实验1-大肠杆菌的培养与分离

原核生物界
真菌
真菌界
原生动物 原生生物界
特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光 学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结 构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.
细菌的外形与大小
大肠杆菌属于杆状菌
细菌的营养类型
根据细菌所利用的能源和碳源的不同将细菌分 为两大营养类型。
自养菌:
二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落，菌落会沿着划破 处生长，会形成一个条状的菌落。
（四）大肠杆菌的划线分离
1、划线分离法
注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续 划线多次. 2.划线首尾不能相接 3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前 都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需 要灼烧接种环吗？为什么？
划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。 涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。
分离后,一个菌体 便会形成一个菌 落,这是消除污染 杂菌的通用方法, 也是用于筛选高 表达量菌株的最 简便方法之一
（五）大肠杆菌分离后保存
1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成 后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形 的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、 高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的 芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随 风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽 孢又可以萌发，形成一个细菌.
【课堂练习】
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ D） A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是 （ B）
A.防止杂菌污染
B.接种前菌种要进行灭菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌
培养基加入试管、培养皿，壁上不能沾有培养基，易 污染，培养基必须用三角漏斗转移。
试管或三角瓶制作棉塞好坏是控制污染发生的关键。 可用封口膜代替。
G6玻璃砂漏斗用后需1mol/L的HCL浸泡并抽滤去酸，再 用蒸馏水洗至中性，干燥保存
1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被 其他外来微生物污染外，还有什么目的？
2、稀释涂布平板法
涂布分离法的操作：
先将培养的菌液稀释，通常稀释10-5～10-7 倍。取0.1mL稀释度不同的菌液，加在培 养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在 培养基平面上，然后进行培养。其中在适 当的稀释度下，可培养到相互分开的菌落， 通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为 适宜。
划线分离法和涂布分离法哪个更好呢？
光合自养型:光合细菌 化能自养型:硝化细菌,铁细菌,硫细菌
异养菌:
腐生菌和寄生菌（大部分病原菌）
大肠杆菌属于异养兼性厌氧菌
(二)细菌的常识
1、结构 2、分裂: 简单的二分裂 3、生殖： 分裂生殖 4、变异类型：基因突变
细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌（纤）毛、荚膜、 细胞壁、细胞膜、细胞质、 拟核，细胞质中又有 液泡、储存性颗粒、核质等。
4、紫外光灭菌 超净台：打开紫外线和过滤风（人必须离 开），灭菌30分钟，后关闭紫外灯（过滤风 不关）。
5、过滤灭菌 G6玻璃砂漏斗过滤：不能加热灭菌的化合物 （尿素），G6孔径最小，细菌不能滤过。
灭菌操作的注意点：
高压蒸汽灭菌中不能用脱脂棉，易吸水引起污染。
高压蒸汽灭菌培养基，如含有葡萄糖，用500g/cm2， 90℃灭菌30分钟，防止葡萄糖分解碳化
H2O
含量 10g
0.4g
4.0g 9.25g 0.5g 0.5g 100ml
（3）若除去成分②，加入（CH2O）， 该培养基可用于培养 固氮微生物。 （4）表中营养成分共有 3 类。 （5）不论何种培养基，在各种成分都 溶化后分装前，要进行的是 调整pH。 （6）右表中各成分重量确定的原则 是 依微生物的生长需要确定 。 （7）若右表培养基用于菌种鉴定，应 该增加的成分 琼脂（或凝固剂）。
分离时接种方法:平板划线法和稀释涂布平板法 划线分离法:无菌操作台上用接种环取菌后在固体培养基的平 板上连续划线.（划线的末端出现不连续的单个菌落）
涂布分离法:是指将培养的菌液稀释一定的倍数,然后取一定量 稀释液加在固体培养基上,用玻璃刮刀涂布在培养基平面上.
