大肠杆菌的培养和分离

划线分离法注意事项:
1.接种环只蘸一次菌液,但要在培养基不 同位置连续划线多次.
2.划线首尾不能相接
3.划线后,培养皿倒置培养12~24h
1.培养基灭菌后，需要冷却到50 ℃左右时， 才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的 温度？
答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶， 感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可 以进行倒平板了。
物的过程。
（2）灭菌：
以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括 所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到 完全无菌的过程。
灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最 普通也是最重要的技术。
1)消毒：
① 概念：使用较为温和的物理或化学方法仅
杀死物体表面或内部一部分对人体有害的
微生物。包括芽孢和孢子吗？
② 方法:
3、消毒与灭菌
无菌技术的四个方面
（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进 行清洁和消毒 ；
（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具 进行灭菌 ；
（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近旁进行；
（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品 相接触。
消毒与灭菌
（1）消毒： 利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生
1
2.请你判断以下材料或用具是否需要 消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的 方法。
（1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手
答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。
二、大肠杆菌的培养和分离实验操作
（一）培养基的配置与灭菌
取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养 基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上 封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭菌15min。
2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物 污染培养基。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再 进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什 么总是从上一次划线的末端开始划线？ 答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始 处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使 细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
b. 干热灭菌 160－170℃ ；1－2h
能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿)
c.高压蒸汽灭菌 100kPa 121℃ 15-30min
通常用于培养基的灭菌
高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三： 1、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性； 2、湿热穿透力强； 3、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效 果，因此，它是效果最好的灭菌方法。
微生物(microorganism)
结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有 细胞结构的等生物。
例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型 原生动物等等
微生物的利用： 抗生素；酒；腐乳；污水治理……
大肠杆菌的培养与分离
一、大肠杆菌（E. coli）
兼性厌氧的肠道内的共生菌群
合成维生素B和维生素K，供机体利用； 产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和 腐生菌滋生。
2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭 菌；桌面及人手用酒精棉球消毒
3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三 角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁 操作.
4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，灼烧灭菌
5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的 水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养 基，造成污染.
革兰氏阴性菌
作为一种工程菌， 在基因工程技术中被广泛采用。 例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素
LB培养基的配方
培养基成分 蛋白胨
酵母提取物
各成分的量 0.5g 0.25g
NaCl
0.5g
H2O
加至50ml
固体培养基的配制：每50ml 液体培养基添加1g 琼脂
琼脂？ 凝固剂
红藻中提取的多糖,在98 ℃以上熔化，44 ℃以 下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。
平板划线分离法
平板划线的操作
不能使用脱 脂棉，否则 容易吸水， 造成污染。
一旦划破，会造成划线不均匀，难 以达到分离单菌落的目的；
二是存留在划破处的单个细胞无法 形成规矩的菌落，菌落会沿着划破 处生长，会形成一个条状的菌落。
单菌落
进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？
答：恒温培养时，培养基的水分会以水蒸气的 形式蒸发，倒放培养皿会是水蒸气凝结成水滴留 在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴回 落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成 菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落相互影响， 很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此， 恒温培养时，培养皿必须倒置。
LB液体培养基——细菌的扩大培养 LB固体培养基——细菌的划线分离 封口膜：既通气 又不使菌进入
（二）倒平板
灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒 后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底 部，待凝，使之形成平面
培养皿壁上 不能沾有培 养液，否则 容易污染。
注意事项：
1.培养基灭菌后，需要冷却到60 ℃左右时，才能用来 倒平板
(不包括芽孢和孢子)
a. 煮沸消毒法
b. 巴氏消毒法:如牛奶的消毒
c. 化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤
酚皂溶液等
d. 紫外线消毒
（2）灭菌
① 概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生 物，包括芽孢和孢子。
② 方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭菌
a.灼烧灭菌
注意适用范围
微生物的接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰的充分燃烧层灼烧
（三）大肠杆菌的扩大培养
将斜面上培养的大肠杆菌菌种接种到灭菌后的液体 培养基中,使其在37℃摇床培养12小时。
注意事项: 1.火焰旁从斜面上用接种环取菌; 2.取菌前接种环要用酒精灯灼烧 灭菌,冷却后方能取菌; 3.取菌后封口膜和棉塞复原.
（四）大肠杆菌的划线分离
分离方法:划线分离法和涂布分离法
固体培养基：菌落
☆ 菌落
单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖 时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体，叫做菌落。
菌落是鉴定菌种的重要依据。
液体培养基：
表面生长
均匀混浊生长
沉淀生长
(三)无菌技术
1、获得纯净培养物的关键: 防止外来杂菌的入侵
2、无菌技术 的四个方面(参看教材20页)