番茄叶霉病拮抗细菌的分离和筛选
番茄灰霉病拮抗菌B26抑菌蛋白的分离纯化与鉴定
2 结果与分析
2. 1 硫酸铵敏感性测定 B2 6菌 株发 酵菌 液的 上清 液经 硫 酸铵 处 理后 对
灰霉病菌不表现抑菌活性, 沉淀溶解液对灰霉病菌 却有较强的抑菌作用, 并且活性显著强于硫酸铵沉 淀前的菌液上清 液原液。这说明 B26菌株 培养液 产生的 抗 菌物 质可 以 通过 硫 酸铵 沉 淀 得以 浓 缩
从图 1中可以看出, 抗菌物质的抑菌活性随硫 酸铵饱和度的提高而增加, 当硫酸铵饱和度提高到 50% 时抑菌活性达到最大值, 以后再增加硫酸铵的 浓度时抑菌活性下降, 说明该抗菌物质用 50% 饱和 度的硫酸铵沉淀效果最好。
2. 2 抑菌蛋白的分离纯化 2. 2. 1 DEAE- 纤维素 ( DEAE - 52) 离子交换层析 分步洗脱并配合核酸蛋白质检测仪在 280 nm 的波
) 98 )
江苏农业科学 2008年第 5期
长下检测结果显示, 在 280 nm 波长下共有 3个蛋白 洗脱峰出现, 分别为 0、0. 3、0. 6 m ol /L NaC l的洗脱 液洗脱出来的。收集各个洗脱峰脱盐并检测其抑菌 活性, 结果表明, 只有 0. 3 m o l/L NaC l洗脱液洗脱出 来的蛋白具有抑菌活性 (图 2) 。
(表 1)。
表 1 B26 培养液的硫酸铵沉淀溶解液对灰霉病菌的拮抗性能
处理
50% ( NH4 ) 2 SO4 沉淀后上清液 50% ( NH4 ) 2 SO4 沉淀的溶解液
对照 ( CK)
对灰霉病菌的拮抗性能 ++ +
注: / - 0表示无拮抗作用; / + 0表示抑菌圈 直径为 20. 0 mm 左 右; / + + 0表示抑菌圈 直径 大于 20. 0 mm; 对照 为未 经 ( NH4 ) 2 SO 4 处理的菌液上清液原液。
番茄内生拮抗细菌的分离鉴定及培养条件研究
番茄内生拮抗细菌的分离鉴定及培养条件研究王美琴;陈俊美;薛丽;贺运春【期刊名称】《中国生态农业学报》【年(卷),期】2008(016)002【摘要】针对番茄生产上灰霉病和叶霉病两大病害,为寻找安全、高效无污染的生防菌株及其最佳培养条件,本试验采用组织分离法从健康的番茄植株中分离出642个内生细菌菌株,并采用平板对峙法筛选出对番茄灰霉病菌和叶霉病菌拮抗作用强且稳定的两个菌株Thyy1和Jcxy8.通过形态学观察及生理生化特征测定,初步鉴定Jcxy8属环状芽孢杆菌(Bacillus circulans),菌株Thhy1属枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).内生拮抗细菌在以豆饼粉为原料的6号培养基中生长速度快,发酵滤液对两种病原菌的抑制作用强.培养基初始pH值、培养时间、温度、通气量等对菌株生长及其抗菌物质的分泌有明显影响.以豆饼粉培养基、初始pH 6.7、培养时间48 h、温度30 ℃、并尽量增大培养通气量为菌株的最佳培养条件.【总页数】5页(P441-445)【作者】王美琴;陈俊美;薛丽;贺运春【作者单位】山西农业大学农学院,太谷,030801;山西省偏关县农业局,偏关,036400;山西农业大学农学院,太谷,030801;山西农业大学农学院,太谷,030801【正文语种】中文【中图分类】S432.41【相关文献】1.1株番茄青枯病内生拮抗细菌的分离鉴定及盆栽防效 [J], 伍善东;雷平;郭照辉;黄军;程伟;付祖姣;单世平2.桑树内生拮抗细菌Burkholderia cepacia Lu10-1的分离鉴定及其内生定殖 [J], 牟志美;路国兵;冀宪领;盖英萍;王彦文;高绘菊;查传勇3.一株内生拮抗细菌的分离鉴定及其抗菌机理研究 [J], 刘洋;朱天辉;郑磊;张静;兰浩洋;郭志斌4.香蕉内生拮抗细菌KKWB-10的分离鉴定及其内生性证明 [J], 王宇光;顾文亮;张欣;卢雪花;夏启玉5.一株桑树内生拮抗细菌的分离鉴定及生物学特性研究 [J], 路国兵;李季生;牟志美;冀宪领;查传勇;董法宝;杨悦因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
番茄灰霉菌拮抗细菌的筛选鉴定及评价
番茄灰霉菌拮抗细菌的筛选鉴定及评价叶涛; 刘敏; 任哲昕; 詹旭芳; 金一禾; 王长春【期刊名称】《《浙江师范大学学报（自然科学版）》》【年(卷),期】2020(043)001【总页数】6页(P60-65)【关键词】分离; 芽孢杆菌; 番茄灰霉菌; 防治效果【作者】叶涛; 刘敏; 任哲昕; 詹旭芳; 金一禾; 王长春【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院浙江金华 321004; 浙江师范大学行知学院浙江金华321004【正文语种】中文【中图分类】S476由半知菌亚门灰葡萄孢(Botrytis cinerea Pers.)引起的灰霉病是一种世界性病害，病菌通过侵染果蔬的根、茎、叶、花和果实，形成软腐、倒伏、花腐和果腐等病害，每年造成近十亿欧元的损失[1-4].近年来，伴随着蔬菜种植面积的不断扩大，灰霉病发展成危害最为严重的病害之一.因灰霉菌变异快，容易对很多杀菌剂产生抗药性[5].辽宁省番茄灰霉病菌对腐霉利的抗药性呈现加重的趋势，EC50值平均为3.99 mg/L，抗性频率达到83.48%[6].北京地区番茄灰霉病菌对多菌灵、乙霉威、腐霉利与异菌脲产生抗性菌株的频率分别为98.80%，97.59%，91.57%和92.77%[3].