗3次，每次5 min；加入supermix稀释的二抗，于37℃孵育2 h； ④用Supermix溶液稀释亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（1︰800），混匀后在室温下 让亲和素和生物素预先作用30 min； ⑤将已反应好的亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物（ABC）与脑切片在室温下孵育2 h； ⑥0.05 M TBS漂洗6次，每次5 min； ⑦显色系统：切片在新鲜配制加镍的二氨基联苯氨（DAB）显色液中反应5-10 min，其中显色 液含有0.2%硫酸镍铵、0.003%H2O2、0.05%DAB和0.05 M TBS（pH=7.6）； ⑧显色之后，0.05 M TBS漂洗6次，每次5 min； ⑨将切片贴于已涂明胶的载玻片上； ⑩晾干之后，采用酒精梯度脱水，二甲苯透明，后用中性树脂封片，镜下观察。
免疫标记
• 实验目的 • 通过HBsAg的检测，了解酶联免疫吸附试验的原理和 类型，熟悉双抗体夹心法的原理及其临床意义。
【原理】
以特异性抗体(抗-HBs)包被载体表面，然后将待测标本 加入反应孔，混匀，37℃孵育，洗去未结合的抗原，加 入酶标特异抗体(酶标 抗-HBs)37℃孵育30min。酶标抗 体就连接到已结合于致敏载体表面的抗原上，孵育后， 洗去未结合的酶标抗-HBs。最后加入底物溶液，根据颜 色反应来判定抗原含量。
已包被抗-HBs的反应孔 + 被测标本→+ 酶标抗-HBs → 混匀 37℃30min →洗涤液手工冲洗5次，拍干→ 加显色剂A液，再加B液 各1滴混匀 → 37℃10min →观察判断结果。 先观察3个对照孔结果。
双抗体夹心法检测抗原原理示意图
取出水洗5次
酶标抗HBs-Ab 放37℃，30min
• 4. 结果判断须在10min内完成。
【临床意义】
• 血清中检测到HBsAg可确证有乙型肝炎
（HBV）感染。我国有1亿HBsAg多健康携带者
• 但不一定是乙型肝炎患者。 实验报告
1. 简述荧光免疫法检测ANA的实验原理
2. 试述酶联免疫法检测HBs-Ag的实验原理
3. 报告实验结果：标本号，阴性，阳性，对照结果
• 实验物品发放：被检血清，每人一份，报告标本号
【方法】 阴性对照、阳性对照、空白对照全班各作2分。共6分
于已包被抗-HBs的试验孔内加入待测血清标本，每孔50μl
空白孔不加血清 阴、阳、空白对照 各2孔，全班
加入酶标抗-HBs，每孔1滴 (50μl)充分混匀，37℃ 30min
手工洗板:弃去反应孔内液体、拍干、用洗涤液注满孔， 弃去拍干，同法反复洗涤五次后，拍干。每次泡20秒
免疫标记技术
常用的酶及其底物 酶 辣根过 氧化物 酶 (HRP) 底物
邻苯二胺 (OPD) 四甲替联苯胺 (TMB) 5氨基水杨酸 (5AS) 邻联苯甲胺 (OT) 2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 唑啉磺酸-6)铵盐 (ABTS )
显色反应 测定波长
橙红色 蓝绿色 棕色 蓝绿色
蓝绿色
492 450 449 425 642
酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可导致大 量的催化过程，所以极为敏感。它的催化过程 有两种基本形式： (1)E十S →(ES)→E十P (2)E十S →＝(ES) (ES)十D1 →E十P十D2 E为酶，S为酶作用的底物，P为底物分解 后的产物，D，为供氢体，D：为D1的氧化型。 如P或D：为有色化合物，即可用呈色反应显示 酶的存在。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2) 和供氢体(DH2)。供氢体多为无色的还原型 染料，通过反应可生成有色的氧化型染料 (D)。酶促反应的过程如下: HRP DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氢体的种类很多，形成的产物特点不一。如 DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉 淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色或 电镜观察。5AS(5-氨基水杨酸)早期曾用于ELISA， 但其溶解度不够大，且空白孔不易控制到无色， 现已很少应用。OT(邻联甲苯胺)的特点是能产生 鲜艳的蓝绿色产物且灵敏度较高，但反应中受温 度影响较大，而且由于产物不稳定，需要在短时 间内进行测定。
荧光是指一个分子或原子吸收了给 予的能量后，即刻引起发光；停 止能量供给，发光亦瞬即停止。 荧光素是一种能吸收激发光的光能 产生荧光，并能作为染料使用的 有机化合物。目前用于标记抗体 的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄 (FITC)、四乙基罗丹明及四甲基 异硫氰酸罗丹明。
免疫标记：四大免疫标记原理介绍
免疫标记：四大免疫标记原理介绍！为提高抗原和抗体检测的敏感性，将已知抗体或抗原标记上易显示的物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体。
常用的标记物有酶、荧光素、放射性同位素、胶体金及电子致密物质等。
这种抗原或抗体标记上显示物所进行的特异性反应称为免疫标记技术(immunolabelling technique)。
免疫标记不仅大大提高了试验敏感性，若与光镜或电镜技术相结合，能对组织或细胞内的待测物质作精确定位，从而为基础与临床医学研究及诊断提供方便。
免疫标记技术大致分为两大类：一类属于免疫组织化学技术(immunohistochemical technique)，用于组织切片或其他标本中抗原的定位。
另一类称为免疫测定(immunoassay)，用于液体标本中抗原或抗体的测定。
一，免疫酶技术(immunoenzymatic technique)最早应用的免疫酶技术是免疫酶组织化学染色，即用标记的抗体与标本中的抗原发生特异性结合，当加入酶的底物时，在酶的作用下经一系列生化反应产生有色物质，借助光镜作出定位判断。
目前，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。
该法特异性强，敏感性高，既可检测抗体，又能测定可溶性抗原。
主要方法及操作要领见图18.5，除了图示的两种方法外，还有抗原竞争法，现较少应用。
ELISA常采用的酶为辣根过氧化物酶(hosradish peroxidase，HRP)，其底物是二氨基苯胺(DAB)，底物被分解则呈棕褐色，可目测或借助酶标仪比色。
ELISA为非均相免疫测定，另外还有均相法，在此不作介绍。
由于酶免疫测定无需特殊仪器和试剂，且操作简便，利于普及。
因此，在免疫标记技术中，该法应用最为广泛，并在原有方法基础上加以改良，使得众多新的，更敏感的方法应运而生。
①生物素-亲和素放大系统(biotin-avidin system，BAS)，建立于70年代后期，通过将酶标记在生物素或亲和素上，借助生物素与亲和素的高度亲力和生物素能与抗体结合的特点应用于ELISA，显著提高了检测的敏感性。