改良大鼠血管平滑肌细胞的原代培养
酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞
酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞目的：采用酶消化法培养老龄SD大鼠血管平滑肌细胞，为血管疾病，特别是为动脉粥样硬化研究提供大量的原代平滑肌细胞。
方法：无菌取老龄SD大鼠主动脉，0.2%Ⅱ型胶原酶消化分离细胞，采用自然纯化、差速贴壁纯化平滑肌细胞，免疫组化鉴定平滑肌细胞α肌动蛋白。
结果：免疫组化染色显示细胞纯度在95%以上。
结论：酶消化法分离获取SD大鼠平滑肌细胞方法简单，易掌握，采用本方法可稳定获得大量的平滑肌细胞供实验使用。
[Abstract] Objective: To investigate the method of culture aged Sprague-Dawley(SD) rat vascular smooth cells (VSMCs) through enzyme digestion for supplies larges amounts of primary cells for vascular diseases. Methods: VSMCs were isolated from aged SD rat thoracic aortas by enzyme digestion and cultured with the technique of differential anchoring velocity. The expression of α-SMA was dected by immunocytochemistry. Results: Immunohischemistry revealed that the purity of VSMCs exceeded 95%. Conclusion: VSMCs can be gained easily by enzyme digestion in vitro. This method can supply larges amounts of VSMCs for scientific research and experimentation.[Key words] Smooth muscle cells; Enzymatic isolation method; Immunohistochemical staining; α-actin随着对心血管疾病，特别是动脉粥样硬化研究的进一步深入，提供稳定、大量的老龄大鼠血管平滑肌细胞是进行这些研究的基本保证。
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。
方法改良酶消化法。
结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98%以上，足以满足各种细胞试验需求。
结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。
吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity.Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。
体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。
提取大鼠平滑肌细胞——小总结
1．大鼠PASMCs的提取和原代培养(1)提取：对雄性SD大鼠用5％的水合氯醛经腹腔麻醉后，浸泡在75％的乙醇中5 rain。
将麻醉后的大鼠在超净工作台中固定好，无菌操作下迅速分离出心肺组织，置于盛有含有1％青链霉素的PBS培养皿中。
转移至无菌操作台中，漂洗心肺组织数次，眼科镊仔细剥离出肺动脉(包括肺动脉主干和左右肺动脉干)。
将已分离出的肺动脉用含1％青链霉素的HBSS冲洗数次，直至液体清亮为止，以尽量减少血细胞等的混入。
眼科剪纵向剪开肺动脉，内膜面朝上，用刀片来回轻刮2～3遍，去除内膜。
