(整理)实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价.

实验三微生物检定法测定硫酸庆大霉素的效价一、概述由于抗生素多为结构复杂的多组分物质，异构体多，且不稳定，容易产生降解杂质，故各国药典均以微生物检定法为主要含量测定法，因为抗生素药品的医疗作用主要是它的抗菌活力，而微生物检定法正是以抗生素的抗菌活力为指标来衡量抗生素效价的一种方法，其测定原理与临床要求相一致，能直接反映抗生素医疗价值，因此一直为各国药典所采用的主要测定方法。

微生物检定法测定抗生素效价，一般可分为稀释法、比浊法和琼脂扩散法三类。

以琼脂扩散法应用最广泛，为目前国际上测定抗生素效价的通用方法。

琼脂扩散法，亦称管碟法。

系采用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。

二、基本设备、用具和试验材料1. 基本设备(1) 抗生素效价测定实验室：室内应为半无菌，装有紫外线灯，有固定的效价测定台，台面要求水平、防震。

该室应与稀释抗生素溶液的工作室隔离，以防止空气、地面污染抗生素。

(2) 超净工作台：超净工作台应放置在洁净工作室或半无菌室内。

(3) 抑菌圈面积测量分析仪：该仪器装有微处理机，可自动测量抑菌圈面积，并打印出统计分析的各种数据。

2.用具（1）玻璃双碟：为硬质玻璃制品，碟底内径约90mm，碟高16-17mm，碟底面应平，厚薄均匀无凹凸现象。

新购的双碟应按上述要求进行检查。

检查时可将双碟底平放在水平台上，每碟内加入2ml染料液，仔细观察碟底反映的颜色深浅是否一致，挑选底部平的双碟，洗净晾干，置高温烘箱内140-160℃干热灭菌2小时后备用。

(2) 陶瓦圆盖：应平，无凹凸现象。

(3) 不锈钢小管：外径7.8±0.1mm，内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，重量差异不超过±25mg，钢管内外壁要求光洁，管壁厚薄要一致，两端面要平坦光洁。

(4) 小钢管放置器：四孔，一台。

(5) 游标卡尺：精密度0.02mm。

(6) 滴管：管口应细长平滑，不得有缺口。

3. 试验材料(1) 培养基I：取胨5g、牛肉浸出粉3g、磷酸氢二钾3g和蒸馏水1000ml，加热融化，混合，调节pH使其值比最终的pH值略高0.2-0.4，加入琼脂20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为7.8-8.0，在115℃灭菌30分钟。

(2) 营养琼脂培养基：取胨10g、氯化钠5g和肉浸液1000ml，混合，调节pH 使比最终的pH值略高0.2-0.4，加入琼脂15-20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为7.2-7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。

(3) 磷酸盐缓冲液（pH7.8）：取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加蒸馏水使成1000ml，在115℃灭菌30分钟。

(4) 试验用菌种：短小芽孢杆菌(CMCC(B)63 202).短小芽孢杆菌菌悬液的制备和保存：取短小芽孢杆菌试验用菌种斜面1支，按无菌操作要求加入灭菌水2ml，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml营养琼脂培养基的100ml 三角瓶中，在35-37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml将芽孢洗下，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得，置5℃冰箱中保存，可使用6个月。

4. 双碟的制备：取直径约90mm、高16-17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基I 20ml,使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。

另取培养基适量加热融化后，放冷至50-60℃，加入菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度）,摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。

放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm）4个，用陶瓦圆盖覆盖备用。

三、二剂量检定法取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1。

在35-37℃条件下培养14-16小时后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法中的(2.2)法进行可靠性测验及效价计算。

四、硫酸庆大霉素的效价测定：1. 标准品溶液的配制：精密称取硫酸庆大霉素标准品适量，加乙醇溶解后，用灭菌水制成每1ml中含1000单位的溶液，作为贮备液，置5℃以下的冰箱中保存，可使用7日。

将贮备液加pH7.8磷酸盐缓冲液稀释，使标准品高剂量溶液和低剂量溶液每ml中分别含硫酸庆大霉素10U和5U。

2. 供试品溶液的配制：取硫酸庆大霉素肠溶片4片，研细，用乙醇适量（硫酸庆大霉素约0.25g，用乙醇25ml），分次研磨使硫酸庆大霉素溶解，并用水稀释成每1ml中约含1000单位的溶液，摇匀，静置，精密量取上清液适量，按（1）法同法配制，使供试品高剂量溶液和低剂量溶液按标示量计算每ml中含硫酸庆大霉素分别为10U和5U。

3. 测定法：按二剂量检定法测定效价，计算出供试品中含硫酸庆大霉素相当于标示量的百分数。

附录：生物检定统计法中的（2.2）法抗生素微生物检定法是以微生物为工具，不可避免地存在着较大的生物差异性，因此，必须借助于生物统计方法来减少生物差异对检定结果的影响，使结果达到一定的精确度。

