大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定_段超
大鼠血管平滑肌细胞的培养
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平滑肌细胞传代
传代时间：大部分组织块长出细胞晕， 并与相邻细胞晕相接触时就可以传代
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传代步骤：
倒掉培养瓶中的培养液
用D-Hank’s液洗两遍
加2-3滴0.25%胰蛋白酶消化液，平 放培养瓶，在倒置纤微镜下观察细胞 消化情况，可见到细胞质回缩，细胞 间隙增大时迅速翻转培养瓶，使细胞 脱离消化液
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青霉素、链霉素液配制
青霉素80万U加Hank’s液至80 mL，终 浓度1万u/ mL
链霉素100万U（相当于1g）加Hank’s 液至100 mL，终浓度10mg/mL
分装后至-20℃冰箱保存。
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DMEM培养液
900 mL ddH2O于1000 mL容器中，将 DMEM粉1包倒入容器中，盛粉袋用50 mL ddH2O分次冲洗，也倒入容器，磁 力搅拌溶解。
需要相关的实验室仪器设备、生物试剂、医 疗器械、制药设备、医药原料、体外诊断试 剂及耗材与技术服务信息的，可以访问探生 网biomean进行咨询，期待您的加入
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细胞培养方法
1. 组织块培养法 2. 消化培养法 3. 器官培养法
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将组织剪成小块后接种于培养瓶 特点：简便易行、成功率较高。
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“无菌”
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细胞培养实验室
1. 无菌操作区（无菌操作室、 超净台） 2. 孵育区 3. 制备区 4. 储藏区 5. 清洗和消毒灭菌区
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培养试剂的配制
Hank’s液
GK大鼠主动脉平滑肌细胞培养及鉴定
严重并发症是限制其应用的重要原 因。ＭＲ Ｃ Ｐ 能比Ｅ Ｒ Ｃ Ｐ提供更具 价值 的三维 图形 ， 胆管 阻塞的形态也能清晰 显示 ， 其定 位准确 ， 但是 对于细微结构 、 狭窄病变等方面的鉴别 比不上 Ｐ Ｔ Ｃ 、 Ｅ Ｒ Ｃ Ｐ 。 本次试验中 ， ５种检测手段对 于阻塞性黄疸 的检 出率 、 梗阻定位 准确率 无显著性差异 ， 胆 管癌的检出率 ： Ｃ Ｔ的检 出率最低 （ ４ ７ ． １ ％） ， Ｅ Ｒ Ｃ Ｐ的检 出率 最 高 （ ９ ４ ． ７ ％） ；胆 管 癌 定位 准 确率 ：超 声最 低 （ ７ ８ ． ４ ％） ， Ｍ Ｒ Ｃ Ｐ最高 （ ９ ４ ． ７ ％） ， 周围淋 巴结 转移检出情况 ： Ｃ Ｔ和超 声最低 （ １ ４ ． ３ ％） ， ＭＲＣ Ｐ最高（ ４ ２ ． ９ ％） 。 综上所述 ： 各项影像学检测方法各有优势和局限 ， 应用时综合各 因素 、 结合使用 ， 可提高检ｍ率 。
摄片 。
例行 Ｐ Ｔ Ｃ ， １ ９ 例行 Ｅ Ｒ Ｃ Ｐ ， ２ １ 例行 Ｍ Ｒ Ｃ Ｐ 。详细记录肝总管 、 肝 内胆 管、 胆 总管 、 胆囊 、 胰管 等情况 ， 以病理 和手术诊 断结 果为依据 ， 判断 上述 ５ 种影像学检测手段 的检 出率和准确率情况 。 １ ． ２ ． １ 超声 彩色多普勒诊 断仪 ： Ｐ ｈ ｉ ｌ ｉ ｐ ｓ Ｉ Ｕ ２ ２ ，线阵探头 ，探头频率 ３ ． ５ ～ ５ Ｍ Ｈ ｚ ， 患 者空腹 ８ ｈ以上 ， 取 仰卧位 、 侧卧位 、 坐位 进行 常规扫 查， 必要 时加压扫查或采用饮水法 。 １ ． ２ ． ２ Ｃ Ｔ 西门子双排螺旋 Ｃ Ｔ ， 患者空腹 ６ ～ ８ ｈ ， 取仰 卧位 ， 检查前饮 用大量清水 ， 先 做层 厚和间隔均为 １ ０ ａ ｒ ｍ 的常规平 扫 ， 对于病变 部 位可加做 ３ ａｍ的薄层扫描。 ｒ １ ． ２ ． ３ ｃ 取 仰卧 位 ， 患者 双 手抬 起抱 头 ， 确认 穿 刺靶 点 ， 局 麻 后， 于右腋 中线第 ８或第 ９肋 间隙水平 进针 ， 针 尖进至 １ ２胸椎 上 脊柱 右侧 ４ ｃ ｍ处 ， 回抽 胆 汁退 针 ， 推注 ３ ０ ｍ ｌ ２ ５ ％胆 影葡 胺 ， 定 位
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。
方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。
结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。
结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。