番茄灰霉病的防治主要靠化学药剂，但灰霉病菌生理小种变异频繁，而新型杀菌剂的研制周期又长，实际生产过程中只有通过加大药剂用量和缩短施药周期来进行防治，以至于形成大药量到高抗性、再从高抗性到大药量的恶性循环，对环境造成严重污染[6].生物防治，特别是生防细菌具有安全、无污染、不产生抗药性等特点，成为当今病害防治的新星.木霉[7]、放线菌[8]和芽孢杆菌等对番茄灰霉病有较好防治效果.解淀粉芽孢杆菌fqhm-13的发酵上清液对番茄灰霉病防治效果可达78.1%[9].解淀粉芽孢杆菌B15菌株发酵液中的抑菌混合物质伊枯草菌素A(iturinA)和芬芥素(fengycin)通过诱导灰霉菌丝发生细胞凋亡的形式来抑制灰葡萄孢菌丝的生长[10]；枯草芽孢杆菌PTS-394通过激活一系列防卫相关基因来诱导番茄产生对灰霉病的系统抗性[11]；贝莱斯芽孢杆菌5YN8可以抑制灰霉孢子萌发和菌丝生长，并在植物体内诱导基础免疫反应[12].尽管有许多利用芽孢杆菌防治番茄灰霉病的报道，且防治机理研究也取得重要进展，但在实际应用过程中生防菌会受环境因素等多方面影响，导致防治效率普遍不高.因此开展生防菌分离，扩大菌质资源，寻找适合当地生境的生防菌依然是目前生物防治工作的重点.研究以番茄灰霉病菌为靶标菌，采用平板对峙法对特定生境土壤中分离出的细菌进行拮抗实验，筛选出对灰霉病菌具有良好拮抗作用的细菌，通过形态特征分析，革兰氏染色，16S rDNA序列分析方法对细菌进行初步的鉴定，并检测其防治效果，以期丰富生物防治番茄灰霉病的生物资源，为开发新型农用杀菌剂提供材料.1 材料与方法1.1 实验菌株及培养基供试病原菌：灰葡萄孢菌(Botrytis cinereal Pers.)从金华番茄种植保护地中番茄病株上分离获得，由浙江师范大学化学与生命科学学院植物学实验室保藏.供试细菌菌株，分离自金华地区连续多年种植番茄的保护地土壤，由浙江师范大学化学与生命科学学院植物学实验室保藏.配制PDA培养基、LB培养基、肉汁胨培养基备用[13].1.2 菌株的活化及发酵液的制备将供试细菌及番茄灰霉菌分别接种至肉汁胨培养基与PDA培养基斜面上，经复壮及重新分离后，供试细菌分别接种于装有50 mL LB液体培养基的三角瓶中，28 ℃，200 r/min振荡培养36 h.收集培养液离心(10 000 r/min，4 ℃)，上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，制成发酵液后备用.1.3 菌株的筛选在超净工作台中将番茄灰霉孢子悬浮液(106个/mL)加入到冷却至50 ℃左右的PDA培养基中(V悬浮液∶V培养基=1∶30)，将混有灰霉孢子的PDA培养基摇晃均匀后倒入培养皿中，用镊子夹取灭过菌的圆形滤纸片(直径5 mm)放置在培养皿的正中央.将供试菌株的发酵液(0.22 μm微孔滤膜过滤后)滴加到滤纸片上，晾干后继续滴加发酵液，反复3次，空白对照滴加等量PD培养基.将上述培养皿放置于37 ℃培养箱中培养4～5 d，测量抑菌圈直径并记录.1.4 鉴定1.4.1 形态鉴定与格兰氏染色鉴定菌落形态：将待鉴定菌株接种于LB固体培养基培养24 h，观察其菌落形态.菌株利用革兰氏染色进行初步鉴定[14-15].1.4.2 16S rDNA基因扩增及序列分析根据细菌基因组提取方法[16]提取候选菌株基因组DNA.PCR反应体系为20 μL，其中包括2×Primer STAR Max Premix混合反应缓冲液10 μL(购自TaKaRa公司)，上下游引物为细菌通用引物27F和1495R各1 μL，DNA模板为1 μL，无菌水7 μL.扩增程序设定：94 ℃下预变性4 min，94 ℃变性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，经过30个循环；72 ℃延伸5 min，95 ℃灭活10 min，16 ℃ 3 min，结束后在PCR产物中加0.3 μL的2×Taq Master Mix(购自TaKaRa公司，给扩增片段两头加A碱基以连接T载体).反应条件为:72 ℃加A 10 min.结束后用1%琼脂糖电泳检测PCR扩增产物.用DNA纯化试剂盒(购自Anxgell)回收目标片段与pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)连接，经筛选得到的阳性克隆送杭州擎科梓熙生物技术有限公司测序.将PCR产物核苷酸序列通过GenBank中的Bankit界面提交至GenBank数据库.Blast进行序列比对，以搜索得到的同源序列为依据，下载其同属近缘菌种的16S rDNA序列，运用MEGA 6程序构建系统发育树，采用邻接法(Neighbor-Joining)，系统树的检验用Bootstrap 1 000次重复.1.5 JH-2菌株发酵液对番茄灰霉病的防治效果利用实验检测方法[11]对番茄离体叶片灰霉病菌致病性及盆栽防治效果分析，实验受试番茄品种为Heinz 1706，接种后培养3 d观察记录结果.以叶片上最长的病斑为长(mm)，最宽的病斑为宽(mm).病斑面积及发病程度计算公式如下：病斑面积=(长×宽)×π/4;发病程度=病斑面积/整个叶面积×100%.病情指数分级标准：0级，无病斑；1级，病斑占整个叶面积的5%以下；3级，病斑占整个叶面积的>5%～15%；5级，病斑占整个叶面积的>15%～25%；7级，病斑占整个叶面积的>25%～50%；9级，病斑占整个叶面积的50%及以上.