实验一 大肠杆菌的分离和培养
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实验一大肠杆菌的培养和分离
３.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅 在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培 养微生物吗？为什么？
答：皿盖与皿底之间的培养基易滋生杂菌，因 此不宜用此皿继续培养。
连续划线法
2.为什么要研究微生物？
90%以上对人类有利的，少数能引起传染病。 1.利用微生物生产食品、药品，如酒类、抗生素等； 2.微生物治理环境污染； 3.利用微生物生产新能源。 4.用于基因工程
一、实验目的（教学要求）
1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌 培养的操作； 2.进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的 划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
稀释→涂布→培养
玻璃 三角 刮刀
划线分离法：简单。涂布分离法：单菌落更易 分开，但操作复杂些。
4.扩大培养过程和分离过程
（1）制备５０ml的LB（液体和固体）培养基
①配制：： 蛋白胨：０.５g 酵母提取物：０.２５g 氯化钠：０.５g 溶于热水并加水至５０ml，并调pH（７.６）
固体培养基： 上述物质中再加１g琼脂。
答：利用标记基因所对应的性状（如抗青霉素） 保留转基因大肠杆菌，杀死普通大肠杆菌。
６.本实验的目的是什么？
答：尝试培养微生物的基本技术；学习培养、 分离提纯大肠杆菌的方法。
７.本实验的实验原理是什么？
答：微生物能够利用培养基中的各种营养物质 进行生长和繁殖。划线或涂布可以使单个细菌 繁殖成单个菌落，从而分离。
②灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，
塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭
菌锅，在压力为1kg/cm2、温度为121℃，灭菌
15min。 ③倒平板:
待培养基冷却到６0 ℃左右时，在酒精灯附 近倒平板。（倒平板操作见课本）(试管斜面的 制作方法类似)
答：皿盖与皿底之间的培养基易滋生杂菌，因 此不宜用此皿继续培养。
连续划线法
2.为什么要研究微生物？
90%以上对人类有利的，少数能引起传染病。 1.利用微生物生产食品、药品，如酒类、抗生素等； 2.微生物治理环境污染； 3.利用微生物生产新能源。 4.用于基因工程
一、实验目的（教学要求）
1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌 培养的操作； 2.进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的 划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
稀释→涂布→培养
玻璃 三角 刮刀
划线分离法：简单。涂布分离法：单菌落更易 分开，但操作复杂些。
4.扩大培养过程和分离过程
（1）制备５０ml的LB（液体和固体）培养基
①配制：： 蛋白胨：０.５g 酵母提取物：０.２５g 氯化钠：０.５g 溶于热水并加水至５０ml，并调pH（７.６）
固体培养基： 上述物质中再加１g琼脂。
答：利用标记基因所对应的性状（如抗青霉素） 保留转基因大肠杆菌，杀死普通大肠杆菌。
６.本实验的目的是什么？
答：尝试培养微生物的基本技术；学习培养、 分离提纯大肠杆菌的方法。
７.本实验的实验原理是什么？
答：微生物能够利用培养基中的各种营养物质 进行生长和繁殖。划线或涂布可以使单个细菌 繁殖成单个菌落，从而分离。
②灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，
塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭
菌锅，在压力为1kg/cm2、温度为121℃，灭菌
15min。 ③倒平板:
待培养基冷却到６0 ℃左右时，在酒精灯附 近倒平板。（倒平板操作见课本）(试管斜面的 制作方法类似)
实验1 大肠杆菌的培养和分离
B．划线上一定会出现单个突变菌株
C．此法不能除去污染的杂菌
D．划线上一定会出现细菌单菌落
7．将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱的目的是…… …( )
A．对比观察培养基有没有被微生物利用 B．对比分析培养基是否被杂菌污染
C．没必要放入未接种的培养基
D．为了下次接种时再使用
实验2 分离以尿素为氮源的微生物
平均菌落数÷涂布的稀释液体积×稀释倍数 （3）利用鉴别培养基确定细菌种类： 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了 氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高 。因此，我们可以通过检测培 养基pH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基 中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，说 明该细菌能够分解尿素。 3．思考题： （1）农作物不能直接吸收利用尿素，但尿素却是农业生产上的重 要氮肥。农作物如何利用尿素中的氮？
2．实验原理：
