小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良解读
敲除Wdr1抑制小鼠原代血管平滑肌细胞的迁移和增殖
敲除Wdr1抑制小鼠原代血管平滑肌细胞的迁移和增殖袁白银;胡继盛;刘钟颖;黄霞【摘要】细胞骨架肌动蛋白在细胞增殖、迁移等生物学过程中发挥重要作用,然而WDR1 作为肌动蛋白解聚的主要辅助因子,其在平滑肌细胞中的作用尚无报道.构建Wdr1 条件性诱导敲除小鼠模型,进而分离小鼠原代主动脉平滑肌细胞,诱导敲除Wdr1,检测平滑肌细胞的形态、增殖和迁移情况.PCR 结果显示,Wdr1f/f;ERT2Cre 小鼠模型构建成功.免疫荧光结果表明:在前人基础上改进的分离方法能够高效分离原代平滑肌细胞.细胞形态观察结果显示:Wdr1 敲除后对细胞的形态有显著性影响.同时,划痕实验以及 CCK8 检测结果也表明:Wdr1 的条件性诱导性敲除可明显抑制平滑肌细胞的迁移和增殖.Wdr1 敲除后平滑肌细胞的形态以及细胞生物学过程的改变提示其与血管疾病的发生和发展有紧密联系,这对揭示血管病理生理过程有重要意义.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)012【总页数】7页(P179-185)【关键词】条件性诱导敲除小鼠;WDR1;平滑肌细胞;增殖;迁移【作者】袁白银;胡继盛;刘钟颖;黄霞【作者单位】武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065;武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065;武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065;武汉科技大学生命科学与健康学院,武汉 430065【正文语种】中文尽管心血管疾病的预防、诊断和治疗方面取得了重大进展，但其仍为全球范围内主要的死亡原因［1］。
动脉粥样硬化是动脉粥样斑块积聚引起的以动脉管腔狭窄为主要特征的一类疾病，是大多数心血管疾病的表现并可导致心肌梗塞或中风［2］。
平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells，VSMC）构成了血管的主要细胞组成，也是血管病理过程的重要参与者，在动脉粥样硬化过程中伴随着平滑肌细胞的增殖、迁移等过程，且平滑肌细胞和巨噬细胞会吞噬脂质进而变成泡沫细胞［3］。
小鼠血管平滑肌细胞原代培养及体外钙化模型的制备
小鼠血管平滑肌细胞原代培养及体外钙化模型的制备徐丽华;严金川;伍超;逯朝阳;王中群;袁伟【摘要】目的:建立一种简单、高效的小鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)原代培养方法及体外钙化模型.方法:采用改良的组织贴块法培养小鼠VSMCs,经免疫荧光染色法鉴定后,将细胞随机分为对照组和钙化组.采用yon kossa染色及比色法检测两组细胞内钙含量.结果:培养3～5d时,可见细胞从组织块边缘爬出,7～10d后细胞融合成片;免疫荧光染色显示胞质表达特异性α-肌动蛋白;VSMCs培养至第2代细胞纯度达95％;与对照组相比,钙化组细胞的钙含量、碱性磷酸酶(ALP)活性明显增加(P均＜0.05).结论:改良的组织贴块法可获得高纯度的小鼠VSMCs;β-甘油磷酸钠在体外可有效诱导其钙化.%Objective:To establish a simple and efficient method for primary culture of mouse aortic vascular smooth muscle cells (VSMCs) and calcification model in vitro.Methods:The primary VSMCs were harvested by modified tissue-piece inoculation and identified by immunocytochemistry.The established VSMCs were randomly divided into control group and calcification group.Calcification of cells was assayed by von kossa staining and colorimetry method.Results:VSMCs migrated from explants of mouse aorta tissue after 3-5 days of culture.After 7-10 days,VSMCs grew to form a fusing monolayer.Immunofluorescence staining with specific mAb against mouse α-actin demonstrated VSMCs were positive.The cell purity of the 2nd generation of VSMCs was over 95％.Compared with the control group,the calcium content and ALP activity in the calcification group were increased significantly (both P ＜0.05).Conclusion:The method of modified explant-culture successfully established a effective model for primary culture of VSMCs,of which calcification in vitro could be induced by β-glycerophosphate.【期刊名称】《江苏大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(024)002【总页数】4页(P110-113)【关键词】血管平滑肌细胞;原代培养;钙化【作者】徐丽华;严金川;伍超;逯朝阳;王中群;袁伟【作者单位】江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001;江苏大学附属医院心内科,江苏镇江212001【正文语种】中文【中图分类】R543血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）是血管壁的重要组成部分，通过协调血管收缩和舒张，控制血管压力和流速。