病情指数及相对防治效果计算公式如下：病情指数相对防治效果=2 结果与分析2.1 拮抗菌株的筛选进一步对实验室前期得到的5株细菌进行拮抗筛选，发现其对番茄灰霉菌都具有较强的拮抗活性，抑菌圈直径均大于14 mm.其中JH-2菌株抑菌圈直径最大，为16 mm(见图1).a:灰霉孢子培养基；b:发酵液与灰霉对峙模式图，PD为马铃薯液体培养基；c:JH-1与灰霉对峙培养基；d:JH-4与灰霉对峙培养基；e:HQ-3与灰霉对峙培养基；f:HQ-2与灰霉对峙培养基；g:JH-2与灰霉对峙培养基图1 菌株发酵液对番茄灰霉的拮抗作用2.2 拮抗细菌JH-2菌株的鉴定2.2.1 形态及格兰氏染色菌株在PDA平板上生长，菌落呈花瓣形，不透明，表面褶皱，乳白，边缘整齐(见图2a).格兰氏染色结果表明，该菌为格兰氏阳性(见图2b).综合JH-2菌株的形态特征和格兰氏染色，初步鉴定为芽孢杆菌属[14].图2 JH-2形态特征及革兰氏染色图3 JH-2 PCR扩增电泳图2.2.2 拮抗细菌的16S rDNA的序列分析JH-2菌株的16S rDNA经测序后序列长1 460 bp(见图3)，通过GenBank得到序列登录号为MK203823，在NCBI中Blast比对分析，下载同源性高的同属菌种；利用MEGA 6程序构建系统发育树(见图4)，采用邻接法(Neighbor-Joining)，系统树的检验用Bootstrap 1 000次重复.发现菌株JH-2与来源于一个玉米种植田的解淀粉芽孢杆菌(AB735995.1)同源性几乎完全相同，确证JH-2为解淀粉芽孢杆菌.图4 JH-2菌株16S rDNA序列的系统发育树2.3 拮抗细菌JH-2灌根后对番茄灰霉病防治效果接种3 d后，对照叶片出现大面积的坏死病斑，而菌株JH-2处理后的叶片呈现较少的坏死区域(见图5a).菌株JH-2处理的番茄叶片病斑面积为对照处理的77%，病斑占叶片面积比例为64.38%，无菌水对照叶片病斑占叶面积的比例为83.17%(见图5b)，通过计算得出，菌株JH-2诱发的番茄抗病性对灰霉的防治效果达22.3%.根据病情指数分级标准(见图6),盆栽番茄灰霉病发病指数调查显示见表1，无菌水对照处理番茄灰霉病病情指数为37.8，而菌株JH-2处理的发病指数为23.1，菌株JH-2处理的防治效果为38.9%.实验表明，菌株JH-2通过灌根处理也可诱导番茄对灰霉病的抗性.表1 不同处理下病情指数统计表叶片数0级1级3级5级7级9级病情指数JH-2灌根502016423523.1无菌水灌根502091351237.8图5 JH-2对番茄灰霉的离体叶片防效图6 病情指数分级标准3 讨论随着人们对食品安全认识的提高和对健康的关注，生物农药越来越受到重视，从不同生境和作物中分离潜在的微生物种质资源是开发生物农药的主要手段.研究表明，从寄主与病原菌共存的土壤中，筛选到理想生防菌株的可能性较大，推测拮抗菌株与病原菌之间除具有竞争、拮抗关系外，还具有共存、相随关系[17].芽孢杆菌是非常重要的一类生防菌，应用十分广泛，部分菌株在国内外均有商品化的制剂用于防治多种植物病害及作为饲料添加剂增加动物免疫能力[18-19].芽孢杆菌可以分泌抗菌肽[19]、脂肽类[20]和水解酶类物质[21]等物质来抑制病原物生长，也可以通过产生活性小分子物质激活水杨酸信号通路而引起系统获得抗性(SAR)[22].其中解淀粉芽孢杆菌能够通过非核糖体途径合成具有抗真菌活性的环状脂肽芽孢菌霉素(bacillomycin D)和fengycin[23]，也能通过聚酮合酶合成具有抗白叶枯菌活性的聚酮化合物地非西丁(Difficidin)和芽孢菌溶素(bacilysin)[24].本研究从番茄多年种植保护地土壤中分离得到了一株对番茄灰霉菌具有较强拮抗作用的菌株JH-2，经形态学、生化与分子手段鉴定，明确该菌株为解淀粉芽孢杆菌.在对峙实验中，JH-2发酵液对番茄灰霉菌有较强的抑制效果.由于2种微生物没有直接接触，说明分离菌株可能分泌了抗菌肽、脂肽类或其他挥发性物质，对灰霉菌产孢、孢子萌发与菌丝的生长产生抑制作用.已有研究表明，一些芽孢杆菌产生的挥发物可以使菌丝细胞内发生较为强烈的程序性细胞坏死与活性氧的积累，导致菌丝生长受到抑制[10].挥发物也可以使菌丝的形态结构发生改变，菌丝消融、细胞膜破裂与原生质体渗漏，最终产孢结构异常而导致孢子产生受到抑制[25].因此，需要在今后进一步明确JH-2是通过何种方式抑制灰霉菌生长.此外，在番茄上施加发酵上清液后，增强了番茄对灰霉病的抗性，表明JH-2除了可以产生直接抑制真菌生长的物质外，可能还会分泌一些具有诱导抗性的活性物质.诱导抗性主要分为ISR与SAR 2种，前者是由茉莉酸(JA)途径介导，后者则依赖于水杨酸(SA)信号途径.芽孢杆菌可以产生某种或某些挥发性物质诱导其产生ISR[26]，它的代谢产物也会使一些SA信号途径中的关键酶活性提高和诱导PR1a 和NPR1的表达，说明具有激活SAR抗性的能力[11]；贝莱斯芽孢杆菌5YN8除了具有诱导SAR抗性能力外，还具有诱导系统性抗性的能力[12].这表明，不同生防菌的抗性机制具有多样性和部分重叠性.因此，将不同抗性机制的生防菌混合使用，可能对提高抗性具有重要作用.JH-2在番茄上的这种诱导抗性究竟属于ISR或SAR，需要通过分子生物学的方法进一步鉴定.此外，也需要对JH-2分泌的活性物质进行分离与纯化，以进一步明确该菌株的诱导抗性机制.总之，实验中分离获得的一株解淀粉芽孢杆菌具有直接抑制番茄灰霉菌生长的作用，同时也具有诱导植物产生系统性抗性的能力.