实验四 RNA的提取及其组分的鉴定
实验4 酵母RNA的分离及组分鉴定
实验4 酵母RNA的分离及组分鉴定酵母RNA是由酵母细胞合成的核糖核酸，包含了酵母细胞的遗传信息，并参与了细胞的生理代谢过程。
本实验旨在通过离心分离和酸性酚/氯仿法提取，纯化酵母RNA，并通过紫外吸收光谱和琼脂糖凝胶电泳等方法对酵母RNA进行组分鉴定。
一、材料与方法1.材料酵母细胞、DTT、Tris、EDTA、NaCl、硝酸、醋酸等。
2.方法1)制备样品a.在液氮中将酵母细胞粉磨成细粉；b.称取10mg酵母细胞粉末加入1ml去离子水中，振荡混匀，制成1mg/ml的酵母细胞悬液。
2)离心分离a.取1ml稀释后的酵母细胞悬液，离心10000rpm/10min，弃去上清液；b.用10μl无菌去离子水重悬沉淀，制成1mg/ml的RNA悬液。
3)RNA的提取和纯化a.取1ml离心沉淀物加入700μl去离子水，混合均匀，加入100μl10%SDS和100μl 酸性酚(pH4.5)混合，振荡15min；b.加入300μl氯仿，振荡混合，离心12,000g/10min；c.取上层水相(约600μl)，加入等量异丙醇混合，振荡；d.离心12,000g/5min，弃去上清液，将胶状RNA沉淀用70%酒精重悬，制成1mg/ml的RNA溶液。
4)鉴定RNAa.测定RNA含量和纯度b.通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带。
c.用紫外吸收光谱测定RNA吸收光谱曲线。
5)结果分析a.通过鉴定RNA的吸收峰和电泳图谱来分析RNA组分。
二、实验结果1.酵母RNA提取和纯化效果良好，制得1mg/ml的RNA溶液。
2.根据紫外吸收光谱结果，可以看到RNA在260nm的吸收峰高于280nm，证明纯化后的RNA具有良好的纯度。
3.琼脂糖凝胶电泳显示，RNA溶液中有一个清晰的28S条带和一个模糊的18S条带，证明RNA转录水平较高。
三、讨论和结论通过离心分离和酸性酚/氯仿法提取纯化酵母RNA，可以得到高质量和高纯度的RNA样品。
此外，琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收光谱可以对RNA组分和质量进行鉴定，为后续的RNA研究提供了有价值的基础数据。
酵母rna的提取与鉴定实验报告
4. RNA含量的测定
- 使用紫外分光光度计测定RNA在260nm处的吸光度- 根据标准曲线计算RNA浓度
- OD260值：- 标准曲线方程：- RNA浓度（μg/ml）：
- 测定结果的准确性和可靠性- 与标准RNA液的浓度对比
- 酵母粉质量：- 沸水浴时间：- 离心转速和时间：- 乙醇体积和洗涤次数：
- 提取的RNA沉淀量（通过观察或称重）- 提取过程中可能的损失和干扰因素
3. RNA的纯化
- 使用特定试剂（如异硫氰酸胍-苯酚-氯仿）进行抽提- 或根据RNA在等电点的pH环境下溶解度最小进行纯化
- 纯化试剂的种类和用量：- pH调节范围和纯化时间：
- 分析实验结果的可靠性和准确性- 讨论可能的误差来源和改进措施
7. 结论与展望
- 总结实验过程和结果，得出实验结论- 提出改进方法和未来研究方向
- 实验结论：- 改进建议：- 未来研究方向：
- 对实验结果的全面评价- 对未来研究的展望和建议
5. RNA的鉴定
- 进行磷酸的检测、核糖的显色反应以及嘌呤碱基的检测等化学反应- 观察颜色变化或生成物
- 磷酸检测结果：- 核糖显色反应结果：- 嘌呤碱基检测结果：
- 鉴定结果的准确性和可靠性- RNA组分的完整性和稳定性
6. 数据整理与分析
- 整理实验数据，计算RNA的纯度、提取率和产率等
- RNA纯度（%）：- RNA提取率（%）：- 总制品重量和产率：
rna的提取与鉴定实验报告
实验步骤
操作细节与试剂
数据记录
结果与分析
1. 实验准备
- 仪器：紫外分光光度计、离心机、水浴锅等- 试剂：酵母粉、NaCl、HCl、乙醇、氨水、RNA沉淀剂等
酵母RNA的提取及组分鉴定
一、目的与要求 了解RNA提取的原理，掌握RNA组分鉴定的方法
