大肠杆菌的培养和分离
实验1 大肠杆菌的培养和分离
B．划线上一定会出现单个突变菌株
C．此法不能除去污染的杂菌
D．划线上一定会出现细菌单菌落
7．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是…… …( )
A．对比观察培养基有没有被微生物利用 B．对比分析培养基是否被杂菌污染
C．没必要放入未接种的培养基
D．为了下次接种时再使用
实验2 分离以尿素为氮源的微生物
平均菌落数÷涂布的稀释液体积×稀释倍数 （3）利用鉴别培养基确定细菌种类： 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了 氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高 。因此，我们可以通过检测培 养基pH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基 中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说 明该细菌能够分解尿素。 3．思考题： （1）农作物不能直接吸收利用尿素，但尿素却是农业生产上的重 要氮肥。农作物如何利用尿素中的氮？
2．实验原理：
使用通用的细菌培养基（如LB液体培养基）可扩大培养大肠杆菌，使大肠杆菌迅速扩增。 在LB固体平面培养基上对大肠杆菌进行划线分离，经培养后培养基上每一个菌体会形成一 个单独的菌落。这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选突变菌株的最简便方法之一。 为保证配制的培养基上只生长大肠杆菌，而不被其他微生物污染，实验过程中要进行无菌 操作。
到（ ）
A．无一定形态的群体 B．菌丝 C．单个细菌 D．菌落
4．以下叙述中对尿素培养基进行灭菌的不正确操作是( )
A．对配制好的尿素培养基进行高压蒸汽灭菌
B．用内置滤膜的玻璃漏斗过滤尿素溶液
【实验记录】 请课代表将在37℃恒温培养箱中培养12－24h的培养结果用相机拍摄下 来，传给任课教师。 【结果分析】 1.你的培养基上是否有杂种污染？如何判断？
实验一大肠杆菌的分离和培养
细菌
2.微生物涉及五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
①常用旳固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,能够形成 肉眼可见旳菌落.
2.培养基内所含旳基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
a.灼烧灭菌
注意合用范围
微生物旳接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰旳充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温旳需要保持干 燥旳物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
一般用于培养基旳灭菌
二、试验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
• 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板
• （二）分离纯化大肠杆菌
• 接种措施有：
• 划种未接 种旳培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并统计
三、课题延伸：菌种旳保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏
（长久保 存）
试验1：大肠杆菌旳培养和分离
角烧瓶旳液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h旳菌液在固体培养基旳 平板上连续划线，然后将盖好旳培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
设备及用具：
灭菌锅或高压锅、250ml旳三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm旳培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球旳广口瓶、镊子、有棉塞旳试管 （15mm×120mm）5支
《大肠杆菌的培养和分离》实验设计
《大肠杆菌的培养和分离》实验设计实验目的：1. 掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。
3. 培养和分离大肠杆菌是许多生物技术实验的基础，通过本实验的学习，同学们可以更好地开展相关生物技术实验工作。
实验原理：大肠杆菌是一种常见的肠道细菌，在微生物学及相关学科的研究中具有重要意义。
为了能够更好地开展生物技术实验，需要掌握大肠杆菌的培养方法和分离技巧。
在培养大肠杆菌时，我们一般选用LB培养基（Luria-Bertani培养基），它是一种营养丰富的培养基，可以满足大肠杆菌的营养需求。
在制备LB培养基时，需将适量的蛋白胨、酵母提取液和纯化水混合均匀后加热至沸腾约1分钟，然后加入适量琼脂糖，搅拌均匀后装入烧瓶中。