【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞[Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed bymodified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis.[Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化(atherosclerosis)密切相关[1~4]。
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定_段超
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定段超 陈鑫 邱志兵 许欢 【摘要】 目的 探讨大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养方法,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。
方法 采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测。
结果 85%的组织块接种存活,原代培养后2周左右即可传代,至少可以传8代以上,并且细胞形态、生长特点不发生明显的改变,6代的血管平滑肌细胞纯度达97%以上。
台盼蓝染色约有94%以上的细胞为活细胞。
镜下培养的血管平滑肌细胞呈典型的“谷峰状”生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达。
结论 正确地利用组织贴块法可以简单、经济、高效地培养出血管平滑肌细胞,为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。
【关键词】 大鼠;血管平滑肌细胞;原代培养;组织贴块法P r i m a r y c u l t u r e a n di d e n t i f i c a t i o no f r a t t h o r a c i ca o r t av a s c u l a rs m o o t hmu s c l ec e l l s D U A NC h a o ,C H E N X i n ,Q I UZ h i -b i n g ,X UH u a n . D e p a r t m e n t o f C a r d i o t h o r a c i c S u r g e r y ,N a n j i n g F i r s t H o s p i t a l A f f i l i a t e dt oN a n j i n gM e d i c a l U -n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210006,C h i n a【A b s t r a c t 】 O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h e p r i m a r y c u l t u r e m e t h o d o f r a t t h o r a c i c a o r t a v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s (V S M C s ),t o a n a l y z ec e l l g r o w t h a n d b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n dt o p r o v i d e t e s t m a t e r i a l f o r t h e r e s e a r c ho f t h ep r o l i f e r a t i o n o f t h e v a s c u l a r d i s e a s e s .Me t h o d s T h e c u l t u r eo f r a t t h o r a c i c a o r t av a s c u l a r s m o o t h m u c l ec e l l s w a s d o n eb yt i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n .T h e c u l t u r e dc e l l s w e r e o b -s e r v e d a n d i d e n t i f i e d b y m o r p h o l o g y a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w i t hp h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p ea n di m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g r e s p e c -t i v e l y .T h e c e l l v i a b i l i t y w a s d e t e r m i n e dw i t h T y p a nb l u e .R e s u l t s 