二、实验原理 酵母细胞中所含的核酸主要是RNA,DNA含量很少，故本实验采用酵母提取RNA。由于酵母细胞中所含的核蛋白不溶于水和稀酸，但能溶于稀碱，所以先用稀碱加热煮沸处理，使RNA成为可溶性的钠盐而与酵母中其它的成分分离。然后加乙醇沉淀溶液中的RNA，最后加酸将其完全水解，并用下列方法鉴定其中组分： (一) 钼酸铵试剂与无机磷酸结合生成的磷钼酸易被还原生成钼蓝，以鉴定核酸中的磷。 (二) 3,5-二羟基甲苯与核糖在浓酸中共热呈绿色，以鉴定核糖的存在。 (三) 嘌呤碱与硝酸银共热产生褐色的嘌呤银沉淀，以鉴定嘌呤的存在。
(二) RNA的水解 两管沉淀物中各加入1.5mol/L H2SO4 2.5ml后合并，沸水浴10min，使其充分水解。 (三) RNA组分鉴定（取试管3支编号） 1. 磷酸试验：1号管，取钼酸铵试剂10滴，加RNA水解液10滴摇匀，再加4%维生素C 6滴混匀后，置沸水浴中加热5～10min，观察颜色变化。 2. 核糖试验：2号管，取3,5-二羟基甲苯试剂6滴，加RNA水解液10滴摇匀后，置沸水浴中加热5～10min，观察颜色变化。 3. 嘌呤试验：3号管，取5% AgNO3 10滴，加氨水2-3滴（至沉淀消散后），再加RNA水解液10滴摇匀后，置沸水浴中加热约5～10min，观察颜色变化。
四、结果与计算 管水中加热时要时常摇动试管； (三) 硝酸银中加氨水应逐滴加入，白色沉淀消散后再加水解液。
思考题 1．本实验为什么要选用酵母作为提取RNA的实验原料？ 2．实验过程中酵母细胞为什么要充分研磨？
三、操作步骤 (一) 酵母中RNA的制备 1. 取0.5g干酵母置研钵中，加入0.04mol/L NaOH 4ml，磨3～5min，使其成匀浆； 2. 将酵母匀浆倒入1支大试管中，在沸水中加热30min； 3. 把大试管中匀浆分别放入2支小试管中，配平； 4. 2000r/min离心15min，将两上清液分别倒入另两小试管中，弃去沉淀； 5. 各加3mol/L HAc 2滴，立即摇匀酸化，用石蕊试纸检查。 6. 上述溶液猛力摇匀后，徐徐倒入两支各盛有2.5ml酸性乙醇的试管中，即有白色沉淀析出。 7. 2000r/min离心15min，倾去上清液，作下一步实验。
酵母RNA 的提取(浓盐法)及成分鉴定
酵母RNA的提取（浓盐法）及成分鉴定一、实验目的：1、掌握浓盐法提取RNA的原理和方法。
2、理解等电点沉淀分离两性物质的原理和基本操作。
3、掌握钼蓝反应的原理，了解戊糖和嘌呤检验的原理。
二、实验原理：1、浓盐法提取酵母RNA：酵母中RNA含量特别多，约占干重的3～10％，DNA含量很少，约占干重的0.5％或更少，且菌体容易收集（即可利用发酵工业的下脚料），因此多采用酵母来提取RNA。
；本实验采用工业上常用的浓盐法，其基本原理是在浓盐加热的条件下酵母细胞壁通透性增加或发生破损，且加热又可使酵母中蛋白质变性沉淀，使RNA以可溶性钠盐的形式游离析出。
离心去除菌体，将上清液调至RNA的等电点（pH2～2.5），使RNA沉淀析出，离心收集沉淀。
2、RNA成分鉴定:RNA酸解，其水解产物含有碱基+核糖+磷酸；碱基（嘌呤）：磷酸：核糖：戊糖在约12％的盐酸中可以发生脱水缩合成为糠醛，糠醛可与5-甲基间苯二酚(又称苔黑酚、地衣酚)缩合生成蓝绿色的物质。
该反应用于检验戊糖的存在。
三、实验步骤：1.浓盐法提取酵母RNA（1）RNA的提取：取干酵母一包（约1～2g）放入100mL锥形瓶内，加入10％NaCl溶液30mL，搅匀后将锥形瓶固定在水浴锅内，于沸水浴中加热40分钟。
（2）RNA的离心分离：将上述锥形瓶从沸水浴中取出，立即用自来水冷却至室温。
然后将锥形瓶内溶液倒入离心管，平衡后3000转／分离心10分钟,收集上清液。
（3）RNA的收集：将上清液小心倾入50mL烧杯内，在冰浴中冷却。
用6mol/LHCl溶液调pH值至RNA的等电点2.0～2.5（一滴一滴的加入，边加边搅拌，随着pH下降，白色RNA沉淀逐渐增加，至等电点时沉淀最多）。
静置冰浴中5分钟使沉淀完全，颗粒变大。
再经3000转／分离心10分钟，收集沉淀。
2.RNA成分鉴定（1）溶解RNA：在离心所得的含RNA的离心管中加入1滴蒸馏水，用玻棒把RNA搅成糊状，再加入蒸馏水至mL，然后一边搅拌一边加入5%氨水1滴，将溶液调至pH=6，使白色RNA沉淀完全溶解，成为RNA溶液。
RNA的提取和鉴定
利用高效液相色谱仪检测RNA溶液中的杂质含量，从而评估其纯度。
