单克隆抗体和基因工程抗体的制备
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
1、单克隆抗体的概念 2、单克隆抗体的特点
பைடு நூலகம்
二、杂交瘤技术的基本原理
1、基本条件：
B淋巴细胞：高浓度抗原免疫小鼠的脾细胞 肿瘤细胞：骨髓瘤细胞 细胞融合剂：PEG 选择培养基：HAT
2、HAT的选择原理
脾-瘤 HAT培养基中生长
B淋巴细胞 PEG + 骨髓瘤细胞
瘤-瘤 HAT培养基中不生长 瘤 脾 5-7天死亡 脾-脾 细胞多聚体 死亡
hathat培养基中生长b淋巴细胞peg细胞多聚体死亡三b淋巴细胞杂交瘤技术流第一课件网网站www1kejiancom四人源性单克隆抗体1建立人人细胞杂交瘤系统困难重重的原因b细胞来源困难缺乏合适的亲本细胞基因工程抗体2小分子抗体第一课件网网站www1kejiancom
单克隆抗体的制备技术
一、单克隆抗体（McAb）
三、B淋巴细胞杂交瘤技术流 程
四、人源性单克隆抗体
1、建立人-人细胞杂交瘤系统困难重重的原因 B细胞来源困难 缺乏合适的亲本细胞
基因工程抗体
1、人-鼠嵌合抗体 2、小分子抗体
红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备的开题报告
红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备的开
题报告
1. 研究背景
血型是人体基因组中的重要表型，血型分类系统多种多样，主要有ABO血型系统和Rh血型系统。
血型抗原是血细胞表面的特定蛋白质和糖类成分，在输血和器官移植等医学实践中具有非常重要的意义。
因此，
对于血型抗原和抗体的研究和制备具有重要的意义。
目前，红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体成为了研究的热点，
这些抗体的制备可通过某些特异性标志物筛选肝炎病毒抗体、瘤细胞表
面分子抗体、药物代谢酶等。
由于这些抗体具有很高的特异性、敏感性
和稳定性，因此已被广泛用于诊断、治疗以及实验室研究等领域。
2. 研究目的
本研究旨在制备红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体，探究不同
制备方法以及对不同固定的红细胞抗原的适用性，为医学实践提供支持。
3. 研究方法
（1）红细胞血型单克隆抗体的制备
提取出兔、鼠或小鼠等动物的淋巴细胞后，与牛红细胞或猪红细胞
等固定红细胞进行融合，制备出单克隆抗体。
（2）基因工程抗体的制备
采用重组DNA技术合成特定的单克隆抗体，通过细胞处理和分离纯化，制备出基因工程抗体。
4. 研究进展和计划
目前，我们已经完成了红细胞血型单克隆抗体的制备，同时对基因
工程抗体的制备进行了初步实验。
下一步，我们将在不断实验和分析的
基础上，优化制备方法和条件，进一步探究两种抗体对不同血型固定红细胞的适用性差异，完善有关的研究成果。
基因工程制备抗体方案有哪些
基因工程制备抗体方案有哪些引言抗体是一种可以识别并结合特定抗原的蛋白质，具有重要的生物学功能和临床应用价值。
传统制备抗体的方法主要是从动物（如小鼠、兔子等）中提取抗体，但该方法存在一些缺点，如周期长、成本高、质量不稳定等。
因此，基因工程技术的发展使得制备抗体的方法得到了革命性的改变，可以通过基因工程技术在体外合成抗体，提高了抗体的质量和稳定性。
本文将介绍基因工程制备抗体的方法和流程，包括抗体的选择和克隆、表达、纯化和鉴定等环节。
通过基因工程方法获得的抗体，可以应用于药物研发、医学诊断、生物学研究等领域，具有广阔的应用前景。
1. 抗体的选择和克隆（1）抗原的选择制备抗体的第一步是选择合适的抗原。
抗原是引发免疫反应的物质，可以是蛋白质、多肽、多糖、药物等。
根据需要制备的抗体类型，可以选择相应的抗原。
例如，如果需要制备单克隆抗体，可选择单个抗原蛋白作为抗原进行制备。
（2）抗体基因的克隆在选择了合适的抗原后，下一步是将抗体基因克隆到表达载体中。
通常可以利用PCR方法从免疫细胞中扩增出抗体基因，并将其插入表达载体中。
选择合适的表达载体是非常重要的，通常选择在哺乳动物细胞或大肠杆菌中表达。
2. 抗体的表达（1）表达载体的构建在决定抗体表达载体后，接下来是进行表达载体的构建。
通常表达载体包括启动子、终止子、选择标记基因等，通过合成或限制性内切酶切割等方法将抗体基因插入表达载体中。
（2）转染和筛选将构建好的表达载体导入宿主细胞中，可以通过转染等方法实现。
转染后，需要进行筛选，筛选出表达抗体的稳定细胞株。
通常可以利用克隆技术选取高表达的细胞株。
3. 抗体的纯化（1）细胞培养和收获经过筛选的稳定细胞株可以进行大规模培养，收获细胞培养上清液。
（2）亲和层析纯化常用的抗体纯化方法包括亲和层析纯化。
可以利用蛋白A/G或其他具有特异性结合抗体的配体进行纯化。
通过这种方法可以高效地将目标抗体从细胞培养上清液中纯化出来。
4. 抗体的鉴定（1）免疫印迹（Western blot）通过Western blot方法，可以验证纯化得到的抗体是否具有结构完整，是否与目标抗原结合。
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
第一节杂交瘤技术的基本原理杂交瘤技术的原理是利用聚乙二醇（PEG）为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测、筛选和单个细胞培养（克隆化），最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。
将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。
杂交瘤技术是一项周期长和高度连续性的实验技术，涉及大量的细胞培养、免疫化学等方法。
具体包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化等。
一、杂交瘤技术（一）小鼠骨髓瘤细胞1.细胞株稳定，易于传代培养。
2.细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。
3.该细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）或胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷株。