再将外膜面翻转过来，同样方法刮去外膜。
将中膜转移至盛有含20％胎牛血清的DMEM／F12的培养基中，用眼科剪反复剪成1 am×l mm×1 mm 的小组织块。
用滴管将小组织块转移至25T的培养瓶中，均匀的摆放与于瓶底，间距约0．5 cm。
加入3 mL含20％胎牛血清的DMEM／F12培养液，瓶底朝上，静置于37 oC、5％CO，的细胞培养箱巾孵育4～5 h。
待小组织块干涸后，轻翻转培养瓶，让培养液慢慢浸润瓶底上的小组织块，继续静置于培养箱中培养。
(2)原代培养：3—5 d后，有少量细胞从组织块周围游离出来；8—10 d后细胞融合成片，成峰．谷状分布，用胰酶消化传代。
一般2—3 d更换培养液，提取PASMCs 时用含20％胎牛血清的DMEM／F12，培养时用含15％胎牛血清的DMEM／F12。
采用生长状态良好的3～5代细胞进行后续实验。
取材、细胞原代及传代培养SD 大鼠肌注氯胺酮（22 mg / kg）麻醉后，作下腹部横切口，切取双侧输精管。
剥去外膜组织，小圆刀片刮除内膜，4 C PBS缓冲液（含青霉素100 U/ mI、链霉素100#g / mI）反复漂洗4 ~ 6遍，然后剪碎成1 mm3 大小的组织块。
先用0.1%的"型胶原酶消化作用10 min，倒去上清液，再加0.2% 的胰蛋白酶和0.1%的"型胶原酶消化20 min，使游离成单个细胞，600 > ! 离心5 min，收集消化的细胞，接种至25 cm2 培养瓶，加含20%胎牛血清的DMEM 培养液，置37 C含5%CO2孵箱中培养。
分化型血管平滑肌细胞的原代培养
培 养 环境 ， 可使 Ｖ ＭＣ较 长 时 间保 持 于 分 化 状 态 ， 研 究 ＶＳ Ｓ 是 ＭＣ表 型 转化 的分 子 机 制 良好 的 体 外 研 究 模 型 。 关 键 词 ： ， 滑 ， 管 ； 胞 培 养技 术 ； 型 ； 疫 组 织 化 学 肌 平 血 细 表 免
中 图 分 类号 ： ８ ３ １ Ｑ １ ． 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ９ ０ （ ０ ８ １ － ９ ８０ １ ０ — １ ６ ２ ０ ） ２０ ２ — ３ ２
不 合 血 清及 生长 因子 的 Ｄ ＭＥ 。 结果 根 据 细 胞 形 态 观 察 、 疫 组 织 化 学鉴 定 、 Ｍ 免 兴奋 剂 刺 激 引 发 的 收 缩反 应 、 分
化 型 Ｖ ＭＣ标 志 基 因的检 测 ， 实 为 分 化 型 ＶＳ Ｓ 证 ＭＣ， 化 状 态可 持 续 １周 以上 。 结论 分 在 组 织 贴 壁 法 基础 上 ， 变 改
（ ｕ ｏｏ ｙＤｅ ｒｍｅ ｔ ｔ ｅＳ ｃ ｎ ｓ ｉａ ａ ｎ， ａ ｎ ３ １ ２ ， ｈ ｎ ） Ｎｅ ｒ ｌｇ ｐａ ｔ ｎ ，ｈ ｅｏ ｄ Ｈｏ ｐ ｔ ｌＯｆ Ｘｉｍｅ Ｘｉ ｍｅ ６ ０ １ Ｃ ｉａ
Ａｂ ｔａ ｔ ０ｂｅ ｔ ｅ Ｔｏ ｓａ ｌ ｈ ｒ ｒ ｃ ｌｕ ｅ ｙ ｔｍ ｆ ａ ｃ ｌｒ ｍｏ ｔ ｓ ｌ ｅｌ ｓｒｃ ： ｊ ｃｉ ｖ ｅ ｔ ｂｉ ａ ｐ ｉ ｙ ｕ ｔ ｒ ｓ ｓｅ ｏ ｖ ｓ ｕａ ｓ ｏ ｈ ｍｕ ｃｅ ｃ ｌｓ ｓ ｍａ
胶 原蛋 白 包被 培 养 瓶 内培 养 大 鼠胸 主 动 脉 Ｖ Ｍｃ， ｓ 消化 、 滤 、 心 ， 集 从 组 织 块 分 离 的 单 个 细 胞 后 ， 种 于含 过 离 收 接 ０ ２ 小 牛血 清 、 岛 素样 生 长 因子 Ｉ 、 ． 胰 ＤＭＥ 培 养 液 的 层 粘连 蛋 白 包被 的培 养 板 上 ， 养 １ 后 将 培 养 液 更换 为 Ｍ 培 天
平滑肌细胞培养实验步骤解读