使用通用的细菌培养基（如LB液体培养基）可扩大培养大肠杆菌，使大肠杆菌迅速扩增。 在LB固体平面培养基上对大肠杆菌进行划线分离，经培养后培养基上每一个菌体会形成一 个单独的菌落。这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选突变菌株的最简便方法之一。 为保证配制的培养基上只生长大肠杆菌，而不被其他微生物污染，实验过程中要进行无菌 操作。
到（ ）
A．无一定形态的群体 B．菌丝 C．单个细菌 D．菌落
4．以下叙述中对尿素培养基进行灭菌的不正确操作是( )
A．对配制好的尿素培养基进行高压蒸汽灭菌
B．用内置滤膜的玻璃漏斗过滤尿素溶液
【实验记录】 请课代表将在37℃恒温培养箱中培养12－24h的培养结果用相机拍摄下 来，传给任课教师。 【结果分析】 1.你的培养基上是否有杂种污染？如何判断？
实验一大肠杆菌的分离和培养
单菌落
实验讨论 实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？
• 实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须 先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可 能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有 害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必 须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭 菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30 min ,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可 再用。
病毒
细菌
2.微生物包括五类 放线菌
真菌
原生动物
(二)培养基
• 1.分类(按物理形态分) • (1)液体培养基 • (2)固体培养基
常用的固体培养基: 琼脂固体培养基.
②微生物在固体培养基 表面生长,可以形成 肉眼可见的菌落.
2.培养基内所含的基本物质
• (1)水 • (2)碳源 • (3)氮源 • (4)无机盐
个培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平 面。 • (3)接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到 三角烧瓶的液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培 养12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h的菌液在固体培养基 的平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在 37℃恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环 取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养 24h, 4℃冰箱保存。
灼菌烧灭菌
注意适用范围
微生物的接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰的充分燃烧层灼烧
• 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
• 高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
高中生物选修一 第一部分 实验1 大肠杆菌的培养和分离
资料： 19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造
业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中， 出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研 究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的 根源在于发酵物中混入了杂菌。由此人们认识 到保持培养物纯净的重要性。
如何保持培养物纯净呢？
无菌技术：
1.消毒与杀菌 ①消毒：消除表面或内部的部分微生物 ②杀菌：杀死内外所有微生物，包括芽孢和孢子
配制培养基的过程：
计算 → 称量 → 溶化（溶解） →灭菌 →倒平板
注意：
1.培养基冷却至50℃左右倒平板 2.倒平板时应在酒精灯附近操作
培养基的分类：
1.物理性质 ①液体培养基：菌种培养或工业生产 ②半固体培养基：观察微生物运动 ③固体培养基：微生物的分离、鉴定、计数
2.组成成分 ①合成培养基：分离、鉴定微生物 ②天然培养基：生产
3.用途：★ ★ ★ ①选择培养基：缺某种物质或多加某种物质 ②鉴别培养基：加指示剂或化学药品
月桂基硫酸盐 胰蛋白胨肉汤
（LST）
配
倒平板：
接种：
接种针灼烧灭菌
平板划线
大肠杆菌的纯化方法：
稀释涂布平板法
平板划线法
大肠杆菌的分离纯化
——结晶紫中性红胆盐琼脂
2.常用方法 巴氏消毒法：牛奶 化学药剂：双手、水源 灼烧灭菌：接种环等（金属） 干热灭菌：160-170℃ 1-2h （玻璃器皿、金属） 高压蒸汽灭菌：121℃ 100KPa 15-30min（培养基） 紫外线消毒法：30min（空气中的微生物） 酒精灯火焰附近操作；超净工作台上操作。
回忆有关细胞的元素组成、分子 组成的知识，想一想微生物应该生活 在什么环境中呢？
1.平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌 要求：