参考文献：【相关文献】[1]赵杨,苗则彦,李颖,等.番茄灰霉病防治研究进展[J].中国植保导刊,2014,34(7):21-29.[2]纪军建,张小风,王文桥,等.番茄灰霉病防治研究进展[J].中国农学通报,2012,28(31):109-113.[3]乔广行,严红,么奕清,等.北京地区番茄灰霉病菌的多重抗药性检测[J].植物保护,2011,37(5):176-180.[4]RALPH D,JAN A L,VAN K,et al.The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology[J].Mol Plant Pathol,2012,doi:10.1111/j.1364-3703.2012.00822.x.[5]OLIVEIRA M S,AMIRI A,ZUNIGA A I,et al.Sources of primary inoculum of Botrytis cinerea and their impact on fungicide resistance development in commercial strawberryfields[J].Plant Dis,2017,101(10):1761-1768.[6]杜颖,付丹妮,邹益泽,等.2017年辽宁省番茄灰霉病菌对腐霉利的抗药性现状及机制研究[J].中国蔬菜,2018(1):58-65.[7]ELAD Y.Biocontrol Trichodema harzianum T39 preparation for biocontrol of plant diseases control of Botrytisc 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A,HU C H,et al.Bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis[J].PNAS,2003,100(8):4927-4932.。
番茄灰霉病菌颉颃菌的筛选
番茄灰霉病菌颉颃菌的筛选摘要:对从不同生态环境下采集的样品进行分离纯化,共得到菌株68株｡经初筛,得到对番茄灰霉有颉颃作用的生防菌株16株,占分离菌株的23.5%｡并对其中较强颉颃作用的9株菌株进行抑菌活性的测定｡结果表明:滤纸片法得到的各菌株对番茄灰霉的抑制率在65.1%~92.0%之间,抑菌带在2.0~11.0 mm之间,共获得颉颃菌株8株,占分离菌株的11.8%｡关键词:番茄灰霉;颉颃菌;筛选;生物防治Screening of Antagonistic Strain Against Botrytis cinereaAbstract:68 strains were collected from different environments around Xingtai University and purified. 16 strains having antagonistics effect to Botrytis cinerea, which account for 23.5% in total were obtained. Among them, 9 strains having great intensive repression to Botrytis cinerea were detected. According to filter-paper detection, the suppression ratio of varieties maintained ranged from 65.1% to 92.0%; and bacteria-resistance region ranged from 2.0 to 11.0 mm. In addition, 8 anti-bacteria strains were obtained for biological control.Key words: Botrytis cinerea; anti-bacteria; separation; bio-control番茄灰霉病是由番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)引起的一种真菌病害,危害番茄的茎､叶､花及果实,以危害幼果为主,损失率一般在25%~30%,重者可造成绝产｡近年来,随着日光温室､塑料大棚､地膜覆盖等保护措施的改进,番茄种植面积不断扩大,加之茬次增多,为番茄灰霉病的滋生蔓延创造了条件｡番茄灰霉病是一种世界性重要病害,目前化学防治是常用手段,由于频繁施用杀菌剂,病菌抗药性严重｡并且施药时以果实为主要目标,造成了一定的农药污染｡在病害防治措施中,抗性品种的应用是最为经济有效的方法,但灰霉病抗源的匮乏,限制了抗性品种的选育[1]｡因此,近年来利用有益微生物来防治灰霉病已成为新的防治策略｡迄今为止,已有近百种微生物农药来自于微生物的次生代谢物,其中有多抗霉素､农抗120､武夷菌素､新生霉素､中生菌素等环境友好型生物农药｡国外报道多种真菌､细菌对灰霉病菌均有一定的抑制作用,如木霉､粘帚霉､酵母菌､假单胞杆菌等[2]｡在国内,从污水和土壤采样筛选番茄灰霉菌颉颃菌的报道较多,但从植物体采样进行筛选的甚少[3,4]｡