分离纯化大肠杆菌时，需要将样品（如肠道内容物、污水等）进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围，然后在LB培养基上进行平板培养。
在培养过程中，需要控制培养温度、时间和氧气浓度等因素，以促进大肠杆菌的生长和繁殖。
随着时间的推移，大肠杆菌会在平板上生长成大量的细菌菌落，此时，我们可以将单个细菌菌落挑选出来进行分离纯化，以得到单一纯化的大肠杆菌。
实验材料与仪器：材料：LB培养基、螺旋细胞均一器、平板培养基、霉菌试验纸、吸管、医用酒精、胶体金离子分离剂等仪器：高压灭菌器、移液管、显微镜、细胞计数板实验步骤：1. 制备LB培养基。
2. 取样和稀释。
取样品（如肠道内容物、污水等），取适量于吸管中，并将其进行稀释，使其细菌浓度达到一定范围。
3. 平板培养。
将LB培养基倒入平板中，恰好覆盖平板的整个表面。
待培养基凝固后，使用螺旋细胞均一器将取样液均匀滴在培养基表面上。
将平板置于37℃恒温箱中，控制温度和氧气浓度等因素，待大肠杆菌细菌菌落生长到足够数量时，进入下一步。
4. 分离纯化。
将平板上的大肠杆菌细菌菌落挑选出来，使用吸管将细菌菌落转移到新的平板中进行分离纯化。
一般建议选择较小的细菌菌落进行挑选，这样可以减少细菌间的竞争，提高挑选单一菌株的成功率。
大肠杆菌培养和分离
大肠杆菌培养和分离超净台实验准备工作2灭菌和消毒无菌操作目的：为了避免被杂菌污染。
1对实验操作空间：超净台：紫外线灭菌，过滤风桌面：酒精擦拭，酒精灯外焰附近操作2.操作者衣服和手进行：清洁和消毒，70%酒精3.避免已灭菌处理的材料用具和周围物品的接触消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、用70%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气、高锰酸钾消毒……（1）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。
消毒与灭菌的区别（2）灭菌：灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。
以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。
实验1大肠杆菌的培养和分离超净台上紫外灯和过滤风实验过程：准备阶段：1培养基的配制，2灭菌和消毒操作阶段：1倒平板：分装固体培养基倒平板：将已灭菌的固体培养基倒入培养皿的过程。
分装培养基：1倒平板：将灭菌后的固体培养基倒入培养皿培养基冷却到60度时倒入2培养基的分装（试管，三角瓶，培养皿）倒入三角瓶和试管（漏斗法）1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板。
你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
朊病毒就是蛋白质病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒。
1997年诺贝尔医学/生理学奖的获得者美国生物学家斯垣利·普鲁辛纳(S.B.Prusiner)就是由于研究朊病毒作出卓越贡献而获此殊荣的。
细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，它使得这层壁坚韧并富有弹性。
一旦失去细胞壁，所有的细菌都将变成球形。
细菌细胞壁的主要功能是保护细胞、维持细胞形状、协助鞭毛运动等，而且还与细菌的抗原性、致病性和对噬菌体的敏感性有关。
大肠杆菌的分离及培养条件的优化
结果的比较与讨论
05
结论与展望
authoritarian, however, will be applied to name of which this article's authoritive, however, will be applied to name of which this article_nameOf(其他
含有伊红和美蓝两种染料，对大肠杆菌具有选择性吸附作用，使菌落呈现紫色。
LB培养基
是一种营养丰富的培养基，适用于细菌的大量繁殖，有利于大肠杆菌的生长。
富集培养基
划线分离法
通过在固体培养基上划线，使菌落分散成单个菌落，便于分离纯化。
涂布分离法
将细菌悬浮液均匀涂布在培养基表面，形成单层菌落，便于分离纯化。
通过添加不同营养成分，发现培养基中含适量氨基酸和维生素时，大肠杆菌生长最佳。
pH值对生长的影响
在pH值为7.0时，大肠杆菌的生长最佳，酸碱度过高或过低都不利于其生长。
培养条件优化效果
经过优化后，大肠杆菌的生长速度和菌落数量明显增加。
比较不同分离纯化方法的效果
实验结果表明，划线分离法与液体培养基分离法相比，前者分离纯度更高，但操作繁琐，后者操作简便，纯度也较高。
03
01
02
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结论与展望
结论与展望
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结论与展望
实验1大肠杆菌的分离和培养
接种方法有：
平板划线法和稀释涂布平板法
平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.
在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.