4.目前最常用的骨髓瘤细胞是NS-1和SP2/O细胞株。
（二）免疫脾细胞免疫时选用与骨髓瘤细胞同源的BALB/c小鼠，鼠龄8～12周，体重约20g，雌雄均可，但必须分笼。
免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法。
如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫。
（三）细胞融合细胞融合是产生杂交瘤细胞的中心环节。
PEG（聚乙二醇）有助于细胞融合。
（四）杂交瘤细胞的选择性培养将经过融合的细胞置于含有次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中。
1.脾细胞：在一般培养基中不能生长繁殖。
2.骨髓瘤细胞：采用的小鼠骨髓瘤细胞都是HGPRT或TK代谢缺陷型细胞，在HAT培养基中，不仅合成DNA的主要途径被氨基蝶呤阻断，又因缺乏HGPRT或TK而不能利用次黄嘌呤，虽有TK可利用胸腺嘧啶核苷，但终因缺乏嘌呤不能完整合成DNA，而使骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。
单克隆抗体和基因工程抗体
疾病诊断和治疗
基因工程抗体可以用于疾病的 诊断和治疗，如肿瘤免疫治疗 、自身免疫性疾病治疗等。
药物研发
基因工程抗体可以作为药物研 发中的靶点筛选、药物设计和 优化等环节的重要工具。
基因工程抗体的优缺点
优点
基因工程抗体具有高度的特异性和亲和力，能够针对特定抗原进行高灵敏度检测和靶向治疗；同时， 基因工程抗体可以通过基因工程技术进行改造和优化，提高其稳定性和功能。
抗体的分类和发展历程
天然抗体
由免疫系统自然产生的抗体，类型多样，特异性各 异。
单克隆抗体
通过杂交瘤技术制备的单一抗体，具有高度特异性 ，可用于治疗和诊断。
基因工程抗体
利用基因工程技术改造的抗体，如人源化抗体、小 分子抗体等，具有更好的治疗潜力和应用前景。
抗体的分类和发展历程
单克隆抗体技术最初诞生于20世纪70年代，由两位科学家Kohler 和Milstein发明。该技术通过将具有特定抗体的B淋巴细胞与骨髓 瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而筛选出能够持续稳定产生单 一抗体的细胞系。单克隆抗体在临床治疗和诊断领域发挥了重要 作用，如治疗癌症、自身免疫性疾病等。
100%
生物治疗
用于治疗肿瘤、自身免疫病、感 染性疾病等，通过与药物结合或 直接作用于靶点发挥作用。
80%
免疫学研究
用于研究免疫应答机制、细胞信 号转导等。
单克隆抗体的优缺点
优点
高度特异性、易于制备和纯化、 可大量生产、稳定性好等。
缺点
制备过程复杂、成本高、可能引 发免疫反应等。
03
基因工程抗体
挑战
机遇
单克隆抗体和基因工程抗体的研发和生产成 本较高，同时存在免疫原性和副作用等问题， 需要进一步研究和改进。
抗体工程 - 1
B淋巴细胞 融合
骨髓瘤细胞
多种杂交细胞
选择培养基上培养
专一抗体 检验阳性 专一抗体 检验阳性 分开不同杂交细胞，克隆 专一抗体，检验阳性细胞 体外培养
克隆杂交细胞
注射到小鼠体内
单克隆抗体
基因工程抗体
基因工程抗体制备
基因工程抗体(Genetic engineering antibody)
根据研究者的意图，采用基因工程方法，在
抗体攻击病毒
凝 集 细 菌
抗 SARS 的单抗 SARS-CoV
整体水平抗体生成技术
多克隆抗体（抗血清）
细胞工程抗体生成技术
单克隆抗体
嵌合抗体、改形抗体
基因工程抗体生成技术
“小型化抗体”（单链抗体）
组合抗体库技术
噬菌体抗体库技术 抗体真核表达技术
多克隆抗体
多克隆抗体（polyclonal antibody）
基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或 修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。 主要包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、双 价抗体和双特异性抗体。
一、人源化抗体
将小鼠Ig基因敲除，转染人Ig基因，在
小鼠体内产生人Ab，再经杂交瘤技术，产生
大量完全人源化抗体
（一）嵌合抗体
方法： 从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定 区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人 -鼠嵌合抗体 特点： 减少了鼠源性抗体的免疫原性 保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力
小结
杂交瘤单克隆抗体制备技术的原理是利用聚乙二
醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细 胞与具有在体 外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一 体，在HAT 选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞 生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养 （克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能 不断繁殖的杂交瘤 细胞系，将这种细胞扩大培养，接 种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的
单克隆抗体与基因工程抗体制备
ATGA
酶切位
点
上游引物：HF1>5’ CGGAATTCATGGTGGACGCTTTCCTGGGC 3’>
下游引物：HF2>5’ GCCTCGAGTCATGCCTCTTTCTCATAAGT 3’>
限制性内切酶
限制性内切酶可识别特定位点并切割 DNA 产生粘性末 端或平端的外源片段，经 DNA 的纯化处理后用于连接反应。
基因工程的操 作技术
1、体外基因重组
目的基因的制备
载体的构建：质粒或
噬菌体
目的基因与载体重组
2、重组体DNA的转 化增殖和表达 转化 筛选 增殖和基因表达