业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中， 出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研 究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的 根源在于发酵物中混入了杂菌。由此人们认识 到保持培养物纯净的重要性。
如何保持培养物纯净呢？
无菌技术：
1.消毒与杀菌 ①消毒：消除表面或内部的部分微生物 ②杀菌：杀死内外所有微生物，包括芽孢和孢子
配制培养基的过程：
计算 → 称量 → 溶化（溶解） →灭菌 →倒平板
注意：
1.培养基冷却至50℃左右倒平板 2.倒平板时应在酒精灯附近操作
培养基的分类：
1.物理性质 ①液体培养基：菌种培养或工业生产 ②半固体培养基：观察微生物运动 ③固体培养基：微生物的分离、鉴定、计数
2.组成成分 ①合成培养基：分离、鉴定微生物 ②天然培养基：生产
3.用途：★ ★ ★ ①选择培养基：缺某种物质或多加某种物质 ②鉴别培养基：加指示剂或化学药品
月桂基硫酸盐 胰蛋白胨肉汤
（LST）
配
倒平板：
接种：
接种针灼烧灭菌
平板划线
大肠杆菌的纯化方法：
稀释涂布平板法
平板划线法
大肠杆菌的分离纯化
——结晶紫中性红胆盐琼脂
2.常用方法 巴氏消毒法：牛奶 化学药剂：双手、水源 灼烧灭菌：接种环等（金属） 干热灭菌：160-170℃ 1-2h （玻璃器皿、金属） 高压蒸汽灭菌：121℃ 100KPa 15-30min（培养基） 紫外线消毒法：30min（空气中的微生物） 酒精灯火焰附近操作；超净工作台上操作。
回忆有关细胞的元素组成、分子 组成的知识，想一想微生物应该生活 在什么环境中呢？
1.平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌 要求：
实验一大肠杆菌的培养和分离
操作时右手无名指和小指 夹住封口膜，另外三指持 三角瓶，左手拿培养皿并 打开上盖的一边，在酒精 灯火焰旁操作。
.
19
（三）大肠杆菌的接种
将斜面上培养的大肠杆菌菌种用接种环接种到灭菌后的LB液 体培养基中，将三角瓶的封口膜和斜面的棉塞复原。
注意事项: 1.在火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌，冷却后方能取菌； 3.接种时右手拿着接种环，右手 无名指和小指夹住斜面的棉塞和 三角瓶封口膜； 4.取菌后封口膜和棉塞复原.
LB（Luria-Bertani）液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取液5g/L，
氯化钠10g/L。
（可用于大肠杆菌的扩大培养）
配制50mL的LB培养基：蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠 0.5g，加50mL水溶解。
LB（Luria-Bertani）固体培养基：50ml LB（Luria-Bertani）液 体培养基中再加入1g琼脂制得。（可用于大肠杆菌的划线分离） 固体培养基可根据需求制成平面或斜面。
培养基：一般 121℃灭菌15min 有葡萄糖：500g/cm2（90℃以上）灭菌30min 有尿素等不能加热的物质：G6玻璃砂漏斗（玻璃砂漏斗用
后需用1mol/L的HCl浸泡，抽滤去酸）
进行操作时，注意瓶口、壁上等不能沾有培养基，否则易发生污染。
.
11
大肠杆菌的培养和分离实验操作步骤
.
12
• 实验器材
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（四）大肠杆菌的扩大培养
三角瓶在37℃，每分钟200转的摇床上振荡培养12h。
.
21
（五）大肠杆菌的划线分离
1、操作步骤 （1）灼烧接种环； （2）接种环冷却后，从在摇床上培养了12h的菌液中蘸取菌液； （3）在近火焰处，用带菌液接种环在固体培养基上划线。
实验一大肠杆菌的培养与分离(最新)
恒温培养箱
实验设备和用品： 1、灭菌锅或高压锅 2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈P22 P26 3、直径90mm的培养皿 4、接种环和玻璃三角刮刀 5、恒温培养箱 6、摇床
摇床
实验设备和用品： 1、灭菌锅或高压锅 2、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈 3、直径90mm的培养皿 4、接种环和玻璃三角刮刀 5、恒温培养箱 6、摇床 7、酒精灯和超净台
1-1什么是生物技术
• 生物技术=生物工程
应用自然科学及工程学原理，以微生 物体、动物体、植物体或其组成部分作为 生物反应器将物料进行加工，以提供产品 来为社会服务的技术。
1-2 传统生物技术
• 传统生物技术指主要通过微生物 的发酵来生产商品.如:酱、醋、 酒、面包、奶酪、酸奶等
1-3 现代生物技术
②保护细胞免受外力的损伤； ③阻拦大分子物质进人细胞； ④使细胞具有致病性及对 噬菌体的敏感性。
伤 寒 杆 菌 细 胞 壁 中 含 毒 素
有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠 体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环 境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才 死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水 分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.