平滑肌细胞培养实验步骤解读原代平滑肌细胞培养Protocol实验准备：器材：注射器（10mL），玻璃吸管，胶头（用于细脚吸管，吹匀组织块用），枪头（蓝色、黄色），移液器（1000μL，100μL），电动移液器，玻璃培养皿（2-3个），小烧杯（10 mL或5 mL），青霉素瓶（配鼠尾胶原），剪刀（大，小，弯）多把，镊子（大，小，弯）多把，纱布，六孔板（真空包装），托盘（放老鼠），酒精棉球，乳胶手套试剂：平滑肌细胞专用培养基，生理盐水，D-hank’s 液，鼠尾胶原，戊巴比妥钠（麻醉用），75%酒精步骤：1. 高压灭菌实验所需器材，超净台紫外照射30mins，吹风；2. 配制鼠尾胶原应用液，一般1:15-1:19稀释，六孔板中每孔加入1mL稀释液待用（可省去）；3. 大鼠（200g左右，一百五六十克较好）腹腔注射一定体积戊巴比妥钠（0.5mL/100g）麻醉，麻醉好后将大鼠全身（尤其是胸腹部）用酒精棉球擦拭干净，放入托盘置于超净台中紫外照射15mins左右，开始试验；4. 用已消毒的剪刀将大鼠腹部表皮剪开，充分暴露出整个胸部，再换用干净的剪刀打开胸腔。
将肝脏及肺脏等组织拨开（小心操作以避免伤到血管）。
用小弯镊及小直镊分离胸主动脉外壁贴附的结缔组织及外膜等。
分离干净后，用眼科剪小心剪断血管，去除血管中的血，置于干净玻璃培养皿中；5. 用生理盐水多次冲洗分离出来的血管。
冲洗干净后，将血管剪开，小心刮除血管内膜，去掉内皮细胞；6. 将处理好的血管放入平滑肌细胞专用培养基（约200μL）中，用眼科剪将组织尽量剪碎成1mm3大小的小块，用细脚吸管吹匀后，均匀种入加了鼠尾胶原的六孔板中；7. 用黄枪头小心吸弃多余的液体（避免将组织块吸起来），然后将六孔板盖好颠倒放在培养箱中约2h（待组织块粘牢培养板底）后，再加入培养基；8. 过3-4d后拿出细胞在显微镜下观察，看其是否已长出。
肺动脉平滑肌细胞原代培养原代培养
肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程一、实验准备1、健康雄性SD大鼠一只，4周大，重约200g。
2、 75％消毒用酒精2瓶，5%碘酒1瓶，无菌0.01MPBS溶液500ml，M199培养基100ml（含4mmol/L 的谷氨酰胺、15%胎牛血清、20万IU/L青霉素、20万IU/L链霉素）。
3、生物安全柜2个，解剖板1个（含4条固定用绳子），1L烧杯1个，培养皿5个，培养瓶5个，1ml 吸管20根，弯头吹打管10根，眼科剪3把，眼科镊3把，解剖镊3把，止血钳4把，手术刀1把，刀片若干，吸头若干、棉签纱布若干，口罩帽子及无菌手套若干。
二、操作步骤1、洗手，戴口罩帽子及手套。
2、酒精喷洒并擦拭生物安全柜1，放入培养皿1个（倒入PBS并盖好）、手术刀1把、组织剪1把、止血钳4把及纱布若干（均经蒸汽灭菌消毒）。
3、处死大鼠（断颈法），完全浸泡于盛有75%的1L烧杯中3min，碘酒酒精消毒解剖板（包括绳子），换手套，取出大鼠，固定于解剖板上，放入生物安全柜1，打开紫灯消毒30min。
4、酒精喷洒并擦拭生物安全柜2，于左侧放培养瓶、吸管及弯头吸管，眼科剪3把，眼科镊3把，中间放培养皿4个（打开，共8个，其中5个倒入PBS），以上物品均经蒸汽消毒灭菌，除培养皿外均应装入消毒饭盒内防止污染。
左侧放解剖镊1把（泡入酒精中，取吸管时用）。
打开紫灯消毒30min。
5、打开生物安全柜1，开吹风机10min，再一次消毒老鼠。
6、换手套，用手术刀、止血钳、解剖镊、组织剪等开胸，取出完整的心肺组织放入培养皿内，盖好。
7、打开生物安全柜2，开吹风机10min，放入装有心肺培养皿。
8、换手套，用眼科剪眼科镊仔细分离出肺动脉。
9、将取出的肺动脉（长约0.5cm）放入无PBS的培养基中，去除纤维外膜，用眼科剪将其剖开，用PBS 冲洗3次至无血迹，（原则上还应刮除肺动脉内皮细胞，但因组织太小不好操作，且内皮细胞在M199培养基中不易生长，故此操作可省略）。
改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞解读
改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞[ 11-03-31 14:28:00 ] 作者：吴海亚，戴元荣，尹娟编辑：studa20【摘要】目的：改进大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)的培养方法，了解其生长特性，为研究气道疾病提供体外研究模型。