rna的完整性评估
生物信息学分析
利用生物信息学软件对RNA序列进行 分析，可以评估其完整性。完整的 RNA序列在软件中呈现为一条连续的 线，而降解的RNA则呈现为多个片段。
实时荧光定量PCR
通过实时荧光定量PCR技术检测特定基因的 表达水平，可以间接评估RNA的完整性。 完整的RNA能够更好地逆转录成cDNA，进 而进行PCR扩增，而降解的RNA则会影响 逆转录和PCR扩增的效果。
提取的rna降解
总结词
降解的rna可能无法用于某些实验。
详细描述
如果提取的rna发生了降解，可能会影响其后续的应用，如Northern blot、实时定量 PCR等。为了解决这个问题，可以尝试使用更稳定的提取试剂、优化提取步骤、减少操 作时间等方法。同时，也可以通过电泳或分光光度法检测rna的完整性，以确定其是否
04 rna提取的常见问题及解 决方案
提取的rna浓度过低
总结词
浓度过低可能是由于提取过程中丢失或 降解造成的。
VS
详细描述
在rna提取过程中，如果操作不当或使用 的试剂不适当，可能导致rna的丢失或降 解，从而使得提取的rna浓度过低。为了 解决这个问题，可以尝试增加样本量、优 化提取步骤、使用高质量的试剂等方法。
疾病预防和筛查
通过rna提取和分析，可以发现早期 疾病迹象，为疾病预防和筛查提供 有力手段。
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样本保存
在收集样本后应立即进行rna提取，或 将其保存在适当的介质中短期保存。
细胞裂解和分离
细胞裂解
使用适当的裂解液处理样本，使细胞裂解释放出rna。
实验 酵母RNA的分离及组分鉴定
※实验六酵母RNA的分离及组分鉴定【实验目的】了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。
【实验原理】酵母核酸种RNA含量较多。
RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。
由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。
加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。
核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。
嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。
【实验器材】150ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯、离心机、漏斗【试剂和材料】1、0.04 mol/L氢氧化钠溶液；2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中；3、95%乙醇；4、乙醚；5、1.5 mol/L硫酸溶液；6、浓氨水；7、0.1 mol/L硝酸银溶液；8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10%三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400ml浓盐酸中；9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95%乙醇中（可在冰箱中保存一个月）；10、定磷试剂：（1）17%硫酸溶液：将19ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83ml水中（2）2.5%钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10%抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。
临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。
17%硫酸溶液：2.5%钼酸铵溶液：10%抗坏血酸溶液：水=1：1：1：2 (V/V)；11、酵母粉。