小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定
小鼠子宫平滑肌细胞的分离培养及鉴定范晶晶【摘要】To study a new simple mechanical method for the isolation and culture of Mouse myometrial smooth cells （mMSMCs） in order to provide a experimental model for study the physiology and pathology of MSMCs. A new mechanical method was used to isolate mouse myometrial smooth. And then type Ⅰ collagenase and trypsin were used to isolate mMSMCs. More than 90%of the dissociated cells exhibited initial viability. The surviving cells were observed by phase con- trast microscope and verified by immunofluorescence staining. After 3 days of incubation, primary cultures of cells attached the wall of the incubation dishes, and reached confluence with 2 weeks. The cells grew with spindle--shape and showed typi- cal ＂hill-valley＂ pattern under phase contrast microscope. Immunofluorescence staining for smooth musclea--actin shewed positive reaction in more than 98% attached cells. The mMSMCs cultured in this experiment survive well, with highly puri- ty, and can serve the further studies of physiology and pathology.%为寻找研究子宫平滑肌细胞生理和病理的实验研究模型，试建立一种新的简易机械分离培养小鼠子宫平滑肌细胞的方法。
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。
方法改良酶消化法。
结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。
结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。
吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。
体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。
小鼠阴茎血管平滑肌细胞介导ED的研究
小鼠阴茎血管平滑肌细胞介导ED的研究近年来，随着人们生活水平的提高，男性勃起功能障碍的发病率也越来越高。
勃起功能障碍，也即勃起功能障碍症，或称为阳痿，是指男性在性兴奋和心理刺激下，无法使阴茎勃起硬度足以完成性交，或勃起持续时间不足以完成性交，造成男性性生活满意度下降。
根据研究发现，勃起功能障碍并非是单一的疾病，它可能由许多因素导致，其中包括糖尿病、高血压、精神疾病和代谢疾病等等。
然而，最近的研究表明，小鼠阴茎血管平滑肌细胞可能是导致勃起功能障碍的一个重要因素。
下面我将就此进行深入介绍。
一、小鼠阴茎血管平滑肌细胞的作用小鼠阴茎血管平滑肌细胞是组成阴茎海绵体的主要 cell 类型。
阴茎海绵体是阴茎内的一个柔性组织，其内有很多的血管，平滑肌细胞位于海绵体内部的血管壁上。
经实验表明，小鼠阴茎血管平滑肌细胞的收缩和松弛状态是影响勃起功能的一个重要因素。
二、小鼠阴茎血管平滑肌细胞与勃起功能障碍的关系勃起功能是阴茎在性刺激下的生理反应，其主要是由阴茎海绵体平滑肌细胞的松弛所引起的。
近年来，许多研究表明，小鼠阴茎血管平滑肌细胞的功能异常可能导致勃起功能障碍的发生。
具体表现为：在小鼠阴茎血管平滑肌细胞中，缺少了一种名为 ROS 的分子，这个分子可以促进平滑肌细胞的松弛。
缺失 ROS 分子，就会使得海绵体中的平滑肌细胞不能完全舒张，继而影响勃起功能。
此外，多项研究发现，小鼠阴茎血管平滑肌细胞的变性也可能导致勃起功能障碍的发生。
三、研究小鼠阴茎血管平滑肌细胞的机制由于小鼠阴茎血管平滑肌细胞的功能与勃起功能紧密相关，因此研究其机制非常重要。
从细胞的角度来看，小鼠阴茎血管平滑肌细胞的功能主要受到几种分子的调控。
比如，一些 vasoactive 的分子，比如硝酸酯类化合物和孕胎素等，可以作为平滑肌细胞舒张剂，从而增强勃起功能。
而另外一些物质，比如 G-蛋白和磷脂酰肌醇三磷酸等，都可以调节小鼠阴茎血管平滑肌细胞的兴奋和缩放。
改良组织块贴壁法培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞及生物学鉴定
分 离小 鼠胸 、 腹主动脉 ， 采 用 改 良组 织 块 贴壁 法 获得 主 动脉 ＶＳ ＭＣ， 胰 蛋 白酶 消化 传 代 ， 差 速 贴 壁
科 学研 究 提 供 实验 材 料 。 方 法
法进行细胞纯化 ， 倒 置 相 差 显 微 镜 观 察 细 胞 形 态及 生 长 情 况 ， 并 用 苏木 素一 伊 红（ ＨＥ ） 染 色法 和 免 疫 荧光 法进 行 鉴 定 。 结 果 该 方 法 成 功 分 离 出小 鼠 主 动 脉 Ｖ Ｓ ＭＣ， 细胞 生 长 旺盛 ， 活 性 良好 ， 呈放 射 状 、 典型“ 峰一 谷” 样 生长 ， ＨＥ 染 色细 胞 呈 梭 形 ， 细胞 质 丰 富 ， 核 大而圆形或椭圆形， 细 胞 免 疫 荧光 显 示 特 异 性 的 细 胞 质 内 平 滑肌 肌 动蛋 白 阳性 表 达 。 结论 本方法简单、 经济 、 可靠， 可 在 体 外