方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树，去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后，采用改良组织贴块法培养ASMCS，应用形态学和抗SMα-action免疫细胞化学法鉴定平滑肌细胞。
结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d，细胞开始从组织块周围长出，5～8 d在组织块附近出现“谷-峰”结构，9～12 d可融合。
传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。
结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点，为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。
【关键词】气道;平滑肌;细胞培养;组织贴块法;大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)是气道的重要结构细胞之一，具有重要的生理作用。
ASMCS的异常是呼吸道疾病的重要病理特征之一，其增生、肥大是气道重塑的关键[1]。
Hirst等[2]认为应将平滑肌细胞作为研究哮喘的标靶。
体外培养ASMCS是研究细胞生物学行为、疾病发病机制及其防治手段的基础。
本研究采用改良组织贴块法培养出ASMCS，报告如下。
1 材料和方法1.1 实验动物SPF级SD雄性大鼠购自上海实验动物中心，体重250～350 g。
饲养于温州医学院实验动物中心SPF级实验室，饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。
1.2 主要仪器和试剂倒置显微镜(NIKON TS100 日本尼康公司);5% CO2培养箱(美国Thermo);25 mL无菌培养瓶(美国Corning公司);RPMI 1640培养基(美国HyClone公司);优级胎牛血清(杭州四季青公司);0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA溶液(美国GIBCO公司);青链霉素(北京索来宝生物科技有限公司);D-Hanks液(上海捷瑞生物有限公司);I型胶原酶(美国Sigma公司);SMα-actin单克隆抗体(美国Sigma公司);小鼠免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)。
分化型血管平滑肌细胞的原代培养
分化型血管平滑肌细胞的原代培养牛建平;周志斌;史树海;彭瑞强【期刊名称】《中华老年心脑血管病杂志》【年(卷),期】2008(10)12【摘要】目的建立大鼠主动脉分化表型血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)原代培养,为研究VSMC表型转化的分子机制提供体外研究模型.方法无菌条件下分离大鼠胸主动脉中膜,组织贴壁法在Ⅳ型胶原蛋白包被培养瓶内培养大鼠胸主动脉VSMC,消化、过滤、离心,收集从组织块分离的单个细胞后,接种于含0.2%小牛血清、胰岛素样生长因子Ⅰ、DMEM培养液的层粘连蛋白包被的培养板上,培养1天后将培养液更换为不合血清及生长因子的DMEM.结果根据细胞形态观察、免疫组织化学鉴定、兴奋剂刺激引发的收缩反应、分化型VSMC 标志基因的检测,证实为分化型VSMC,分化状态可持续1周以上.结论在组织贴壁法基础上,改变培养环境,可使VSMC较长时间保持于分化状态,是研究VSMC表型转化的分子机制良好的体外研究模型.【总页数】3页(P928-930)【作者】牛建平;周志斌;史树海;彭瑞强【作者单位】361021,厦门,厦门市第二医院神经内科;361021,厦门,厦门市第二医院神经内科;361021,厦门,厦门市第二医院神经内科;361021,厦门,厦门市第二医院神经内科【正文语种】中文【中图分类】Q813.1【相关文献】1.大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定 [J], 刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德;2.