本试验从不同生态环境下采样,筛选对番茄灰霉病菌有颉颃作用的菌株,并测定其抑菌效果,为充分挖掘有益微生物资源,利用生防菌防治番茄灰霉病提供理论依据,同时也为研究抑菌活性物质及其抗菌作用机理打下基础｡1材料与方法1.1材料1.1.1样品分别从邢台学院西边小花园杨树下采集土样,从邢台学院内牛尾河采集水样,从邢台学院西边小花园柳树的不同部位取样(根部､树干､枝条),贴上标签,记下采样时间､地点､环境情况,带回实验室｡1.1.2供试病原微生物从邢台市北郊外新星村一农户蔬菜大棚内采集分离得到｡1.1.3主要仪器恒温光照培养箱,电热鼓风干燥箱,高压蒸汽灭菌锅,电热炉,超净工作台等｡1.2方法1.2.1微生物的分离､纯化采用参考文献[5]中的方法对土壤､污水和植物体中的微生物进行分离纯化｡1.2.2对番茄灰霉颉颃菌的筛选将番茄灰霉病菌菌株接种在PDA平板上培养5 d,然后用打孔器打取菌龄一致的菌片,转接到另一PDA平板中央,在菌片的正上､下方2 cm处各划线接种同一种分离的菌株,每处理3次重复,放于25℃恒温培养｡待菌落将长满培养皿时,观察并记录每种菌株对番茄灰霉病菌生长抑制作用的强与弱,筛选出对番茄灰霉病菌有较强颉颃作用的菌株｡1.2.3番茄灰霉病菌颉颃菌抑菌活性的测定将筛选到的具颉颃作用的菌株分别制成109个/mL菌悬液｡用打孔器打取番茄灰霉病菌菌龄一致的菌片,转接到另一PDA平板中央,在菌片的正上､下方2 cm处,接入沾有待测菌株相同浓度菌悬液的滤纸片2片,各个稀释度重复3次,以接沾有无菌水滤纸片的平板作对照,放于25℃恒温培养｡待对照菌落将长满培养皿时,测量菌落生长量和待测菌菌落边缘至灰霉病菌菌落边缘的间距(抑菌带)确定抑菌程度,计算抑制率｡以抑菌带大于 1 mm 的菌株记为有颉颃作用的菌株;抑菌带大于5 mm的菌株作为颉颃菌株[4]｡抑制率(%)=(对照菌落生长量-处理菌落生长量)/对照菌落生长量×100｡2结果与分析2.1微生物分离､纯化结果对不同生态环境下采集的菌样,通过梯度稀释法,用3种不同培养基进行分离,经过纯化后共分离到菌株68株｡2.2番茄灰霉病菌颉颃菌筛选结果采用室内对峙培养法对分离得到68株菌株进行了颉颃性的测定｡结果表明:有些菌株与番茄灰霉病菌互不干扰;有些菌株表现出抑制作用,但不存在抑菌带;有些菌株表现出颉颃作用,即抑菌带明显,少部分菌株表现出较大的抑菌带｡其中具有颉颃作用的菌株16株,占分离菌株的23.5%(见表1);表现较强颉颃作用的菌株9株,占分离菌株的13.2%,有ZG-2､SP-2､TN-5､SP-1､TP-5､TG-4､SG-1､ZN-4､ZP-4｡2.3番茄灰霉病菌颉颃菌抑菌活性的测定结果采用滤纸片法,对番茄灰霉病菌具颉颃作用的菌株进行了抑菌活性的测定,结果见表2｡由表2可以看出:各菌株对番茄灰霉病菌的抑制率在65.1%~92.0%之间,抑菌带在2.0~11.0mm之间｡其中ZN-4的抑菌效果最佳,抑制率达92.0%,抑菌带达11.0 mm;SP-2､TP-5､TN-5､TG-4､SG-1､ZG-2､SP-1的抑菌带均达5 mm以上,即获得颉颃菌株8株,占分离菌株的11.8%｡3讨论土壤､污水､植物体中的微生物由于其特殊的生存环境,会产生不同的活性物质｡随着生物防治的深入发展,微生物资源的开发利用将会受到世界各国的重视和青睐｡本试验从土壤､污水､植物中共分离到了68株菌株,并在室内测试了它们对番茄灰霉病菌的抑制作用,筛选得到16株具有颉颃作用的菌株｡采用滤纸片法对其中表现较强颉颃作用的9株进行了抑菌活性测定,得到8种颉颃菌株｡值得一提的是,ZN-4是从植物体柳树上采集的菌样,表现出最强的抑菌活性,从而可知,植物体可作为筛选颉颃菌种的良好材料资源｡试验中还发现,SP-2在抑菌活性测定后再培养期间,其抑菌带有较大的外延现象,可能在于它的防治效果依赖于一定量的代谢产物的积累,也可能其抑菌活性物质产生较晚,还有待于进一步研究｡试验充分表明了土壤､污水､植物体中微生物作为新的农用抗生素资源的可能性,在农业病害防治上有一定的潜在价值,也为开发新型生物农药奠定了基础｡但颉颃菌菌种鉴定及其生物特性､颉颃物质的产生条件,颉颃物质的理化性质､酸碱稳定性､热稳定性等均需进一步研究测试｡参考文献:[1] 陈双臣,刘爱荣,邹志荣. 转葡聚糖酶和防御素基因对提高番茄灰霉病抗性的研究[J].植物保护学报,2006,33(4):357-362.[2] 朱宏建,易图永,周鑫钰.土壤放线菌生防活性物质的研究进展[J].作物研究,2007,21(2):149-151.[3] 赵蕾,杨合同. 蔬菜灰霉病生防菌的筛选与防效试验初报[J].应用与环境生物学报,1999,5(1):85-88.[4] 唐蕊. 污水中西葫芦灰霉病拮抗细菌的分离与应用[J].北方园艺,2007(9):43-44.[5] 黄秀梨. 微生物学实验指导[M].北京:高等教育出版社,2004.1-8.。
番茄灰霉病内生拮抗菌的筛选及抑菌物质研究