85%i n o c u l a t e d t i s s u e p i e c e s s u r v i v e d .P r i m a r y c u l t u r e d c e l l s c o u l d b e s u b c u l t u r e da f t e r 2w e e k s a n d s u c c e s s f u l l y p a s s a g e df o r m o r e t h a n 8t i m e s ,w i t h o u t n o t i c e a b l e c h a n g e s i nm o r p h o l o g y a n dg r o w t h c h a r a c t e r -i s t i c s .T h e p u r i t y o f t h e s i x t hp a s s a g e V S M C s w a sm o r et h a n 97%.T h ec e l l v i a b i l i t yw a s m o r et h a n 94%b yt r y p a nb l u e .T h ec u l t u r e d V S M C s s h o w e dt h e t y p i c a l “p e a ka n dv a l l e y ”m o r p h o l o g i c a l a p p e a r a n c e u n d e r m i c r o s c o p e .I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n gw i t ha n t i b o d y a -g a i n s t S M -α-a c t i n d e m o n s t r a t e d t h e s e c e l l s w e r e p o s i t i v e .C o n c l u s i o n T h e m e t h o d o f t i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n c u l t u r e o f V S M C s i s s i m p l e ,e c o n o m i c a n de f f i c i e n t .I t p r o v i d e s a ni d e a l c e l l m o d e l f o r t h e r e s e a r c ho f t h e p r o l i f e r a t i o no f v a s c u l a r d i s e a s e s .【K e yw o r d s 】 r a t ;v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l ;p r i m a r yc u l t u r e ;t i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n作者单位:210006 江苏南京,南京医科大学附属南京第一医院心胸外科 血管平滑肌细胞(v a s c u l a r s m o o t hm u s c l ec e l l s ,V S M C s )的增殖和迁移是血管增殖性疾病发病的核心环节,其病理学分子机制是近年来血管增殖性疾病的研究热点,也是目前防治的难点[1]。
大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定-最新年精选文档
[1] 。
大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定血管平滑肌细胞（VSMC 的异常增殖是许多心血管疾病的共同病理基础， 在高血压、 动脉粥样硬化和血管成形术后再狭窄等 许多血管性疾病中，都涉及到血管平滑肌细胞的异常增殖 血管由 3 个部分组成，自内向外依次是内膜层、 中膜层和外膜层，内膜层主要由血管内皮细胞和少量的平滑肌细胞组成， 外膜层由要收缩调节机体的血流和血压， 其功能障碍在心血管疾病中起着 非常重要的作用， 因此， 对血管平滑肌细胞的生物学特性进行深 入研究，才能探明上述血管疾病的发病机制。
在VSMC 勺研究中， 组织块贴壁法培养 VSM （和胶原酶消化法是目前采用的非常广泛的技术。
本实验采用组织块贴壁法进行大鼠胸主动脉平滑肌细胞 的培养，并采用平滑肌细胞的3种标记分子（SMASM22Calponin ） 进行免疫细胞化学鉴定。
1 材料与方法成纤维细胞组成， 中膜层由血管平滑肌细胞组成， 平滑肌细胞主1.1 材料。
动物来源：健康 Wistar 大鼠，由第三军大学实验动物中心提供，雌雄不限，体重180 〜200g 。
DM EMS 糖培养 基 （美国 Gibco 公司） ， Hepes 索莱宝） ， 优质胎牛血清 （原 代培养浓度 20%，传代培养浓度 10%，美国 Hyclone ），胰蛋白酶，鼠单抗肌动蛋白 SMA 、SM22、Calponin 北京博奥森生物），DAB 显色试剂盒，通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物技术XX公司）其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法1.2.1 取材：断颈法处死Wistar 大鼠，消毒胸腹部，大组织剪、组织镊剪开胸腹部皮肤，更换器械，切开胸腹部，并切除部分胸壁以利于暴露胸主动脉，用眼科弯镊和眼科剪分离胸腹主动脉并放入盛有无菌PBS的细胞培养皿中。