【实验操作】1、溶解RNA将5 g酵母悬浮于90 ml 0.04 mol/L氢氧化钠溶液于150 ml锥形瓶中，在沸水浴中加热30分钟，制成碱提取液，将其冷却。
2、解聚RNA将冷却的碱提取液离心（6000ｒ/min）5分钟，将上清液用乙酸调节pH至酸性（pH5~6））缓缓倾入30 ml乙醇溶液中，注意要一边搅拌一边缓缓倾入。
实验四酵母RNA提取
(二)A旳鉴定
取沉淀约1g，加10 ml 10％H2SO4→沸水浴中加热30 min。
• （5）．嘌呤碱 取水解液2mL加入2mL浓氨水， 然后加入约1mL 5%硝酸银溶液，观察有无嘌 呤碱旳银化合物沉淀。（慢慢加入嘌呤碱时， 沉淀上浮，摇匀，沉淀下沉）
• （6）．核糖 取1支试管加入水解液0.5mL、 1mL苔黑酚三氯化铁浓盐酸溶液。放沸水浴中2 分钟。注意溶液是否变成绿色，阐明核糖旳存 在。时间久了会有黑色沉淀，是浓度高，产物 结晶出来了。
• 苯酚法：组织匀浆用苯酚处理并离心后， RNA即溶于上层被酚饱和旳水相中，DNA 和蛋白质则留在酚层中，向水层加入乙醇 后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能 很好地除去DNA和蛋白质。
• 浓盐法：在加热旳条件下，利用高浓度旳 盐变化细胞膜旳透性，使RNA 释放出来， 再利用等电点（pH为2.0～2.5）沉淀。此 法易掌握，产品颜色很好。盐浓度需要控 制，太低，RNA不易从细胞中释放出来， 太高，细胞急剧收缩不利于抽提。一般 80～120g/L为宜。
酵母RNA旳提取
1、试验目旳
• 1、掌握稀碱法提取RNA旳原理和措 施
• 2、学习和了解其他提取RNA旳措施 和原理
2、试验要点和难点
• 离心机旳使用 • 提取RNA旳试验原理
3、试验原理
• 一般旳生物细胞中同步具有DNA和RNA，在 酵母中RNA比DNA旳含量高得多， RNA （2.67～10.0%），DNA则少于2％(O.03 ％～O.516％)，在试验室常用酵母作为RNA 提取旳材料。若要制备具有生物活性旳RNA， 可采用苯酚法、去污剂法和盐酸胍法等，最 常用旳是苯酚法提取RNA；若对生物活性没 有要求，则可使用浓盐法，稀碱法等。工业 中用稀碱法或浓盐法，主要用于制备核苷酸 旳原料.
生化实验(四)
至离心管 3000rpm， 离心10分钟
至离心管， 静置5min
3000rpm，
弃去上清液
收集沉淀
沉淀为RNA
离心10分钟
2．RNA的水解
10％硫酸3mL 沸水浴中5min
沉淀
RNA水解
液滴管搅匀
水解液
水解液是否为磷酸、嘌呤碱和核糖？
3．RNA的组分鉴定
（1）磷酸的鉴定
10滴水解液 4滴钼酸铵试剂 4%维生素C 6滴 摇匀 沸水中加热 3-5min
观察有何颜 色变化？
（2）嘌呤碱的鉴定
0.1mol/L 逐滴加
l mol/L氨水
硝酸银5滴
先有沉淀，滴 加到消失后
水解液10滴
观察有无白 色沉淀？
（3）核糖的鉴定
苔黑酚1mL 10滴水解液 混匀 沸水中加热
观察有何颜 色变化？
5-10min
离心机
离心机
五、注意事项
1. RNA提取时，加入10%NaCl搅匀后置 沸水浴10min，加热过程中应至少搅动 两次。 离心时，必须先使用天平对所离心样本 （包括离心套筒）称量配平。离心结束 后，待仪器完全停止转动后方可打开盖 子取出离心管，套管放回原位。 第一次离心结束后，应将上清液一次性 倒入另一试管，避免沉淀漂浮，混入上 清液。 嘌呤碱鉴定时， l mol/L氨水要逐滴加 入。
实验器材
公用试剂
小组试剂
三、实验原理
1、核酸的分类与分布
DNA：主要存在于细胞核的染色体中, 线粒体、叶绿体、质粒有少量 RNA：存在于，其中以RNA含量较多（占干重的 3%-10%）而DNA较少（约占，干重0.5%以下）。
3、浓盐法提取RNA
10％NaCl使RNA核蛋白中的RNA解聚，并溶 于盐溶液中，离心除去菌体残渣及变性蛋白质后， 调节溶液的pH至RNA的等电点（pH2.0~2.5）， RNA即可沉淀析出。
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无水乙醇洗沉淀一次
离心3min（3000r /min）
沉淀即为RNA粗品