特点：结构简单，形体微小，通常要用光学显微镜或 电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构。 用途：90%以上的微生物是对人类有利的。如抗生素 多数来源放线菌和霉菌；酒由酵母菌发酵产生，腐乳 由红曲霉和毛霉发酵制成；微生物也能消除环境污染， 在新能源领域将发挥巨大作用。
1）放线菌
1、结构： 单细胞原核 分支状的菌丝（基内菌丝、气生菌丝）
分离后,一个菌体 便会形成一个菌 落,这是消除污染 杂菌的通用方法, 也是用于筛选高 表达量菌株的最 简便方法之一
实验1 大肠杆菌的培养和分离
（1)简述甘蔗大规模快速繁殖技术的过程。
（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行 诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤2:制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意＿和 ＿，加琼脂后灭菌，制成
本图来自十一学校
二、实验流程 配制培养基
包器材
灭菌
倒平板(或斜面)
接种扩大培养 分离
单菌落培养
接种保存
细菌的分离方法
1.种类: 划线分离法和涂布分离法。 划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 划线时不能划破培养基
2.作用: 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表 达量菌株的最简便方法之一。
实验一
大肠杆菌的培养和分离
微生物
定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生 生物和某些真菌。
曲霉
酵
母
菌
草履虫
细菌：是单细胞的原核生物。 结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核 分裂方式：二分裂
菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养 基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有 一定形态结构等特征的子细胞的群落。
为什么要倒置培养？
培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养 皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并 且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互 影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
1.下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接 种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
（2）具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行 诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。 步骤2:制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意＿和 ＿，加琼脂后灭菌，制成
本图来自十一学校
二、实验流程 配制培养基
包器材
灭菌
倒平板(或斜面)
接种扩大培养 分离
单菌落培养
接种保存
细菌的分离方法
1.种类: 划线分离法和涂布分离法。 划线分离法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操 作,将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面. 划线时不能划破培养基
2.作用: 是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表 达量菌株的最简便方法之一。
实验一
大肠杆菌的培养和分离
微生物
定义:结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的低等生物，包括病毒、原核生物、原生 生物和某些真菌。
曲霉
酵
母
菌
草履虫
细菌：是单细胞的原核生物。 结构组成：细胞壁（肽聚糖）、细胞膜、细胞质，拟核 分裂方式：二分裂
菌落：由单个细菌（或其他微生物）在适宜固体培养 基表面或内部生长繁殖到一定程度；形成肉眼可见有 一定形态结构等特征的子细胞的群落。
为什么要倒置培养？
培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养 皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并 且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互 影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。
1.下面两图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接 种后培养的效果图解，请分析接种的具体方法。
实验1,大肠杆菌的培养和分离
实验1,大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。
2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。
3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。
实验材料1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。
2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。
实验步骤1. 培养基灭菌。
在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。
既可以通气，又不使细菌进入。
)。
将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。
同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。
2. 倒平板，倒斜面。
灭菌后。
待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。
超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。
将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。
待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。
倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。
倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。
实验1-大肠杆菌的培养与分离
高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌器：1Kg/cm2， 121℃温度下维持15min 。
应用此法灭菌，一定要充分 排除灭菌器内原有的冷空气。 用于普通培养基、生理盐水、 耐热药品、手术敷料等。
手提式高压蒸汽灭菌器
（五）大肠杆菌分离后保存 1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成 后置于4℃冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法
1.在培养后如何判断是否有杂菌污染?
（1）菌落的形态看，是否湿润，透明，粘稠，颜色等。 是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。
（2）显微镜观察其形态、大小、看是否有菌丝、孢子、 芽孢。是区别细菌、酵母、放线菌和霉菌关键指标。
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶， 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可 以进行倒平板了。
（三）大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体 培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项: 1.火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.