转入超净工作台上，眼科直镊和弯镊清除结缔组织和血块，剥除动脉外膜。
放入另一盛有PBS的细胞培养皿中，减去血管外的细小分支，并放入含10%台牛血清的DMEI中，眼科直剪纵向剖开血管腔，用眼科弯镊轻轻刮除内膜面，以去除内皮细胞，放入另一含10%台牛血清的DMEM中，用眼科弯剪反复剪切成1mm*1m大小的组织块。
大鼠血管平滑肌细胞的原代培养及鉴定
１ ． １ 材料 。动物来源 ｔ 健康 Ｗｉ ｓ ｔ ａ ｒ 大鼠 ， 由第三 军大学实 验动物 中心 提供 。 雌 苏后 任 能 旺 盛 生 长 。 雄不 限， 体重 １ ８ ０ ～２ ０ ０ ｇ 。Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ 高糖 培养基 （ 美国Ｇ ｉ ｂ ｃ ｏ公司） ， Ｈｅ ｐ ｅ ｓ （ 索莱 ３ 讨 论 宝） ，优质胎牛血清（ 原代 培养浓 度 ２ ０ ， 传代 培养浓度 １ ｏ ， 美国 Ｈ ｙ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ） ， 胰蛋 血 管 平 滑 肌 细 胞 异 常 增 殖 和 迁 移 是 所 有 损 伤 性 血 管 疾 病 的共 同 病 理 生 理 学 改 血管损伤后狭窄严重 制约 了这些疾病 的远期疗 白酶 ， 鼠单 抗肌动蛋白 ｓ ＭＡ、 Ｓ Ｍ２ ２ 、 Ｃ ａ ｌ ｐ ｏ ｎ ｉ ｎ （ 北京博奥 森生物） ， Ｄ Ａ Ｂ显色试 剂盒 ， 变 ，由其造成 的动脉 粥样 硬化形 成、 ５ ］ 。因此 ． 研 究 防 治 ＶＳ Ｍ Ｃ异 常 增 殖 在 细 胞 和 分 子 生 物 通用型免疫组化检测试 剂盒 （ 北京 中杉金桥 生物技术有 限公司） 其余 试剂均 为 国产 效 ，威 协 患 者 的 生 命 安 全 ［ 学 中 的变 化 成 为 血 管 生 物 学 领 域 研 究 的 热 点 ［ ６ ， ７ ｌ 。体外大 鼠胸主动脉 平滑肌细胞 分析纯 。
２ ０ １刚 嘲蘼
大 鼠血 管 平 滑 肌 细 胞 的 原 代 培 养 及 鉴 定
曾 羽 熊 伟 （ 贵 州 遵义 医学 院 贵州 遵义 ５ ６ ３ ０ ０ ３ ）
【 摘要】 目的 ： 探 讨 大 鼠胸 主 动脉 平 滑肌 细胞 原代 培养 的 方 法 ， 观 察 其 生长 特 性 ， 为 相 关 研 究提 供 实 验 材 料 。 方 法 ： 组 织 块 贴 壁 法 培 养 大 鼠血 管 平 滑 肌 细 胞 ， 胰 酶 消 化 法进 行 传 代 ， 倒置显微镜观察细胞 生长特点， 用 平 滑 肌 细 胞 的 ３种 标 记 分 子 （ Ｓ ＭＡ、 Ｓ Ｍ２ ２ 、 Ｃ ａ ｌ ｐ ｏ ｎ ｉ ｎ ） 免 疫 细 胞 化 学 法 鉴定 细胞 的 纯度 ， 掌 握 细 胞 的冻 存 与复 苏 。结 果 ： 织 块 接 种 于培 养 瓶 内 ４ — ６天 即可 见 数 个 细 胞 以垂 直 方 向 从 组 织 块 边 缘 游 出 ，培 养 至 ２周 游 出 细 胞 逐 渐 向组 织 块 周 围生 长 形 成 细 胞 晕 ，进 而 形 成 细 胞 簇 ， 镜 下 可 见 细 胞 呈 典 型 的“ 蜂” “ 谷” 样 生长， 免 疫 细 胞 化 学 显 示平 滑 肌 细 胞 的 ３种标 记 分 子 均 为 阳 性 表 达 。 结 论 ： 组 织块 贴 壁 法 简 便 、 经济 ， 培 养 的 平 滑 肌 细 胞 数 量 多、 生 长 状 态 良好 ， 为 研 究 心 血 管 疾 病 提 供 良好 的体 外模 型 。 【 关键 词】 大鼠－ 血管平滑肌细胞 ； 原代培养； 冻存 ； 复 苏 【 中 圈 分 类 号】 Ｒ３ ２ ９ 【 文献标识码Ｉ Ａ
组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定
结论 组织块贴壁法培养 大鼠平滑肌细胞操作 简单、 结果稳定、 纯度较 高、 存活率高。
关键词 ： 平滑肌 细பைடு நூலகம் ； 织块贴壁法； 组 原代 培养 中图分类号 ： ４ １ Ｃ ． ＿ ３ ￣２ 文献标识码 ： Ｂ 文章编号 ：６ ｌ １４ （ ００）３－ ９ — ２ １ ７一 ２６ ２ １ ０ － ０ ７ ０ ０
清均购 自 Ｈ Ｃｏｅ 司。小 鼠抗大 鼠 Ｓ ａｔ 单克隆抗体 、 ｙ ｌｎ 公 Ｍ— ｃ ｎ ｉ 即
滑肌细胞生长、 增殖有关 的疾病发病机理及药物作用机制 的研
究 ， 动脉 粥样硬化 、 如 经皮 腔 内血 管成 形术 （ Ｔ Ａ） Ｐ Ｃ 术后 再狭 窄、 药物的钙通道开放（ 拮抗 ） 作用 、 血管损伤 引起 钙稳态失衡
在病原生物学实验中接触到的大多是致病菌或条件5开展与生活和人体健康相关的实验致病菌有感染人体的危险故要求学生在实验过程中除按规在课外时间引导学生做一些病原生物学与生活和人体健范严格操作外还要在实验前后用消毒液洗手实验室内不乱康相关的实验增强学生对实验的兴趣
组织块贴壁法培养大鼠主动脉平滑肌细胞及鉴定
用型 Ｓ Ｂ Ａ Ｃ免疫组化染色试剂盒 、 Ａ Ｄ Ｂ显色试剂盒均购 自武汉
博士德生物工程有限公 司（ 中国） 。青霉素钠 、 硫酸链霉素（ 华北
