大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定
大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养与鉴定徐索文肖平喜陈健文乐康沈晓燕黄河清刘培庆
【摘要】目的建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型，为体外研究动脉粥样硬化的发病机制提供重要的实验手段。
方法采用改良的植块贴壁法，成功建立大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型;分别用倒置显微镜和SABC试剂盒对培养细胞进行形态学观察、免疫组织化学和免疫荧光鉴定(平滑肌细胞特异性的α- SM - actin)。
结果原代培养的血管平滑肌细胞在接种后3天开始从组织块周围游出，光镜下培养细胞呈梭形，放射状生长和典型的“峰谷”状生长;免疫组化和荧光染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达，证实培养的细胞为血管平滑肌细胞。
结论本法简便、可靠、经济、短期内可获大量高纯度、功能良好的血管平滑肌细胞，可作为研究动脉粥样硬化和移植血管再狭窄机制的有效模型。
【关键词】大鼠;胸主动脉;植块法;血管平滑肌细胞
[Abstract]ObjectiveTo establish the culture model of rat aorta vascular smooth muscle cells (VSMCs) to provide important experimental method for the pathogenesis research of atherosclerosis in vitro. MethodsEmploying the explants technique, the primary and sub-culture were completed by
modified tissue-piece inoculation and trypsin digestion respectively. The cultured cells were identified by phase contrast microscopy and immunohistochemical and immunofluorescent staining.ResultsAfter 3 days of inoculation of tissue-pieces, VSMCs migrated from the vessel pieces. The cultured cells showed the typical “hills and valleys”morphological features under the microscope. Immunohistochemical and immunofluorescent staining with monoclonal antibody against mouse α-SM- actin demonstrated these cells were positive. ConculsionIt is a simple and reliable method for obtaining highly purified and satisfactory VSMCs in short term, providing a favorable experimental platform for research into the mechanism of vascular proliferous diseases such as atherosclerosis and restenosis.