两种原代培养方法对血管平滑肌细胞收缩表型的影响 [J], 周昌钻;郭航远;孟立平;季政;3.移植物动脉硬化模型大鼠血管平滑肌细胞原代培养及鉴定 [J], 张远标;尚敏杰;王知非;洪德飞;王伟林;郑跃英4.大鼠主动脉血管平滑肌细胞原代培养与鉴定 [J], 刘姿麟;林慕之;况春燕;刘兴德5.改良有效的培养大鼠原代血管平滑肌细胞的方法 [J], 邓惠坚;卢群;林转娣;审校因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大鼠原代细胞培养步骤
大鼠原代细胞培养步骤
大鼠原代细胞培养是指从活体组织中分离出的未经连续传代的细胞进行培养和繁殖。
以下是大鼠原代细胞培养的一般步骤：
1. 材料准备：准备培养皿、培养基、PBS（磷酸盐缓冲液）、消化酶、抗生素等。
2. 组织采集：使用无菌操作将大鼠体内所需组织（如肝脏、脾脏、肺组织等）取出。
3. 组织处理：将采集到的组织置于PBS中，用显微刀或剪刀切碎组织，使其细胞释放出来。
4. 细胞分散：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）对组织进行消化，使细胞分散开来。
5. 筛选和洗涤：倒入含有培养基的离心管中，并通过滤网筛除组织碎片、未被消化的残余物等。
6. 细胞计数：使用细胞计数板或细胞计数仪对细胞进行计数，以确定合适的细胞密度。
7. 细胞培养：将细胞悬浮液均匀地分配到预先消毒的培养皿中，并加入适量的培养基。
8. 培养条件：将培养皿放置在恒温培养箱中，设置适当的温度、湿度和CO2浓度，提供细胞生长所需的营养物质。
9. 观察和维护：定期观察细胞的形态、增殖情况和细胞污染情况，并进行必要的维护工作，如培养基更换、细胞传代等。
10. 实验应用：根据具体实验目的，将培养好的大鼠原代细胞用
于各种细胞学、分子生物学和药理学实验中。
需要注意的是，大鼠原代细胞具有有限的传代次数，因此在实验中需要及时进行细胞传代，以保证细胞的正常生长和功能。
同时，严格遵守无菌操作规范，确保细胞培养的纯度和质量。
大鼠血管平滑肌培养
SD大鼠平滑肌的分离
1、300g左右大鼠戊巴比妥钠1ml注射麻醉（用20 mg/L的戊巴比妥钠按照50 mg/kg腹腔注射麻醉）。
10分钟后固定于解剖板上，酒精消毒，剪开腹部，挑开内脏，寻找腹主动脉，用静脉留置针尽量抽血。
2、抽干血液，剪开胸腔，翻开肺脏，寻找与心腔相连的胸主动脉（连接处有3个开口），沿着脊柱一直向下延伸（注意与食道区别，食道与胃连接），钝性分离周围脂肪组织，剪断后放入生理盐水中，冲洗干净血液，用镊子夹住一段，另一镊子从上至下用力刮脱，分离掉血管周围的脂肪组织。
3、转入超净台中，用PBS（或生理盐水）清洗，滴入少许胎牛血清至血管，在血清中剪碎血管组织，置入培养箱中2h。
4、随后加入20%胎牛血清低糖DMEM培液（最好加抗生素），继续培养。
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医 研 杂 ２１ 月 学 究 志 ０ 年１ 第４卷 第１ １ Ｏ 期
・ 论
善 ・
改 良大 鼠 血 管 平 滑 肌 细 胞 的 原 代 培 养
丁洪飞 黄胜超 李建文 陈 小 东 陈 宝英 吴 平
摘 要 目 的 探 讨 提 高 大 鼠 血管 平 滑 肌 细 胞 原 代 培 养效 率 的方 法 。方 法 采 取 组 织 块 贴壁 法进 行 原 代 培 养 ， 糖 Ｄ Ｅ 高 Ｍ Ｍ
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原代 培可 以 传 代 ； 代 培 养 ， 传 １周 可 以 传 代 １次 。 镜 下 可 见 细 胞 以梭 形 为
主 ， “ 一 ” 生 长 ， 疫 组 化 染 色 可 见 细胞 浆 内有 大 量 染 成 棕 黄 色 的 肌 丝 。 结 论 在 采 用 组 织 块 贴 壁 法 进 行 培 养 时 ， 入 呈 峰 谷 状 免 加
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