番茄灰霉病内生拮抗菌的筛选及抑菌物质研究张根伟;张丽萍;李书生;程辉彩【摘要】[ Objective ] The aim was to screen endophytic antagonistic bacteria and study it' s inhibitive substance to control tomato gray mold. [Method] Forty-six endophytic antagonistic bacteria strains were isolated from 65 healthy tomato plants which had antimicrobial activity to control tomato gray mold, and one strain which could produce antimicrobial substances was screened out by using PDA well-diffusion method. The inhibition of antimicrobial substances to mycelium and spores of Botrytis cinerea was studied, and the antimicrobial substances was i-dentified through acid precipitation, Sephadex G-50 gel chromatography and agarose gel electrophoresis analysis primarily. [ Result] It was observed under microscope that the antibacterial substances had the mechanism of tearing cell membrane. The antimicrobial substances was identified as 3. 3 kDa of proteins or polypeptide primarily. [ Conclusion] The research result provides reference for the development of new biocon-trol preparation.%[目的]筛选番茄灰霉病内生拮抗菌并研究其抑菌物质.[方法]从65株健康番茄植株中分离到内生拮抗细菌46株,在此基础上通过PDA培养基打孔扩散法进行复筛,获得了1株强烈抑制灰葡萄孢菌的抑菌物质产生菌.研究了该抑菌物质对灰葡萄孢菌菌丝和孢子的抑制作用,并经酸沉淀、Sephadex G-50凝胶层析纯化、琼脂糖凝胶电泳分析对其进行了初步鉴定.[结果]显微镜观察发现该抑菌物质具有列膜抑菌机制,初步鉴定抗菌物质为3.3 kDa左右的多肽类物质.[结论]为开发新的生防制剂奠定了基础.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(000)030【总页数】3页(P14789-14791)【关键词】内生菌;短小芽孢杆菌;灰葡萄孢菌;抑菌物质【作者】张根伟;张丽萍;李书生;程辉彩【作者单位】河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081;河北省科学院生物研究所,河北石家庄050081【正文语种】中文【中图分类】S182由灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是番茄生产上的一种世界性气传真菌病害，可侵染花、果、叶、茎多个部位，低温、高湿环境利于发病，常常造成较大损失［1］。
与番茄抗叶霉病基因Cf—16连锁的分子标记筛选及种质资源鉴定
与番茄抗叶霉病基因Cf—16连锁的分子标记筛选及种质资源鉴定摘要：以携带抗叶霉病基因Cf-16的番茄（Lycopersicon esculentum）材料Ontario 7816为母本，感病材料07880为父本配置杂交，以亲本及其F2代分离群体为研究材料，采用SSR和AFLP技术筛选与抗叶霉病基因Cf-16连锁的分子标记。
结果表明，鉴定到与Cf-16基因连锁的SSR标记1个、AFLP标记5个，并将AFLP 标记E-ACA/M-TCG219转化为AFLP-SCAR标记并应用于种质资源筛选，筛选出3份携带Cf-16基因的番茄材料，为抗叶霉病育种提供了基础。
关键词：番茄（Lycopersicon esculentum）；叶霉病；Cf-16基因；SSR标记；AFLP-SCAR标记叶霉病是由褐孢霉属（Fulvia）褐孢霉[Fulvia fulva （Cooke）Cif.]引起的番茄（Lycopersicon esculentum）主要病害之一，既影响番茄产量又影响果实品质，从而造成经济损失[1]。
选育和推广抗病品种是解决番茄叶霉病最为经济、有效和环保的途径之一。
但是防治番茄叶霉病是十分困难的，主要是由于番茄叶霉病病原菌的生理小种分化十分迅速，育成含有新的Cf抗病基因的栽培品种不久后，就会分化出侵染该基因的新致病生理小种。
目前，国内番茄抗叶霉病育种中普遍应用的Cf-4抗病基因已被侵染，侵染Cf-9抗病基因的生理小种在华北地区也被检测出来[2]。
已报道至少有24个抗叶霉病基因被发现，它们能够克服不同的叶霉病生理小种[3]，因而利用新的、具有较高抗性的Cf抗病基因将是我国叶霉病抗病育种的重要目标之一。
番茄与叶霉病病原菌的互作遵循“gene-for-gene”学说[4]，开展番茄抗叶霉病育种工作要根据当地叶霉病病原菌生理小种的分化情况，利用抗病基因对不同生理小种的抗病性进行鉴定。
传统的人工接种抗病性鉴定不仅需要较长的时间和花费较多的人力物力，直接影响多抗性新材料及新品种的选育进程，而且还易受环境条件、接种技术等影响，从而导致鉴定结果不稳定。
番茄灰霉病生防菌的筛选及防治效果研究
番茄灰霉病生防菌的筛选及防治效果研究番茄灰霉病生防菌的筛选及防治效果研究引言：灰霉病是番茄生产中常见的病害之一，严重影响着番茄的产量和质量。