[Key words]rat;thoracic aorta;explants method;vascular smooth muscle cells
血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的异常增殖、迁移、泡沫化及凋亡与冠状动脉旁路移植术(CABG)和经皮冠脉腔内血管成形术(PTCA)术后血管再狭窄、颈动脉球囊损伤术致新生内膜形成(neointima formation)及动脉粥样硬化
(atherosclerosis)密切相关[1~4]。
因此，研究防治VSMCs增殖与迁移成为血管生物学领域研究的热点。
本研究在参考国内外文献的基础上[5~8]，结合自己的经验，采用改良的植块贴壁法成功建立了大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的培养模型。
1材料与方法
1.1动物与试剂SPF级雄性SD大鼠1只，体重(150±10)g，中山大学实验动物中心提供，合格证号(粤监证字2006A064)。
DMEM (Gibco) 、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所) 、胰蛋白酶(trypsin , Sigma) 、T25 塑料培养瓶(Costar) 、特异性鼠平滑肌肌动蛋白抗体、SABC试剂盒、DAB 显色试剂盒 (武汉博士德公司) 、FITC标记的羊抗鼠荧光二抗(Santa Cruz Biochem)
1.2大鼠VSMCs的分离与原代培养SPF级雄性SD大鼠1只, 重约150g，颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒2min，同时用酒精浇灌大鼠的胸腹部，移入超净台内。
无菌条件下迅速取出全段胸主动脉, 立即移入含冷PBS的无菌平皿中。
使用 1ml的一次性注射器拔去针尖后吸取PBS清洗去除血污，眼科镊去外膜结缔组织，此时将洁净血管转移到另一含冷PBS的无菌平皿中，用眼科剪小心剪去血管绒毛后用两弯镊反向牵拉去除外膜，再用眼科弯镊穿过血管沿两端来回牵拉一次，纵向剖开血管，使内膜面朝上,并用弯镊摊平血管，再将血管转移到含。
血管内皮细胞对平滑肌细胞表型转化的影响
１．２．１大鼠血管内皮细胞分离和培养：取２５０９的ＳＤ大 鼠１只，断颈处死，无菌条件下剖开胸腔，取胸主动脉２－３厘 米，ＰＢＳ冲洗清除血细胞。翻转血管，结扎两端，注入ｌｇ／ Ｌ（Ｏ．１％）胶原酶于３７℃消化１５～２０ ｍｉｎ。收集消化液，１０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｒａｉｎ，沉淀用内皮细胞完全培养基重悬，接种于 六孔板（Ｃｏｍｉｎｇ，美国）中，于３７℃，５％ＣＯ，培养箱中常规 培养。血管内皮细胞完全培养液成分：ＤＭＥＭ基础培养液、
剥离培养孔底部悬浮于培养液中，镜下观察可见单层ＶＥＣｓ附 着在胶原凝胶底层。然后将ＶＳＭＣｓ细胞悬液按ｌ×１０４／孔密 度沿孔内侧壁轻轻加至浮胶底部，并放入３７＂（２，５％ＣＯｚ培养 箱，隔天换液一次。加入ＶＳＭＣｓ后整个操作过程避免晃动， 防止含有ＶＳＭＣｓ的细胞悬液进入浮胶上层。
１．２．４
１材料和方法
ＲＴ－ＰＣＲ椅测结果表明．４８ｈ共培养组ＶＳＭＣｓ的合成表型相关基因ＣＲＢＰ－ｌ、ｓｍ哪ｂ的表达水平显著高干单独培葬组．分别为Ｉ
４倍，ｌ ５
倍－７２ｈ选到峰值．分别为Ｉ ７倍、２Ｉ倍．９６ｈ开始下降，搀培养组中收缩表！标记物Ｓｍｏｏｔｈｅｌｆａ—Ｂ和ＳＭ－ＭＨＣ的基园表达木平在４８ｈ、 ７２ｈ＆著低于单拙培养组．９６ｈ Ｓｍ∞ｔｈｅｌｉｎ—Ｂ却高于单独培养维。单抽培养组上进备ｇ因的变化趋势Ｔ变或保持稳定。免癌荧光结果显示 ＳＭ—ＭＨＣ＊白表达在共培养组中９６ｈ后从下降转为升高（Ｐ＜０ ０５）。结论在共培养体系中，血管内皮细胞对缸管平滑肌细胞表型转化的作 用表现为先促进向合成型转化，９６ｈ后促进向性缩型转化。 ！＊望ｉ加表型－细胞共培养一血管内皮细胞ｔ血管平滑肌细胞ｔ基目表达
