基因工程中常用的酶

(三) 在基因操作中的应用
(1)缺口平移(nick translation),制备探针； (2)填补由限制酶产生的3`凹缺末端； (3)DNA片断的末端标记(用[32P]dNTP填补末端)； (4)用Klenow酶消解由限制酶产生的3`凸出末端；
DnaseI DNA polI
5` 5`
klenow
四 .末端转移酶(terminal transferase)
取自小牛胸腺,催化脱氧核苷酸与DNA的 3`-OH结合 模板/引物或底物是带有3`-OH基的ssDNA或 带有突出的双链DNA。不要求模板。 Mn2+ 或Mg2+ ssDNAOH+ndNTP DNA-(pdN)n+nppi Co2+ dsDNAOH+ndNTP DNA- (pdN)n+nppi
四.同裂酶(isoschizomers): 切割同一靶序列而来源不同的酶。 Mbo I :↓ GATC GATC CTAG ↑ CTAG Bam HI : G ↓ GATCC CCTAG ↑ G G CCTAG GATCC G
第二节 分子克隆中常用的酶
一.连接酶 (DNA ligase) 在E.coli和动植物细胞中都有此酶。能催化DNA 中相邻的3`-OH和5`-P之间形成磷酸二脂键。
二.甲基化酶(methylase)
可使DNA甲基化。有两种： dam 甲基化酶和dcm甲基化酶 N6A甲基化 5`－GmATC－3` C5C甲基化 CmCAGG 或 CmCTGG 用途：保护待克隆的片断。 例如构建真核DNA文库时用E.coli甲基化酶修 饰DNA片断中的EcoRI酶切位点，然后将修饰 的片断与人工EcoRI接头连接，接头用EcoRI 切割后，将DNA片断插入噬菌体DNA中。
Ca2+
用途： 1.切除dsDNA的末端核苷酸，使DNA的分子变 小，在T4连接酶的作用下连接接头和载体。 2.绘制DNA的限制图谱。 Bal31与限制性内切酶协同作用可绘制物 理图谱.还可逐步缩短DNA片断，使之适合构 建嵌合质粒。Bal31de 内切酶活性已用于检测 致癌剂与突变剂引起的DNA双链损伤
第二章 基因工程中常用的酶
第一节 限制性核酸内切酶 (Restriction enzyme) 一. 限制与修饰: 1962年 Arber, W(瑞士).等 提出限制与修饰假说。 1968 Arber 等发现Ⅰ型限制性酶。 1968 Smith和Wilcox K.W.发现了Ⅱ类限制性酶 并阐明其性质。 1971 Nathans等首次制作酶切图谱。 因他们发现了限制性酶并应用于分子遗传学而获1978年 度诺贝尔生理学和医学奖。
用途： (1)在载体和cDNA上加互补的同聚物接头 (Homopolymeric tail)
AAAAA
AAAAA TTTTT
TTTTT
(2) 用32P进行3`端同位素标记
五.逆转录酶 (reverse transcriptase)
以RNA为模板的DNA聚合酶，来源于鼠和禽 类的反转录病毒。由两条肽链组成，其中一 条具有5`→3`聚合酶和5` →3` 外切酶活性。 用途： (1)合成双链cDNA,作为插入载体的目的基因； (2)以ssDNA或RNA为模板合成杂交探针。
八.核酸外切酶Ⅲ (Exonuclease Ⅲ)
活性： (1) 3`外切酶；
Mg2+
(2)3`磷酸酶,内切酶和 RNase H 活性 用途： (1)制备DNA聚合酶的模板； (2)制备特异性探针。
Exo Ⅲ
R酶切位点
DNA pol
[32P] dNTP
限制性酶 (3)从DNA末端内切
S1酶
识别位点
剪切位点
MS
R
75kD
108kD
Ⅲ 型酶有两个亚基：MS 亚基在靶位点负责识别 和甲基化； R 亚基在其邻接位点起限制作用
基因工程中最常用的是Ⅱ型酶 三. Ⅱ型酶的命名,书写与剪切方式：