平板划线的操作
一旦划破，会造成划线不均匀，难 以达到分离单菌落的目的；
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进 行划线？
答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么 总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始 处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使 细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
喜荤
成分
蛋白胨和酵母提 取物，加入一定 氯化钠，维持渗 透压
PH
中性偏碱
霉菌培养基
喜素
无机物配置或添 中性偏酸 加蔗糖的豆芽汁
通用的细菌培养基——LB培养基
分类：
LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离
3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、 和氮源、 无机盐、生长因子(即细菌生长必 需，而自身不能合成的化合物,如维生素、 某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)等营养物质。 另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养 物质以及氧气的要求．
LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离
（二）倒平板
灭菌后的（固体）培养基在无菌操作台（超净台）上倒 入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动， 使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面
注意事项：
1.高压锅压力与大气压相等时打开锅盖；
2.无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌(灯开后,人必须 离开),固体培养基冷却到60度（感觉不烫手）关灯.
1.如何操作才可以尽量避免被杂菌污染?
(1)胆大心细，操作快捷。（2）注意灭菌操作 原则，灭菌彻底，降低环境污染概率。（3） 注意微生物生长条件，如PH、渗透压、温度等。 细菌喜碱，喜蛋白质，喜37度；霉菌喜酸，喜 糖，喜25-30度
2.在培养后如何判断是否有杂菌污染?
（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色 等。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。
4.培养基的实际用途：
液体培养基：扩增细菌、工业生产
固体培养基：纯化（分离），鉴定、活 菌计数、保藏菌种
半固体培养基：动力检测
区别：是否加入琼脂（琼脂糖）凝固剂
碳源：
可作为碳源的物质有: 含碳无机物: 碳酸盐、碳酸氢盐、二氧化碳 含碳有机物： 糖类（主要）葡萄糖 乳糖
蛋白质 脂肪酸
不同微生物所利用的碳源不同: 异养型微生物的碳源为 含碳有机物（有机碳） 自养型微生物的碳源为 含碳无机物（无机碳）
第一部分 :微生物的应用
实验目的:
1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进 行细菌培养的操作
2.进行大肠杆菌的分离,用固体平板培养基 进行细菌的划线培养
3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原 理
一、基础知识： (一)微生物 ：是一切肉眼看不见或看不清 楚的微小生物的总称．
病毒
病毒界
细菌 微生物包括哪五类： 放线菌
D.灭菌必须在接种前
例3．右表是某微生物培 编号 养基成分，请据此回答：
（1）右表培养基可培养 ①
的微生物类型
②
是 自养型微生。物
（2）若不慎将过量
③
NaCl加入培养基中。
④
如不想浪费此培养基， ⑤
可再加入含碳有机.物
⑥
⑦
成分
粉状硫
（NH4） 2SO4
K2HPO4 MgSO4 FeSO4 CaCl2
大肠杆菌
细菌分类方法：革兰氏染色
革兰氏染色法是一种用于细菌的染 色法。此法将细菌分为两类，即革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革兰 氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后， 再用脱色液处理，细菌仍保留染色液 的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两 种菌的差别在于细胞壁的成分不同。
大肠杆菌属于革兰氏阴性菌
培养基
4.实验完成后,接种过细菌的器皿应如何处理?
所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后 再洗涤（特别是培养基）；使用后的废
弃物也要高压灭菌后再抛弃
5.如果分离的是转基因的大肠杆菌,如何保证不被普通的 大肠杆菌所污染?
转基因用的质粒不是细菌中原有的，而是经 过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列， 所以可用含有相应抗生素的培养基对菌体进 行培养。
固体培养基：菌落
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
无菌技术（无菌操作）
1.无菌技术的概念
泛指在培养微生物的操作中，所有防 止杂菌污染的方法。 无菌操作成功地培养微生物的关键。
方法： 消毒和灭菌
2.消毒与灭菌的概念及两者的区别
消毒定义：
是指杀灭或清除传播媒介上的病原微生物， 使之达到无害化的处理。
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接 种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划 线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后， 接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种 环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而 通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数 目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧 接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避 免细菌污染环境和感染操作者。
氮源：
可作为氮源的物质有: 含氮无机物： 氮气 、氨气 、氨盐 、硝酸盐 含氮有机物： 蛋白胨
牛肉膏 尿素
固氮微生物所利用的氮源是：氮气
菌落
单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体，叫做菌落。