ｃｅｌｌｓ，ＶＥＣｓ）与平滑肌细胞之间的相互作用是悯节
态和生理特性”。平滑肌细胞所表达的肌球蛋白莆链（ｓｍｉｔｈ
提取大鼠平滑肌细胞——小总结
1．大鼠PASMCs的提取和原代培养(1)提取：对雄性SD大鼠用5％的水合氯醛经腹腔麻醉后，浸泡在75％的乙醇中5 rain。
将麻醉后的大鼠在超净工作台中固定好，无菌操作下迅速分离出心肺组织，置于盛有含有1％青链霉素的PBS培养皿中。
转移至无菌操作台中，漂洗心肺组织数次，眼科镊仔细剥离出肺动脉(包括肺动脉主干和左右肺动脉干)。
将已分离出的肺动脉用含1％青链霉素的HBSS冲洗数次，直至液体清亮为止，以尽量减少血细胞等的混入。
眼科剪纵向剪开肺动脉，内膜面朝上，用刀片来回轻刮2～3遍，去除内膜。
再将外膜面翻转过来，同样方法刮去外膜。
将中膜转移至盛有含20％胎牛血清的DMEM／F12的培养基中，用眼科剪反复剪成1 am×l mm×1 mm 的小组织块。
用滴管将小组织块转移至25T的培养瓶中，均匀的摆放与于瓶底，间距约0．5 cm。
加入3 mL含20％胎牛血清的DMEM／F12培养液，瓶底朝上，静置于37 oC、5％CO，的细胞培养箱巾孵育4～5 h。
待小组织块干涸后，轻翻转培养瓶，让培养液慢慢浸润瓶底上的小组织块，继续静置于培养箱中培养。
(2)原代培养：3—5 d后，有少量细胞从组织块周围游离出来；8—10 d后细胞融合成片，成峰．谷状分布，用胰酶消化传代。
一般2—3 d更换培养液，提取PASMCs 时用含20％胎牛血清的DMEM／F12，培养时用含15％胎牛血清的DMEM／F12。
采用生长状态良好的3～5代细胞进行后续实验。
取材、细胞原代及传代培养SD 大鼠肌注氯胺酮（22 mg / kg）麻醉后，作下腹部横切口，切取双侧输精管。
剥去外膜组织，小圆刀片刮除内膜，4 C PBS缓冲液（含青霉素100 U/ mI、链霉素100#g / mI）反复漂洗4 ~ 6遍，然后剪碎成1 mm3 大小的组织块。
先用0.1%的"型胶原酶消化作用10 min，倒去上清液，再加0.2% 的胰蛋白酶和0.1%的"型胶原酶消化20 min，使游离成单个细胞，600 > ! 离心5 min，收集消化的细胞，接种至25 cm2 培养瓶，加含20%胎牛血清的DMEM 培养液，置37 C含5%CO2孵箱中培养。
红花对AngⅡ诱导大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞凋亡和Caspase-3表达的影响.
关键词 ： 红花 ； 血管紧张素 Ⅱ； 动脉粥样硬化 ； 细胞凋亡 ； Ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ ． ３蛋 白
ｄ ｏ ｉ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ２ － ２ ６ ６ Ｘ ． ２ ０ １ ３ ２ ９
化（ Ａ Ｓ ） 是导致 心脑 血管疾 病 的重要病 因。在 Ａ Ｓ形 成 过程 中 ， 不规则 的细 胞 凋亡 引 起 动 脉管 壁 在 形 态 发生 、 结构 稳定 及代 谢 等 方 面异 常 。有 关 凋 亡 的众 多 生理 、 病 理 和生化 因子参 与 了血 管 细胞 的凋 亡过
程， 影响 Ａ Ｓ斑块 的完 整性 和稳 定性 。研 究表 明 ， Ａ Ｓ
常形 态和 功能方 面起 着 重 要作 用 ， 其 可 以将 机 体 的
组成 成分 限制在 生理需 要 的范 围之 内。动脉 粥样硬
购 自苏 净集 团安 泰公 司 ；Ｘ Ｄ Ｓ ． １ Ｂ型 倒 置 显微 镜 购 自 日本 Ｏ Ｌ Ｙ Ｍ Ｐ Ｕ Ｓ ； 恒 温水 浴 箱 （ 上海 博 迅 实业 有 限 公 司） ； Ｘ Ｓ Ｚ — ＨＳ ３光学显 微 镜 （ 重庆 光 电公 司 ） ； ７ ９ － １