液体培养基） 培养皿 接种环 酒精棉 酒精灯 镊子、火柴、记号笔
二、大肠杆菌的培养和分离实验操作
（一）培养基的配制与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养 基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上 封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。
LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离 封口膜：既通气 又不使菌进入
（四）大肠杆菌的划线分离
1、划线分离法
注意事项: 1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不同位置连续划 线多次. 2.划线首尾不能相接 3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
实验1：大肠杆菌的培养和分离
养基
天然培养基
(根据用途)：
全营养培养基：含有微生物生长所需各种营养，
用于微生物生长和增殖
选择培养基：添加或减少某种成分，从多种微
生物中分离出所需的微生物
鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，鉴
定是否含有所要测定的微生物
一、基础知识
（二）培养基： 2、培养基的营养成分：
种 类 查氏培养基 成 分 NaNO3 0.3g 、 KCl 0.05g 、 K2HPO4 0.1g 、 FeSO4 0.001g 、MgSO4•7H2O 0.05g、蔗糖 3g 、 H2O 100g
麦芽汁培养基
干麦芽粉加四倍水
一、基础知识
（二）培养基： 供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养
液体培养基 1、分类(按物理状态)： 半固体培养基 固体培养基
60~80℃烘 箱中烘干
•操作步骤： 加塞封口、包扎 —— 灭菌 ——烘干
•通常试管用棉塞(2/3在试管 内)，三角瓶用封口膜或纱布。 •作用：既通气又阻止杂菌进 入 •不能用脱脂棉(易吸水引起污 染)。 用牛 皮纸 或报 纸包 扎 •放入高压蒸汽灭菌锅, 在121℃(1Kg/cm2压 力)下灭菌15min。 •培养基中若有葡萄糖, 用500g/cm2压力(90 ℃以上)灭菌30min。 防止葡萄糖分解碳化 •不能加热灭菌的化合 物(如尿素)，只能用 G6玻璃砂漏斗过滤。 细菌不能滤过G6
灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
用于接种工具(接 种环、接种针)或 其他金属用具。
干热灭菌
160－170℃；1－2h 用于能耐高温的需要保持干燥 的物品(如玻璃器皿)。
高压蒸汽灭菌
121℃(1Kg/cm2压力)；15min 最常用。通常用于培养基及各种 器具的灭菌。
天然培养基
(根据用途)：
全营养培养基：含有微生物生长所需各种营养，
用于微生物生长和增殖
选择培养基：添加或减少某种成分，从多种微
生物中分离出所需的微生物
鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，鉴
定是否含有所要测定的微生物
一、基础知识
（二）培养基： 2、培养基的营养成分：
种 类 查氏培养基 成 分 NaNO3 0.3g 、 KCl 0.05g 、 K2HPO4 0.1g 、 FeSO4 0.001g 、MgSO4•7H2O 0.05g、蔗糖 3g 、 H2O 100g
麦芽汁培养基
干麦芽粉加四倍水
一、基础知识
（二）培养基： 供微生物等生长繁殖所需的人工配制的营养
液体培养基 1、分类(按物理状态)： 半固体培养基 固体培养基
60~80℃烘 箱中烘干
•操作步骤： 加塞封口、包扎 —— 灭菌 ——烘干
•通常试管用棉塞(2/3在试管 内)，三角瓶用封口膜或纱布。 •作用：既通气又阻止杂菌进 入 •不能用脱脂棉(易吸水引起污 染)。 用牛 皮纸 或报 纸包 扎 •放入高压蒸汽灭菌锅, 在121℃(1Kg/cm2压 力)下灭菌15min。 •培养基中若有葡萄糖, 用500g/cm2压力(90 ℃以上)灭菌30min。 防止葡萄糖分解碳化 •不能加热灭菌的化合 物(如尿素)，只能用 G6玻璃砂漏斗过滤。 细菌不能滤过G6
灼烧灭菌 干热灭菌 高压蒸汽灭菌
灼烧灭菌
用于接种工具(接 种环、接种针)或 其他金属用具。
干热灭菌
160－170℃；1－2h 用于能耐高温的需要保持干燥 的物品(如玻璃器皿)。
高压蒸汽灭菌
121℃(1Kg/cm2压力)；15min 最常用。通常用于培养基及各种 器具的灭菌。
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单菌落
实验讨论 实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？
• 实验完成后，所有接触过细菌的器皿都必须 先高压灭菌后再洗涤，特别是培养基，有可 能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有 害菌体影响人畜健康，也污染环境，因此必 须高压灭菌。使用后的废弃物也要高压灭菌 后再抛弃。对于取样器的取样头，通常是灭 菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤纶30 min ,再用清水洗净，仍可再用。封口膜也可 再用。