Foreign DNA to be inserted
+
Plansmid vector Joining
Recombinant DNA molecule
酸，通常为A。因此，Taq DNA聚
合酶扩增的产物可与 T-载体进行 粘端互补连接，达到高效克隆的 目的。因为TA克隆法操作最简单， 快速和高效的原因，成为Taq聚合 酶PCR产物的最佳克隆方法。
试剂与器材
1、材料：纯化的PCR产物 2、试剂 （1）LB液体培养基 （2）1.5%琼脂LB固体培养基 （3）5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷（X-gal）储存液(20mg/mL) （4）异丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG）储液(20mg/mL) （7）pEASY-Blint载体系统 3、仪器
单克隆抗体与基因工程抗体的制备
抗体种类：
第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody)
单克隆抗体和基因工程抗体
humanized antibody) 小分子抗体： Fab片段
Fc片段 Fv片段 双特异性抗体(bispecific antibody)： 如：Ig-融合蛋白，抗体导向酶等。
树立质量法制观念、提高全员质量意 识。20.12.2320.12.23Wednes day, December 23, 2020
人生得意须尽欢，莫使金樽空对月。05:54:4705:54:4705:5412/23/2020 5:54:47 AM
安全象只弓，不拉它就松，要想保安 全，常 把弓弦 绷。20.12.2305:54:4705:54Dec-2023-Dec-20
加强交通建设管理，确保工程建设质 量。05:54:4705:54:4705:54Wednesday, December 23, 2020
实际意义：
（1）抗原的纯化和结构分析； （2）细胞发生、分化及功能的阐明； （3）临床疾病的诊断和治疗，
如：免疫分子检测； 免疫导向药物治疗恶性肿瘤 --- McAb抗癌药物(毒素或 放射核素偶联)。
三、基因工程抗体
（genetic engineering antibody）
在DNA水平对Ig基因进行切割、拼接或 修饰，导入受体细胞表达的抗体。
专注今天，好好努力，剩下的交给时 间。20.12.2320.12.2305:5405:54:4705:54:47Dec-20
牢记安全之责，善谋安全之策，力务 安全之 实。2020年12月23日 星期三5时54分 47秒 Wednesday, December 23, 2020
相信相信得力量。20.12.232020年12月 23日星 期三5时54分47秒20.12.23
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淋巴细胞发育 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
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浆细胞
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抗原接种
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（三）细胞融合
培养液： RPM1640培养液 DMEM培养液
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细胞融合剂：
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有限稀释法
特点： 不需任何特殊设备 克隆出现效率高 实验室常用方法
方法： 细胞悬液通过系列稀释 每个培养孔含0.5～1个细胞
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FACS
效率最高 价格昂贵
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第四节 单克隆抗体的应用 一、检验医学诊断试剂 二、蛋白质的提纯 三、小分子抗体的应用 四、抗体融合蛋白的应用 五、双特异抗体的应用 六、抗体库技术的应用和前景
思考题 小结
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第一节 杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术原理：
聚乙二醇（PEG）：细胞融合剂，使免疫的小鼠脾 细 胞与小鼠骨髓瘤细胞融合 HAT培养基的选择培养：反复的免疫学检测筛选克隆 化增殖的杂交瘤 细胞系 单克隆抗体生成：接种杂交瘤 细胞于小鼠腹腔，腹水 中即可得到高效价的单克隆抗体
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抗体种类：
第一代抗体 多克隆抗体（polyclonal antibody) 第二代抗体 单克隆抗体（monoclonal antibody) 第三代抗体 基因工程抗体（genetic engineering antibody)
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（二）免疫脾细胞
动 物：
BALB/c小鼠 7～12周龄 20g～25g体重
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免疫小鼠
细胞性抗原： （1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次
可溶性抗原： 首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周 100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫
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H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物， 阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前 体”，供细胞通过替代途径合成DNA