传统的化学防治方法会带来一系列的环境和食品安全问题，因此开展对番茄灰霉病的生物防治研究具有重要意义。
本文旨在对番茄灰霉病生防菌的筛选方法以及防治效果进行研究，为番茄生产提供一种可行的和环保的病害防治方法。
材料与方法：1. 菌种的筛选在病害发生较为严重的番茄田中采集受感染的根系、叶片和果实样品，分离出病原菌，经过纯化和鉴定，确认为灰霉病病原菌。
然后，采集不同植物体部位的健康样品，分离出潜在的生防菌。
通过菌落特征、形态学特性以及生理生化特性对菌株进行初步筛选。
2. 生防菌的抗性筛选采用以灰霉病病原菌为接种菌的平板法，筛选出对病原菌具有抗性的菌株。
将不同生防菌菌株接种在含有病原菌的琼脂平板中，培养一定时间后观察生防菌的生长情况并进行评价。
3. 生防菌体外抑菌效果的测定选取具有抗性的生防菌菌株，在不同培养基中培养，检测其对病原菌体外抑菌效果。
采用对照组、处理组的方法进行比较实验，通过菌落直径和生长速率的变化来评估生防菌的抑菌效果。
4. 生防菌体内防治效果的研究在温室条件下进行生防菌体内防治效果的研究。
将番茄种子浸泡在不同浓度的生防菌悬浮液中，浸渍一段时间后进行定植。
定植后，对病原菌的感染情况进行观察和评估，并与对照组进行比较试验，以评估生防菌的体内防治效果。
结果与讨论：1. 菌种的筛选从番茄田中分离出的病原菌被鉴定为灰霉病病原菌。
通过初步筛选，从不同植物部位分离出多个具有潜在生防能力的菌株。
2. 生防菌的抗性筛选筛选过程中发现，在接种了灰霉病病原菌的平板上，部分菌株表现出了较好的抗菌能力，这些菌株具备了潜在的生防潜力。
3. 生防菌体外抑菌效果的测定体外实验结果显示，选取的具有抗性的生防菌对灰霉病病原菌有一定的体外抑制效果。
不同培养基和不同菌株之间的抑制效果存在差异，进一步筛选最适合的生防菌菌株。
22种植物提取物对番茄病原菌生物活性的筛选
22种植物提取物对番茄病原菌生物活性的筛选杨苏苏;赵慧琳;程慧丽;郝晓娟;杨春;曹挥【摘要】试验以番茄常见的病害番茄枯萎病病原菌、番茄灰霉病病原菌、番茄早疫病病原菌、番茄黑斑病病原菌为供试菌种,采用菌丝生长速率法,对丁香、木醋酸、石菖蒲等22种植物乙醇提取物进行了抑菌活性的筛选,旨在为植物源杀菌剂的开发提供理论依据.结果表明,质量浓度为2mg/mL时,博落回、木醋酸、八角、丁香、细辛、石菖蒲6种植物提取物对4种番茄病原真菌的菌丝抑制率均大于60％,其中,木醋酸的抑制效果最好,抑制率均达到75％以上.木醋酸作为一种新型的植物源农药值得进一步开发利用.%To provide a theoretical basis for the development of botanical fungicide,in this experiment,Phomopsis macrospora,Botrytis cinerea,A lternaria solani and Pseudomonas syringae were selected as tested strains,which are the common diseases of tomato,and the mycelial growth rate method was used to screen the antibacterial activities of 22 kinds of plant ethanol extracts,such as Eugenia caryophyllata,wood vinegar and A corus tatarinowii,etc.When the mass concentration was 2 mg/mL,the mycelia inhibition rates of ethanol extracts from 6 plants on tomato pathogenic hyphae were more than 60％,which were Macleayacordata,wood vinegar,Illicium verum,Eugenia caryophyllata,Asarum sieboldii and Stellera chamaejasme.Among them,the inhibitory effect of wood vinegar was the best,all reached more than 75％.Wood vinegar,as a new botanical pesticide,is worth further development and utilization.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2018(046)003【总页数】4页(P441-444)【关键词】植物源杀菌剂;植物提取物;活性筛选【作者】杨苏苏;赵慧琳;程慧丽;郝晓娟;杨春;曹挥【作者单位】山西农业大学农学院,山西太谷030801;山西农业大学农学院,山西太谷030801;山西农业大学农学院,山西太谷030801;山西农业大学农学院,山西太谷030801;山西农业大学农学院,山西太谷030801;山西农业大学农学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】S476番茄富含维生素和矿物质，深受广大人民群众的喜爱，被称为神奇的菜中之果，因此，在国内外被广泛种植。