微生物的接种技术
2、纯化大肠杆菌
平板划线的操作方法 交叉划线法 连续划线法
9．倒平板:
倒平板技术
培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？ 答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
问题讨论
4.培养基的用途
液体培养基：增菌 固体培养基：纯化，增菌 半固体培养基：动力检测，保种
二、无菌技术
无菌技术的概念 无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。
将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养基用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170 ℃下灭菌2h。
8．灭菌:
待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种. 无菌检查： 将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。
真菌
培养基
实验1,大肠杆菌的培养和分离
实验1,大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。
3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。
实验材料1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。
2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。
实验步骤1. 培养基灭菌。
在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。
既可以通气，又不使细菌进入。
)。
将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。
同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。
2. 倒平板，倒斜面。
灭菌后。
待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。
超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。
将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。
待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。
倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。
倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。
微生物的利用-大肠杆菌的培养与分离
实验原理
① 培养基 ② 大肠杆菌 ③ LB液体培养基和LB固体培养 基 ④ 划线分离法 ⑤ 菌种的低温保存 ⑥ 无菌技术
一、培养基定义及营养成分
1、定义 人们按照微生物对营养物质的不同需求，配置出供其生长 繁殖的营养基质，称为培养基。 2、营养成分 培养基中的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源、生长 因子等
• 主要方法：无菌室 无菌柜 超净工作台
• ② 无菌实验器材： 凡是实验中使用的器材，能灭菌处理的必须 灭菌。 • 如玻璃器皿 （包括注射器、吸管、滴管、三角瓶、试管等）、培 养基、无菌衣 、口罩等，无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处 理，例如无菌室内的凳、试管架、天平等，这些虽然无法灭菌， 但是可以消毒，可用化学药品熏蒸、喷洒或擦拭。
• 2、营养成分 • ① 碳源 • 为微生物提供碳元素的物质，可分为有机碳源和无机碳源 • 。如 CO2、NaHCO3 等无机碳源； • 糖类、石油、花生粉饼等有机碳源，异养微生物只能利用有机碳 源；单质碳不能作为碳源。 • 注意：碳源&能源的辨析
• 2、营养成分 • ② 氮源 • 为微生物提供氮元素的物质，可分为有机氮源和无机氮源 • 。有机氮源包括牛肉膏，蛋白胨等， • 无机氮源包括 N2、NH3、NH4+、NO3-等，只有固氮微生物才能利 用 N2。
微生物的利用
1大肠杆菌的培养和分离 2分离以尿素为氮源的微生物
大肠杆菌的培养和分离
• 实验目的 • 实验原理 • 实验器具与材料 • 实验步骤 • 实验结果和结论 • 知识拓展
实验目的
• 利用LB液体培养基进行大肠杆菌的扩增培养的操作 • 利用LB固体平面培养基划线培养进行大肠杆菌的分离 • 说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理
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一、大肠杆菌的培养和分离
用__________扩大培养，再用__________分离，形成一个个单独的菌落。
__________培养基是细菌通用培养基；__________培养基是植物组织培养通用培养基2.细菌分离方法比较
__________分离法---方法简单；
__________分离法—单菌落易分离，操作复杂
3.灭菌操作
①灭菌操作的首要条件是各种器皿必须是无菌的
②各种培养基必须是无菌
4.培养和分离步骤
__________→__________→__________培养__________分离→培养保存
5.灭菌与消毒
二、分离以尿素为唯一氮源的微生物
1.实验原理
（1）利用尿素的细菌含有__________，通过降解_______作为其生长的氮源，其反应式如下：（NH2）2C=O+H2O----脲酶→____________________2
（2）利用指示剂（______）颜色变化检验脲酶所催化的反应，若酚红由__________色变为__________色，证明尿素以被脲酶水解产生__________
2实验步骤
制备__________培养基和以______为唯一氮源固体培养基→制备细菌__________，并稀释至10-3、10-4、10-5、10-6→__________分离→培养保存
注意：在恒温箱中培养时，培养皿要__________—防止凝结的蒸馏水滴到培养基上
3预测结果：
①LB全素固体培养基上__________；
②以尿素为唯一氮源固体培养基__________；
③一定时间内，菌落周围出现__________区域；