制 药 厂 ）２ ，４孔 板 ，０ ｍｘ ０ １ｍ ｌｍｍ 盖 玻 片 ，５ ｍ 塑 料 培 养 瓶 ２ｃ ２
等。本研究在参照国内外经验ＩＩ １的基础上 ， 建立了一种简便、 易
我校注重学生技 能的培养 ， 在病原生物学考核 中 ， 大了 加
大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定
大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德【摘要】目的：建立一种可行的原代血管平滑肌细胞（VSMC）培养方法。
方法：严格无菌操作环境下取大鼠胸主动脉及腹主动脉中层组织，通过组织块贴壁法进行原代培养，胰酶消化法进行传代，应用倒置相差显微镜对不同培养时间的细胞进行形态学观察，使用免疫荧光法对培养细胞进行鉴定。
结果：原代培养第4~6天时，组织块周围开始有长梭形细胞爬出；第7~9天时，细胞爬出较少的呈网状生长，组织块周围细胞爬出较多的呈漩涡状生长，致密排列呈束状；第10~14天时，细胞呈典型的“峰—谷”样结构，相互融合达80%，此时传代细胞生长速度增快，细胞变大，折光性减弱，免疫荧光染色鉴定可见VSMC特异性的α-平滑肌肌动蛋白（α-SM-actin）表达，表达的阳性细胞在95%以上。
结论：成功建立一种可行的原代VSMC培养方法。
%Objective:To establish a convenient and efficient method for culturing primary generation of aortic vascular smooth muscle cells( VSMC)of rat. Methods:The aorta was isolated from SD rats under strict sterile conditions. The primary culture and subculture were obtained by tissue-piece inocu-lation and trypsin respectively. The cellular morphology was observed with inverted phase contrast mi-croscope and identified by immunofluorescence. Results:The VSMC grew out on days 4~6 and showed fusiform;On days 7~9,some cells grew to form mesh,and more cells grew in whorled pattern and form compact sarciniform;On days 10~14,cells appeared typical ″peak-valley″ structure,and became nearly 80% integrated. At this time,passage cells grew faster,and cells becamelarger,and their refractivity weakened. The typical α-Smooth muscleactin(α-SM-actin)in SMCS could be found by immunofluorescent staining,and the positive rate of α-SM-actin in SMCS was more than 95%. Conclusion:A reliable and feasible culture method for primary generationof VSMC has been estab-lished successfully.【期刊名称】《贵阳医学院学报》【年(卷),期】2017(042)002【总页数】5页(P125-129)【关键词】血管平滑肌细胞;原代培养;组织块贴壁法;免疫荧光;大鼠,Sprague-Dawley【作者】刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德【作者单位】贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002;贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002;贵州医科大学附属人民医院，贵州贵阳 550002; 贵州省人民医院心内科，贵州贵阳 550002;贵州医科大学，贵州贵阳 550004【正文语种】中文【中图分类】R363.1目前，心血管疾病已成为我国城乡居民总死亡原因之首，这类疾病发病的病理生理基础为血管损伤及损伤后的修复不良，主要有冠心病和高血压，但其发病机制至今仍不清楚[1]。
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大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定段超 陈鑫 邱志兵 许欢 【摘要】 目的 探讨大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养方法,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。