英、美、日等国家药典附录中都详细地制定了生物检定方法的实验设计和统计分析，并根据生物统计的要求规定了各个品种的误差范围。

中国药典从1985年版起增加了生物检定法的实验设计和可靠性测验及误差估计等内容，这对判断检验质量及促使检验方法的改进等方面都具有重要意义。

1.可靠性测验抗生素微生物检定法按照观察的方法和生物反应的类型属量反应，即观察每一反应本身所表现的程度，可以用量来表示。

实验设计采用供试品（T ）和已知效价的标准品（S ）对比试验的平行线原理。

由于平行线测定的计算原理是在一定剂量范围内T 和S 的对数剂量与反应或反应的特定函数呈直线关系以及在T 和S 两条直线互相平行（当T 和S 的活性组分基本相同时）的基础上，因此，可靠性测验就是运用统计方法来验证实验结果是否符合量反应的平行线设计原理，是否显著偏离了直线性和平行性，以便评价实验结果的可靠性。

对不是显著偏离平行偏离直线（在一定的概率水平下）的实验结果，认为可靠性成立，方可按有关公式计算供试品的效价和可信限。

(1)可靠性测验的统计方法抗生素微生物检定法的可靠性测验采用F 测验，即实验结果的方差分析。

方差分析为测验多组均数之间的差别是否显著。

通过统计运算求得试品间、回归、偏离平行、剂间及碟间项的方差，并以统计得的以上各项方差和误差项方差（S 2）的比值称F 值（各项F 值=)S 误差项方差（各该项方差）作为指标来观察其差别的显著性程度。

将实验结果求得的F 值，按相应各项的自由度及误差项的自由度查F 值表来判断实验结果求得的F 值是大于还是小于F 值表上()05.021f f F ⋅和()01.021f f F ⋅的F 值。

若大于()05.021f f F ⋅的F 值，则P<0.05,表示差别有显著意义。

若大于()01.021f f F ⋅的F 值，则P<0.01,表示差别有非常显著意义。

若小于()05.021f f F ⋅的F 值，则P>0.05,表示差别无显著意义。

P 称概率，即某一事件在一定条件下可能发生的机会，P 就是机会的定量表现形式，用数量的形式来反映出事情必然性的规律，它是生物统计的基础，一般在统计中评定实验结果的可靠程度以P 表示，P=0.05，即表示可靠性有95%的把握，P=0.01，即表示可靠性有99%的把握。

可靠性测验一般分为下述两个步骤：①实验结果的方差分析：从实验数据的总变异差方和中分出剂间变异和碟间变异的差方和后，即为误差项的差方和，其方差以S 2表示。

首先按剂量组将各反应值y （抑菌圈的直径）列成方阵见表1。

表1 实验结果 双碟数剂 量 组总 和 总和平方 (1)(2) (3) … （K ） Σy m [Σy m ]2 1 2 3m y 1(1) y 2(1) y 3(1)y m(1) y 1(2) y 2(2) y 3(2)y m(2) y 1(3) y 2(3) y 3(3)y m(3) … … …… y 1(k) y 2(k) y 3(k)y m(k) Σy 1 Σy 2 Σy 3Σy m [Σy 1]2 [Σy 2]2 [Σy 3]2[Σy m ]2 总 和 Σy (k)Σy (1)Σy (2)Σy (3)…Σy (k)Σy总 和 Σ[Σy m ]2总和平方 [Σy (k)]2[Σy (1)]2 [Σy (2)]2 [Σy (3)]2 …[Σy (k)]2总 和 Σ[Σy (k)]2y 2的总和 Σy 2表1中，K 为S 和T 的剂量组数，m 为各组内y 的个数（即双碟数），各组的m 应相等，n 为反应的总个数，n=m ×k 。

各项变异的差方和及自由度（f ）的计算差方和（总）=Σy 2— ny 2)(∑f (总)=n — 1式中 ny 2)(∑=校正数差方和（剂间）=my k 2)(][∑∑— 校正数f (剂间)=K —1 差方和（碟间）=ky m 2)(][∑∑— 校正数f (碟间)=m — 1差方和（误差）=差方和（总）—差方和（剂间）—差方和（碟间） f (误差)=f (总)—f (剂间)—f (碟间)=（k —1）（m —1） 方差=该项自由度该项差方和S 2=()()误差误差差方和f或S 2=)1)(1(][][][222)(2--∑+∑∑⋅-∑∑⋅-∑⋅m K Km y y m y K y Km m k②剂间变异的分析：剂间变异的显著性测验主要包括S 和T 试品间、回归、平行性及直线性等变异内容。

各项变异的差方和及自由度（f ）按表2二剂量法和表3三剂量法可靠性测验正交多项系数表计算。

表2 二剂量法可靠性测验正交多项系数表变异来源Σy (k)差 方 和自 由 度S 1 S 2T 1T 2正交多项系数（Ci ）试 品 间-1-11122)(]}[{Ci m y Ci k ∑∑⋅∑1回 归 -11-1122)(]}[{Ci m y Ci k ∑∑⋅∑1偏离平行 1-1-1122)(]}[{Ci m y Ci k ∑∑⋅∑1表中正交多项系数用Ci 表示，Σy （k ）为各剂量组反应值之和。

各项变异的差方和=22)(]}[{Ci m y Ci k ∑⋅∑⋅∑，除以该项的自由度即等于方差。

以各变异项的方差与误差项的方差（S 2）的比值作为指标，进行F 测验，以判断各项变异来源差异是否有显著意义。