实验材料：
(1)50mlLB液体培养基：蛋白胨0.5g、酵母提取物0.25g、 NaCl 0.5g、加水50ml。 (2)大肠杆菌菌种斜面 (3)空白斜面
实验步骤
• (1) 灭菌：将配制好的50mlLB液体培养基和50mlLB液体 培养基分别装入两个250ml • 的三角瓶中，加上封口膜，用高压锅进行灭菌。 • (2) 制平板：在酒精灯火焰旁将固体培养基分别倒在4个 培养皿中，使培养基铺平皿底部，待凝，使之形成平面。 • (3)接种扩大培养：靠近酒精灯火焰将大肠杆菌接种到三 角烧瓶的液体培养基中，三角烧瓶在37℃摇床振荡培养 12h。 • (4) 划线分离：将摇床上培养12h的菌液在固体培养基的 平板上连续划线，然后将盖好的培养皿倒置，放在37℃ 恒温培养箱中进行培养。 • (5)单菌落接种培养：在无菌操作下将单菌落用接种环取 出，再用划线法接种在空白斜面上，在37℃下培养24h, 4℃冰箱保存。
细
毒
菌2.微生物包括五类源自放线菌 真 菌原生动物
(二)培养基
• • • 1.分类(按物理形态分) (1)液体培养基 (2)固体培养基
①常用的固体培养基: 琼脂固体培养基. ②微生物在固体培养基 表面生长,可以形成 肉眼可见的菌落.
2.培养基内所含的基本物质
• • • • (1)水 (2)碳源 (3)氮源 (4)无机盐
三、课题延伸：菌种的保藏
• 1、斜面保藏 • （临时保存） • 2、甘油保藏 （长期保存）
实验1：大肠杆菌的培养和分离
设备及用品：
灭菌锅或高压锅、250ml的三角瓶、封口膜和橡皮圈、 直径90mm的培养皿、接种环和玻璃三角刮刀、恒温培 养箱、摇床、酒精灯和超净台、一次性塑料手套、装有 酒精棉球的广口瓶、镊子、有棉塞的试管 （15mm×120mm）5支
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
通常用于培养基的灭菌
二、实验操作 • （一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 • 计算－称量－溶化－灭菌－倒平板 • （二）分离纯化大肠杆菌 • 接种方法有： • 划线分离法和涂布分离法
• （三）将接种后的培养基和一个未接 种的培养基放入37℃恒温箱中培养12h 和24h后，观察并记录
（2）灭菌
① 概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的 微生物，包括芽孢和孢子。 ② 方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌
a.灼烧灭菌
注意适用范围
微生物的接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰的充分燃烧层灼烧
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
实验1
大肠杆菌的培养和分离
实验目的：
• 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进 行细菌培养的操作。 • 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基 本进行细菌的划线培养。 • 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。
一、基础知识 • (一)微生物:
1.特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要 用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没 有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光 合作用. 病
3.培养基内所需的其他条件 • (1)pH值 • 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱 性 • (2)特殊营养物质---- ? 生长因子 • 如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生 素 • (3)氧气的含量 • 如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件
(三)无菌技术
• 1、获得纯净培养物的关键: 防止外来杂菌的入侵 • 2、无菌技术 的四个方面(参看教材20页) • 3、消毒与灭菌 (1)消毒： ① 概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体 表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢 和孢子吗？ (不包括芽孢和孢子) ② 方法: a. 煮沸消毒法 b. 巴氏消毒法:如牛奶的消毒 c. 化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等 d. 紫外线消毒