④用浓度为10-4和10-5土壤稀释液接种，__________土壤稀释液更容易形成单菌落。
高考及高考模拟题
1.（16年10月32T）回答下列（一）（二）小题
（一）请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题
（1）LB固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加，灭菌备用。
（2）尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤，因为G6玻璃砂漏斗，故用于过滤细菌。
然后将尿素溶液加入到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。
（3）取适量含产脲酶细菌的10-4、10-5两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48h，推测固体培养基上生长的菌落数最少的是（A. 10-5稀释液+尿素固体培养基 B. 10-5稀释液+LB固体培养基 C. 10-4稀释液+尿素固体培养基 D. 10-4稀释液+LB固体培养基）。
在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生所致。
（4）制备固定化脲酶时，用石英砂吸附脲酶，装柱。
再用蒸馏水洗涤固定化酶柱，其作用是。
答案：（一）（1）琼脂（2）高压蒸汽孔径小，细菌不能滤过（3）A 红色环氨（或NH3）（4）除去游离的脲酶
2.（17届选择题3月32T）（一）生活饮用水的微生物安全性日常检测是很重要的。
请回答
下列问题：
（1）培养大肠杆菌所用的LB培养基一般用法灭菌。
检验大肠杆菌的含量时，通常将水样用进行一系列的梯度稀释。
（2）将稀释后的水样分别用玻璃刮刀到LB固体培养基，于恒温培养箱，在℃条件进行培养。
用该方法统计样本菌落数时（填需
要或不需要）设置对照组。
（3）下图表示培养和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是_________。
A．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
B．步骤②接种环火焰上灼烧后迅速蘸取菌液后划线
C．步骤③多个方向划线，使接种物逐渐稀释，培养后出现单个菌落
D．步骤④恒温培养箱培养后可用来对大肠杆菌进行计数
答案：（1）高压蒸汽灭菌无菌水（2）涂布倒置37 需要（3）C
3.（金华市17年1月期末32T）(1)在“分离以尿素为氮源的微生物”的实验中，配制好的尿素固体培养基加上封口膜后用方法灭菌，冷却后加入用G6玻璃纱漏斗过滤的尿素溶液。
玻璃纱漏斗角后需用适宜浓度的浸泡，再用冲洗，干燥后保存。
答案：高压蒸汽灭菌 HCl 蒸馏水
4.（湖州市17年1月32T）(一）随着社会的发展，石油产品的使用越来越多，石油烃污染也越来越严重。
为了筛选出分解石油烃能力强的微生物，人们不断地进行研究。
下图为获取能分离出分解石油烃的微生物的土壤样品后的研究过程，请回答有关问题：
(1)获取土壤样品的取样地点最好选在。
为了能有效地分离出分解石油烃的微生物,过程①④所用的选择培养基只能以石油烃作为唯一碳源，其原因是。
(2)根据⑤平板上生长的菌落，对④进行接种采用的方法是 ,若发现在⑤中无法区分菌落，可以将图中③取出的菌液。
(3)纯化菌株时，通常使用的划线工具是。
采用方法对其进行灭菌。
划线的某个平板培养后,第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌落,第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。
造成划线无菌落可能的操作失误是
(写出一点即可)。
答案：（1）石油烃污染明显处只有能利用石油烃的微生物能正常生长繁殖（2）涂布分离进行（梯度）稀释
（3）接种环灼烧接种环灼烧后未冷却；划线未从第一区域末端开始划线
5.（浙江省17届模拟卷二32T）(一）脲酶是催化尿素分解的特异性水解酶。
该酶主要从刀豆等豆科植物提取，现被广泛应用于尿素废水的净化过程。
请分析回答以下问题：
(1)脲酶可以催化尿素分解为，其中碱性物质可以能使酌红指示剂变为。
(2)为了提高脲酶的利用效率，可以釆用固定化酶技术将其固定。
酶的固定化方法有：吸附法、共价偶联法、包埋法和。
(3)实验室中可以采用吸附法将该酶制成固定化酶柱，让尿素废水过柱前，先用10倍体积的蒸馏水洗涤酶柱，目的是。
(4)脲酶除了从植物获取外，还可以来源于土壤中的微生物。
为了从土壤中分离得到队尿素为氮源的微生物,采用的分离方法操作最简便的是。
下列有关该分离方法的操作叙述错误的是。
A.必须使用固体培养基
B.必须在酒精灯火焰旁接种
C.必须将接种后的培养皿倒置培养
D.必须将接种前的培养皿、培养基、土壤悬浮液等进行灭菌处理
答案：(1)NH3和CO2（1分，顺序可对换，错答或漏答不得分）红色（1分）
(2)交联法（1分）（3)除去未吸附的游离尿酶（1分）(4)划线分离法（1分） D(2分）6.（超级全能王16年12月联考32T）(一)漆酶属于木质降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。
下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程。
(1)在步骤①中，用稀释制成不同浓度的样品悬液。
(2)步骤②中将保存在70%酒精中的放在酒精灯火焰上，待火焰熄灭，将菌液涂布到整个平面，将培养皿在37°C恒温培养箱中培养24〜48小时，观察菌落数。
(3)步骤③应选择挑取涂布平板上长出的，再通过划线进一步。
(4)步骤④中，将菌种接种在培养基中，在37°C恒温培养箱中培养24h后，置于冰箱中保存。
(5)若该漆酶大量应用于环境修复，可先用石英砂对漆酶进行 (A.包埋B.共价偶联
C.吸附
D.交联)法固定，再进行工业化使用。
答案：（1)无菌水(2)玻璃刮刀倒置(3)单菌落纯化(4)斜面 4°C (5)C
7.（宁波市17年8月32T）（一）下表是用于从土壤中分离纯化细菌的培养基配方。
请回答：
（1）培养基的类型很多，按照“细菌喜▲，霉菌喜▲”的原则配制上述培养基后，一般还要调节 pH 并对培养基进行▲处理。
（2）分离纯化微生物最常使用的划线分离法中，接种环在菌液中蘸菌液▲（A．一 B．二C．三 D．四）次；若用涂布分离法，则制备细菌悬液时，一般需进行▲处理，为确保操作过程不被杂菌污染，接种必须在▲附近操作。
（3）假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？(列举一项) ▲。
答案：（1）荤素高压蒸汽灭菌（2）A 稀释酒精灯火焰（3）稀释倍数不够（第一次划线后没有灭菌接着第二次划线或培养过程中灭菌不严格受到微生物污染）。