血管平滑肌细胞原代培养
血管平滑肌细胞原代培养血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要细胞成分，具有调节血管管径和维持血管壁稳定的重要作用。
血管平滑肌细胞的原代培养是研究血管生物学和血管疾病发生机理的常用方法之一，同时也是研究血管再生和维修的基础。
1. 材料（1）动物组织：小鼠主动脉、人体脐带血。
（2）DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶、0.1%胶原酶、1%抗生素-抗菌素、无菌PBS。
（3）T-25培养瓶、15毫升离心管、1毫升离心管、细胞计数板、倒置显微镜、细胞培养箱、离心机、培养皿等。
2. 方法①用消毒剂清洁手部等操作区域，将小鼠主动脉取出，去除外膜和内膜，将中层切成0.5毫米大小的小块。
②将小鼠主动脉碎片与0.25%胰酶和0.1%胶原酶混合液在37℃下消化3小时。
③将消化液离心，将沉淀用DMEM培养基混合后分装在T-25培养瓶中，添加10%胎牛血清和1%抗生素-抗菌素。
④将培养瓶放置在37℃的细胞培养箱中培养，每天更换一次培养基，至细胞达到80%-90%的密度时进行传代。
①将人脐带血收集入无菌离心管中，用相同容量的PBS混合，离心15分钟，去除上清液。
3. 结果经过数天的培养，小鼠主动脉或人脐带血管平滑肌细胞可在培养瓶中生长形成典型的“山川”式形态，细胞密度逐渐增加。
细胞在培养基中会分泌胶原和纤维蛋白等胶原成分，这些成分有助于维持细胞外基质的稳定性和促进细胞分裂生长。
经过多次传代后，细胞的生长速度将明显加快，并且会逐渐转化为诱导型平滑肌细胞，表达平滑肌肌动蛋白和舒张激肽受体等标记物质。
4. 结论血管平滑肌细胞原代培养是研究血管生物学和血管疾病发生机理的重要方法。
通过原代培养可以维持细胞的稳定生长，并且可以进行多次传代，以获得更多的细胞，更好地研究细胞功能。
本实验采用小鼠主动脉和人脐带血作为来源，通过胰酶和胶原酶的消化分离获得血管平滑肌细胞，然后进行培养，可得到较为纯净的细胞。
在培养的过程中，需要注意细菌、真菌和病毒的污染，以及细胞的密度和培养基的更换等。
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。
方法改良酶消化法。
结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。
结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult 在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。
体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法，从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。
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小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良
[ 08-10-30 13:48:00 ] 作者：吴建芳编辑：studa20
【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。
方法改良酶消化法。
结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%
以上，足以满足各种细胞试验需求。
结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。
吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士
【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养
Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.
Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult
在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。
体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。
1 材料与试剂
1．1 组织来源：C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。
1．2 试剂：鼠抗SMC-α -actin ,Cy2 conjugated affinity purified anti-mouse IgG［H/L］，戊巴比妥钠注射液。
1．3 培养基：在DMEM 培养基中添加１５％胎牛血清、１％青霉素、链霉素、１％谷氨酰胺，过滤除菌备用（不要超过四4周）。
1．4 酶消化液：Collagenase TypeⅡ 7 mg 溶于5 ml DMEM 培养基中(无血清)，过滤除菌即用。
1．5 ７０％乙醇：用无菌蒸馏水配制。
1．6 器械、仪器：齿、平镊，组织、眼科剪，无菌注射器，培养皿，解剖显微镜（Paxcam,Vistavision），荧光显微镜(LEICA DMI6000B）。
2 方法
2．1 常规麻醉小鼠，70％乙醇冲洗颈部和腹部, 打开胸、腹腔 , 暴露心脏。
2．2 ５ mL 注射器穿刺左心室， PBS 缓冲液冲洗主动脉。
2．3 完整分离主动脉，放入100 mm无菌平皿，滴1～2滴PBS 缓冲液。
2．4 解剖显微镜下撕去血管外膜至血管光滑透明（如粗糙不平说明外膜去除不干净）。
2．5 取出血管，放入另一有 PBS 缓冲液的平皿里，转到超净工作台操作。
2．6 眼科剪将血管快速剪成１～２ mm2 大小后用胶原酶消化３～４ h（组织块变成细胞团即可）。
2．7 加入 DMEM培养基终止消化并离心倾去上清液，离心管中加入1 ml 新鲜培养基重悬细胞，接种于１２孔培养板中的一孔，常规静置培养。
2．8 第2天观察是否有细菌污染，如有要更换新鲜培养液，静置培养。
于第５、６天细胞生长达培养皿面积的８０％左右时可传代，常规方法即可。