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番茄叶霉病拮抗细 菌的分离和筛选
（1）试验材料
供试菌株
供试培养基
主要仪器
番
茄
叶 霉 病
细 菌
抗菌谱测定供试指示菌:
原
菌
A
人参锈腐菌（Cylindrocarpon destructans），玉米链格孢菌 （Alternaria longissima），葡萄白腐菌（Coniella
diplodiella），大豆链格孢黑斑菌（Alternaria alternata）， 向日葵黑斑菌（Alternarua helianthi），由本试验室分离保
锅
台
箱
恒温振荡 高速冷冻 培养箱 离心机
等
（2）试验方法
细菌菌株 单孢分离
和纯化
菌株的筛 选
拮抗细菌
S46发酵 液抗菌谱
测定
保存
平板分离 法
纯化
倒平板
培养
制备土壤 稀释溶液
涂布
拮抗菌株 的初筛
（1）菌 碟的制备
（2）平拮抗试验
• 本试验共用14株植物病原真菌对S46进行抗菌 谱测定，将一些无菌水倒入纯化的植物病原真 菌平板中，并用接种环将孢子和菌丝刮落制成 菌悬液，取一种真菌的菌悬液3ml加入100 mL 已融化且冷却到约45℃的PDA培养基中，迅速 混匀并平均倒入3个无菌培养皿内，待培养基 完全凝固后，用直径10 mm的打孔器在每个培 养皿内打孔，注入滤过菌的发酵上清液200μL， 置于28℃的恒温箱中进行培养，待平板有菌丝 长出后，测量抑菌圈直径。14种病原菌都做相 同的处理。
（3）结果分析
分离纯化 58株细菌 冰箱中4℃保存 备用
• 初筛结果
通过活体菌株对病原菌抑菌活性测定，结果表明：编号为S02，S06，S35， S29，S46，S47的这6个菌株对供试病原菌均有不同程度的抑制作用。
• 复筛结果
通过制备各菌株的发酵液对初筛得到的具有拮抗作用的菌株来进行复筛, 结果表明编号为S35，S46，S47的这三种菌株的发酵液抑菌效果较好 。抑菌圈 分别可达22 mm、26 mm、33mm左右。
针对上述试验结果得出优势菌株s 46对14种 常见植物真菌进行抗菌谱测定，结果如表12所示，有拮抗作用，其中对番茄叶霉菌拮 抗作用最大，抑菌圈可达到27mm左右，对 向日葵黑斑无拮抗作用。
（4）小结
• 采用稀释分离法从土壤中分离得到细菌58株， 通过试验测定活菌体的拮抗性，并初筛出了6 种不同的有拮抗作用的菌株。之后对这6种具 有拮抗作用的菌株的发酵液的抗性进行了进一 步的测定，其中编号为S47菌株拮抗作用最好。 但是，S47疑似是一种致病原菌，所以，选择 抑菌圈达到26mm左右的S46菌株作为本试验主 要研究的生防菌。
• 并对S46菌株做了抗菌谱测定，该菌株抗菌谱 较广，其中对番茄叶霉病原菌拮抗作用最大， 抑菌圈可达到27mm。
• 本试验以番茄叶霉病病原菌为靶菌对土壤中具有拮 抗作用的细菌进行了分离和筛选，得到了编号为 S02，S06，S35，S29，S46，S47的这6个细菌株，均 对番茄叶霉病有抗性，其中S35，S46，S47抗性较强 抑菌圈分别可达22 mm、26 mm、33mm左右。但是， S47疑似是一种致病原菌，所以本试验采用S46菌株 作为供试菌株材料，并对其发酵条件进行了优化使 其高效的产生活性物质；同时也对筛选得到的其它 几种菌株做了长期保存工作（甘油悬液于-80℃冰 箱），可以作为其它试验题目的菌株材料。拮抗菌 株的分离、纯化和筛选是本试验的基础部分，工作 量较大，耗时长，为后面的试验做了准备工作，所 以也是本试验至关重要的部分。
致谢
• 本论文是在我的导师马贵龙老师的悉心指导下完成的。使我从 中学到了很多知识，在本论文的试验及写作过程中，他严谨并 耐心的指导我，不仅使我的理论素养大幅提高，而且使我的专 业知识更加巩固，在此表示感谢。
• 感谢在我论文完成过程中给我极大关心、支持和帮助的所有老 师、学长和同学们，感谢你们的大力帮助让我可以顺利完成毕 业论文。同时也感谢学院为我提供良好的做毕业设计的环境。
• 现在我即将毕业，但我深深的知道这也将是我人生旅途新的开 始。四年的求学时光给我留下了美好的回忆，我会在大家的关 爱下继续坚持自己的信念和理想，勇往直前，不断努力，用实 际行动回报那些在我求学路上关心、支持和帮助过我的人们。
• 最后，感谢各位评审老师能够在百忙之中抽出宝贵的时间审阅 我的论文，希望各位老师多提宝贵意见。特此致谢！
存；
禾谷镰刀病原菌(Fusarium graminearum)，玉米弯孢霉叶斑 病原菌(Curvularia lunata)，玉米茎腐病原菌（Fusarium moniliforme），玉米大斑病原菌(Exserohilum
Helminthosorium turcicum)由吉林省农科院植保所提供；大 豆灰斑菌（Cercospora sojina），人参立枯菌（Rhizoctonia solani），人参菌核菌（Sclerotinia schinseng ），人参灰霉 菌（Botrytis cinerea），辣椒炭疽菌(Colletotrichum capsici)，
由本学院植病教研室提供。
PDA培养基
• 马铃薯200g • 葡萄糖20g • 琼脂15g， • 水1000ml • pH7.0。
NA培养基
• 牛肉浸膏3.0g • 蛋白胨10.0g • NaCI5.0g • 琼脂20g • 水1000ml • pH7.0
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