方法 采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测。
结果 85%的组织块接种存活,原代培养后2周左右即可传代,至少可以传8代以上,并且细胞形态、生长特点不发生明显的改变,6代的血管平滑肌细胞纯度达97%以上。
台盼蓝染色约有94%以上的细胞为活细胞。
镜下培养的血管平滑肌细胞呈典型的“谷峰状”生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达。
结论 正确地利用组织贴块法可以简单、经济、高效地培养出血管平滑肌细胞,为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。
【关键词】 大鼠;血管平滑肌细胞;原代培养;组织贴块法P r i m a r y c u l t u r e a n di d e n t i f i c a t i o no f r a t t h o r a c i ca o r t av a s c u l a rs m o o t hmu s c l ec e l l s D U A NC h a o ,C H E N X i n ,Q I UZ h i -b i n g ,X UH u a n . D e p a r t m e n t o f C a r d i o t h o r a c i c S u r g e r y ,N a n j i n g F i r s t H o s p i t a l A f f i l i a t e dt oN a n j i n gM e d i c a l U -n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210006,C h i n a【A b s t r a c t 】 O b j e c t i v e T oi n v e s t i g a t et h e p r i m a r y c u l t u r e m e t h o d o f r a t t h o r a c i c a o r t a v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l s (V S M C s ),t o a n a l y z ec e l l g r o w t h a n d b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n dt o p r o v i d e t e s t m a t e r i a l f o r t h e r e s e a r c ho f t h ep r o l i f e r a t i o n o f t h e v a s c u l a r d i s e a s e s .Me t h o d s T h e c u l t u r eo f r a t t h o r a c i c a o r t av a s c u l a r s m o o t h m u c l ec e l l s w a s d o n eb yt i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n .T h e c u l t u r e dc e l l s w e r e o b -s e r v e d a n d i d e n t i f i e d b y m o r p h o l o g y a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y w i t hp h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p ea n di m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g r e s p e c -t i v e l y .T h e c e l l v i a b i l i t y w a s d e t e r m i n e dw i t h T y p a nb l u e .R e s u l t s 85%i n o c u l a t e d t i s s u e p i e c e s s u r v i v e d .P r i m a r y c u l t u r e d c e l l s c o u l d b e s u b c u l t u r e da f t e r 2w e e k s a n d s u c c e s s f u l l y p a s s a g e df o r m o r e t h a n 8t i m e s ,w i t h o u t n o t i c e a b l e c h a n g e s i nm o r p h o l o g y a n dg r o w t h c h a r a c t e r -i s t i c s .T h e p u r i t y o f t h e s i x t hp a s s a g e V S M C s w a sm o r et h a n 97%.T h ec e l l v i a b i l i t yw a s m o r et