用10ml 1.5mol/L硫酸溶液 小心将RNA沉淀洗至试管中， 沸水浴10min，冷却后离心，然 后将上清液定容至100mL,分别取 1mL至两个1.5mLEp管中留做定 量用,余下做定性分析。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（２）核糖 取0.5ml水解液+0.2ml苔黑酚+2ml三氯 化铁盐酸溶液，沸水浴10min，观察颜色变化 （亮绿色） （３）磷酸 取0.2ml水解液+0.8ml水 +1ml定磷试 剂 ，沸水浴10min ，观察颜色变化（蓝色）
组分鉴定
RNA在硫酸液中煮沸可水解成核糖、嘌呤碱、嘧啶 碱和磷酸，可分别进行鉴定。
核苷酸
核糖+（嘌呤碱or嘧啶碱）+磷酸
三、材料与试剂
1、酵母 2、0.04mol/L的NaOH溶液 3、酸性乙醇溶液 0.3mL浓盐酸加入到30mL乙醇 中 4、95％乙醇溶液 5、乙醚 6、1.5mol/L硫酸溶液 7、浓氨水 8、0.1mol/L硝酸银溶液 9、三氯化铁浓盐酸溶液 2mL10％三氯化铁加入到 400mL浓盐酸中 10、苔黑酚乙醇溶液 6g苔黑酚溶于100mL95％乙醇 （4℃保存） 11、定磷试剂 （１）17％的硫酸溶液 （２）2.5％钼酸氨溶液 （３）10％抗坏血酸溶液 （４）蒸馏水 使用时按下比例临时配置（体积比）： 17％的硫酸溶液: 2.5％钼酸氨溶液:10 ％抗坏血酸溶液:蒸馏水＝1 : 1 : 1 : 2
RNA的分离
RNA和DNA分别存在于细胞质和细胞核中，分离提 出核酸，首先要将破碎制成匀浆、使核酸充分提取出来。 酵母核酸中RNA含量较多RNA可溶于碱性溶液，在 碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉
淀。但蛋白质的存在干扰核酸的测定，因此在沉淀中加 入95%乙醇溶液洗涤，以除去蛋白，由此可得到RNA的 粗制品。
四、实验步骤
１、酵母RNA的提取：
取酵母1.0g（3片）、 0.04MNaOH+8ml 离心3min（3000r /min）
研磨匀浆
沸水浴20min 冷却至室温 收集沉淀
离心10min（3000r /min）
95%乙醇洗沉淀一次， 离心3min（3000r /min）
收集上清液于离心管 无水乙醇洗沉淀一次 加入7mL酸性乙醇沉淀RNA 离心3min（3000r /min）
沉淀即为RNA粗品
2、RNA组分的鉴定
RNA的水解：
用10m1.5mol/L硫酸溶液小心将RNA沉淀洗至试管中，沸水浴 10min，冷却后离心，然后将上清液定容至100mL,分别取1mL至两个 1.5mLEp管中留做定量用,余下做定性分析。
RNA组分的鉴定：
（１）嘌呤碱
取水解液1ml+浓氨水（5滴）+1mlAgNO3，观察嘌呤银化合物 的絮状沉淀。
酵母核糖核酸的分离 及组分鉴定
一、实验目的
学习从酵母中提取RNA和鉴定RNA组分的方法。
二、原理：
核酸（nucleic acid)
核苷酸(nucleotide)
磷酸(phosphate)
核苷(nucleoside)
核糖 嘌呤（嘧啶）碱 (ribose) Purine (pyrimidine) base
（２）核糖
取0.5ml水解液+0.2ml苔黑酚+2ml三氯化铁盐酸溶液，沸水浴10min， 观察颜色变化（亮绿色） （３）磷酸 取0.2ml水解液+0.8ml水 +1ml定磷试剂 ，沸水浴10min ，观察颜色变 化（蓝色）
五
思考题
１、如何得到高产量的RNA粗品？
２、本实验RNA组分是什么？怎样验证？
RNA(ribonucleic acid)背景知识
细胞RNA通常都是单链分子（但病毒RNA双链、环状、 线型等多种形式），由核糖、碱基（A、U、G、C）和磷 酸组成，其种类繁多。目前有许多具有特殊功能的RNA不 断被发现，几乎涉及细胞功能的各个方面，其中参与蛋白 质合成的RNA有三类：转移RNA（transfer RNA）、核糖 体RNA（ribosomal）和信使RNA（messenger RNA）。 研究表明，RNA不仅仅是遗传信息的中间传递体 （from DNA to protein）。RNA的功能总结起来可以分 为以下几类：控制蛋白质的合成；作用于RNA转录后加工 与修饰；基因表达与细胞功能的调节；生物催化与其他细 胞持家功能；遗传信息的加工与进化。