限制酶 来源 剪切方式 Eco R I Escherichia coli RY 13 G↓AATTC Pst I Providencia stuartii 164 CTGCA↓G BseⅡ Bacilus stearothermophilus strain 822 (HpaⅠ) GTT↓AAC
三.DNA聚合酶I(DNA lolymerase I )
DNA pol I 单链多肽，MW＝109kD,可被枯草杆 菌蛋白酶切成两段；C-端大片断(Klenow 酶)， MW＝76kD,具5`→3`聚合酶和3`→ 5`外切酶活 性，N-端小片断MW＝36kD,具5`→3`外切酶活 性。 (一)聚合酶活性： Mg2+ DNA ＋ndNTP DNA－(pdN)n+nPPi 5` CCGOH Mg2+ 5` CCGATACC 3`GGCTATGG 3`GGCTATGG
用途： (1)分析RNA· DNA杂合结构； (2)除去DNA的单链末端，生成平端； (3)切断双链DNA 的发夹结构。
七.核酸酶 Bal 31
具两种活性： (1)双链特异外切酶活性；从dsDNA的3`和5`切除 寡核苷酸或单核苷酸；EGTA(乙二胺四乙酸) 可终止反应 (2)单链特异内切酶活性：专门从单链DNA切除带 有5`末端的单链核苷酸和寡核苷酸(类似于核 酸酶S1的单链特异性核酸内切酶活性) Ca2+ Ca2+
(二)外切酶活性 (2) 5`→3`外切酶活性: 切补作用 从游离的5`端降解DNA，对DNA双链部分 的磷酸二脂键有切除功能，每次切10nt 5` CGCATCT Mg2+ 5` CATCT 3`GCGCGTAGA 3`GCGCGTAGA (3) 3`→ 5`外切酶活性: 校对作用 从游离的5`端降解dsDNA和ssDNA 5`CGCATCT Mg2+ 5`CGC 3`GCG 3`GCG
随机引物 5’ ssDNA 单链模板 寡核苷酸引物 RNA RNase H 被放线菌素 D 所抑制 3` 第二个随机引物 5` 第二条链的自发合成
六. 核酸酶S1(nuclease S1)
从米曲霉(Aspergillus oryzae)中提纯得到的一 种金属蛋白，是单链特异性核酸酶。 ssDNA or ssRNA pH4.5 Zn2+ 5`pdN 5`prN 中等量的酶会在缺口或 small gaps切断dsDNA pH4.5 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱn2+
1962 , Arber, 1968 Smith 发现限制性酶
W. Arber (1929 –) Biozentrum der Universität Basel, Switzerland
H. O. Smith (1931 －) Johns Hopkins University School of Medicine,USA
B 5’ P B OH P P P ATP PPi P P P OH P P NAD B B T4 ligase NMN B B B B B E.coli ligase 3’ P P P B B B
连接酶的功能： (1)能封闭DNA双链或RNA/DNA杂种双链中的单 链缺口，而不能封闭双链RNA中的单链缺口 (2)能封闭粘性末端退火后出现的缺口； 用途： (1)通过粘端连接DNA分子； (2)连接平端双链DNA分子或平端DNA与人工接 头的连接。
二.限制性内切酶的类型
限制性酶的类别与活性
蛋白结构 识别位点 剪切位点 限制与甲 基化 Ⅱ型酶 内切酶亚基和甲基 化酶亚基分开 4～6bp 序列 常为回文 在限制位点 活性分开 Ⅲ型酶 2 亚基的双功 能酶 5～7bp 不对称序列 限制位点上游 24～26bp 处 同时存在 Ⅰ型酶 3 亚基的双功能酶 两侧对称或不对称 离限制位点 >1000 bp 的非特异位点 互相排斥