h a n 94%b yt r y p a nb l u e .T h ec u l t u r e d V S M C s s h o w e dt h e t y p i c a l “p e a ka n dv a l l e y ”m o r p h o l o g i c a l a p p e a r a n c e u n d e r m i c r o s c o p e .I m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n gw i t ha n t i b o d y a -g a i n s t S M -α-a c t i n d e m o n s t r a t e d t h e s e c e l l s w e r e p o s i t i v e .C o n c l u s i o n T h e m e t h o d o f t i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n c u l t u r e o f V S M C s i s s i m p l e ,e c o n o m i c a n de f f i c i e n t .I t p r o v i d e s a ni d e a l c e l l m o d e l f o r t h e r e s e a r c ho f t h e p r o l i f e r a t i o no f v a s c u l a r d i s e a s e s .【K e yw o r d s 】 r a t ;v a s c u l a r s m o o t hm u s c l e c e l l ;p r i m a r yc u l t u r e ;t i s s u e -p i e c e i n o c u l a t i o n作者单位:210006 江苏南京,南京医科大学附属南京第一医院心胸外科 血管平滑肌细胞(v a s c u l a r s m o o t hm u s c l ec e l l s ,V S M C s )的增殖和迁移是血管增殖性疾病发病的核心环节,其病理学分子机制是近年来血管增殖性疾病的研究热点,也是目前防治的难点[1]。
而要获得试验研究所需的血管平滑肌细胞就必须掌握一种简单、经济、高效的血管平滑肌细胞培养方法。
本文作者运用组织贴块法进行大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定,并应用多种方法对传代细胞进行纯化,成功地获得了大量纯度较高、生长状态良好的血管平滑肌细胞。
材料与方法一、材料150～250g 雄性S D 大鼠,购自南京医科大学试验动物中心。
P B S 缓冲液(凯基生物),胎牛血清(海克隆生物),D M E M 培养液/高糖(赛默飞世尔生物),青链霉素混合液(凯基生物),胰蛋白酶-E D T A 消化液(凯基生物),兔抗鼠平滑肌α肌动蛋白单克隆抗体(北京博奥森生物),S P 免疫组化试剂盒(福州迈新生物),D A B 显色试剂盒(凯基生物)。
二、细胞培养大鼠2～3只,颈椎脱臼致死,75%乙醇浸泡消毒3m i n ,固定后依次剪开胸腹部皮肤,肌肉及胸骨,暴露胸腔,紧靠脊柱右前方,从主动脉弓至膈面处剪下胸主动脉,并放入盛有P B S 缓冲液的细胞培养皿中,迅速转入细胞培养室的超净工作台。
眼科直镊和弯镊去除血凝块和血管外膜层,然后转移入另一盛有P B S 缓冲液的细胞培养皿中,剪去血管外的小分支。
再转移入含20%胎牛血清和D M E M 混合液的细胞培养皿中,眼科直剪剪开血管腔,内膜面向上,以眼科弯镊或手术刀片轻轻擦拭内膜层,以去除内皮细胞。
最后转移入另一含20%胎牛血清和D M E M 混合液的细胞培养皿中,用眼科剪将血管段剪成1m m×1m m 大小的组织块,用吸管把组织块转入25m l 细胞培养瓶中,并均匀贴壁于培养瓶底面,组织块的间距为0.5c m 。
盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上,并向瓶内注入适量20%胎牛血清和D M E M 混合液以及相应比例的青链霉素混合液,置于37℃,5%C O 2培养箱内放置3～5h ,使得组织块干涸,并与瓶底贴附,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置3天,切勿移动,4～5天会有细胞从组织块周围游离出(见图1),即可换液。
7天左右大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞晕相接触,2周左右组织块周围长出的细胞相互汇合(见图2,3),逐渐铺满整个瓶底时,就可以进行首次传代:弃去瓶中原有培养液,用P B S 缓冲液清洗细胞表面2次,弃去P B S 缓冲液,加入胰蛋白酶-E D T A 消化液4～6滴,使消化液铺满瓶底,入37℃,5%C O 2培养箱中消化2～3m i n 左右,倒置相差显微镜下见细胞收缩变圆、细胞间隙增大(见图4,5,6)时,立即弃去胰酶消化液,用P B S 缓冲液清洗1次,弃去P B S 缓冲液,加入468临床肺科杂志 2010年4月 第15卷第4期20%胎牛血清和D M E M 混合液,用吸管反复抽吸吹打瓶底,使细胞脱壁悬浮(见图7),成为细胞悬液。