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HAT选择作用：
淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成 的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡； HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻
融合方法
骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3) 50% PEG 1min内加完; 2min内加10ml培养液
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细胞融合
SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～5 1ml 50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置 90秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG 作用 根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每 孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7天，换用HT培 养液
B淋巴细胞:寿命短,分泌 特异系性抗体 骨髓瘤细胞：寿命长 杂交瘤细胞：寿命长， 单克隆抗体
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一、杂交瘤技术
流 程
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（一）小鼠骨髓瘤细胞
不产生Ig的重链和轻链 HGPRT-;TK与提供淋巴细胞的动物品系相同
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PEG:分子量4000 的PEG是最常用的细胞融合剂 作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞 膜易打开而有助于细胞融合 作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的 PEG，其纯度与毒性有所不同
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培养骨髓瘤细胞： 选择对数生长期的细胞进行传代培养 细胞形态：浑圆、透亮、均一、排列整齐 避免细胞返祖：定期用8-AG处理细胞 注意事项：切忌过多传代培养，可将细胞分装冻存 于-80℃或液氮及干冰中
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第一节 杂交瘤技术的基本原理 一、杂交瘤技术 二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
第二节 单克隆抗体的制备 一、单克隆抗体的产生 二、单克隆抗体的纯化 三、单克隆抗体的性质鉴定 四、单克隆抗体的特性
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第三节 基因工程抗体制备 一、人源化抗体 二、小分子抗体 三、抗体融合蛋白 四、双特异性抗体 五、噬菌体抗体库技术
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骨髓瘤细胞、脾细胞与杂交瘤细胞
SP2/O: HGPRT- ，TK-; 长命 脾细胞: HGPRT+ ，TK+ ;短命(7天) 杂交瘤细胞:HGPRT+ ，TK+; 长命
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杂交瘤细胞：
长期生长繁殖 利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤 碱并最终与T一起合成DNA 从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息 从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力
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二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养与冻存
有限稀释法(limiting dilution) 显微操作法(micromanipulation) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 软琼脂平板法(soft agar method)
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融合细胞的早期培养
10～20天出现克隆 HAT筛选 挑克隆
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（四）杂交瘤细胞的选择性培养
HGPRT酶与TK酶： 次黄嘌呤磷酸核糖转化酶 胸腺嘧啶核苷激酶
应用液： 8-杂氮鸟嘌呤 聚乙二醇
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HAT培养基：
免疫脾细胞的制备： 1×108的淋巴细胞 无菌手术
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饲养细胞： 细胞密度过低不利于细胞生长繁殖 常用小鼠腹腔细胞作饲养细胞 其中MQ还有清除死亡细胞的作用 饲养存活一般不超过2周，不影响杂交瘤细胞 的纯化
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饲正。