１ ９ ． ９ ４ ％ ±３ ． ９ ２ ％、 ３ ． ９ ６ ％ ±１ ． ７ ７ ％、 ０ ， 红花组与其他三组 比较 ， Ｐ均 ＜０ ． ０ １ ， 模 型组、 Ｄ ＭＳ Ｏ对 照组与空 白对照组 比
较， Ｐ均 ＜ ０ ． ０ ５ 。模 型 组 、 红 花组 、 Ｄ ＭＳ Ｏ对 照 组 、 空 白对 照组 Ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ － ３表达 的灰度 值分 别 为 １ ３ ４ ． ２ ９±１ ６ ． ８ ６ 、
１ ４ ７ ． ８ ７±１ ２ ． ４ ３ 、 １ ３ ６ ． ２ ０±１ ５ ． ２ １ 、 １ ３ ０ ． １ ９±１ ４ ． ３ ２ ， 四组间两两 比较 ， Ｐ均 ＞０ ． ０ ５ 。结论 红花可 以显著促 进 Ａ ｎ ｇ Ⅱ 诱 导的大鼠动脉平滑肌细胞凋亡作用 ， 其促进凋亡 的途径与 Ｃ ａ ｓ ｐ ａ ｓ ｅ － ３蛋 白表达无 明显关联 。
平滑肌细胞培养实验步骤解读
平滑肌细胞培养实验步骤解读原代平滑肌细胞培养Protocol实验准备：器材：注射器（10mL），玻璃吸管，胶头（用于细脚吸管，吹匀组织块用），枪头（蓝色、黄色），移液器（1000μL，100μL），电动移液器，玻璃培养皿（2-3个），小烧杯（10 mL或5 mL），青霉素瓶（配鼠尾胶原），剪刀（大，小，弯）多把，镊子（大，小，弯）多把，纱布，六孔板（真空包装），托盘（放老鼠），酒精棉球，乳胶手套试剂：平滑肌细胞专用培养基，生理盐水，D-hank’s 液，鼠尾胶原，戊巴比妥钠（麻醉用），75%酒精步骤：1. 高压灭菌实验所需器材，超净台紫外照射30mins，吹风；2. 配制鼠尾胶原应用液，一般1:15-1:19稀释，六孔板中每孔加入1mL稀释液待用（可省去）；3. 大鼠（200g左右，一百五六十克较好）腹腔注射一定体积戊巴比妥钠（0.5mL/100g）麻醉，麻醉好后将大鼠全身（尤其是胸腹部）用酒精棉球擦拭干净，放入托盘置于超净台中紫外照射15mins左右，开始试验；4. 用已消毒的剪刀将大鼠腹部表皮剪开，充分暴露出整个胸部，再换用干净的剪刀打开胸腔。
将肝脏及肺脏等组织拨开（小心操作以避免伤到血管）。
用小弯镊及小直镊分离胸主动脉外壁贴附的结缔组织及外膜等。
分离干净后，用眼科剪小心剪断血管，去除血管中的血，置于干净玻璃培养皿中；5. 用生理盐水多次冲洗分离出来的血管。
冲洗干净后，将血管剪开，小心刮除血管内膜，去掉内皮细胞；6. 将处理好的血管放入平滑肌细胞专用培养基（约200μL）中，用眼科剪将组织尽量剪碎成1mm3大小的小块，用细脚吸管吹匀后，均匀种入加了鼠尾胶原的六孔板中；7. 用黄枪头小心吸弃多余的液体（避免将组织块吸起来），然后将六孔板盖好颠倒放在培养箱中约2h（待组织块粘牢培养板底）后，再加入培养基；8. 过3-4d后拿出细胞在显微镜下观察，看其是否已长出。
大鼠腹主动脉平滑肌细胞培养及鉴定
大鼠腹主动脉平滑肌细胞培养及鉴定朱晋坤;毛华;董文;鲁玉明;熊宗华;杜峰;文美;刘廷筑;张敏【摘要】目的培养、鉴定大鼠腹主动脉平滑肌细胞.方法采用组织贴块法分离培养大鼠腹主动脉平滑肌细胞,胰蛋白酶消化传代,相差显微镜及即用型SABC免疫组化染色试剂盒进行细胞鉴定.结果平滑肌细胞呈梭形或长梭形生长,透射电镜可见细胞的胞浆内有很多与细胞纵轴平行的肌丝和与之相连的致密体.高倍镜下可见胞质内大量棕色、与细胞长轴平行的纤维细丝.核卵圆形居中,呈淡蓝色.结论大鼠腹主动脉平滑肌细胞分离、培养方法简单、可行.【期刊名称】《贵州医药》【年(卷),期】2011(035)010【总页数】2页(P888-889)【关键词】血管平滑肌细胞;细胞培养;细胞鉴定;大鼠【作者】朱晋坤;毛华;董文;鲁玉明;熊宗华;杜峰;文美;刘廷筑;张敏【作者单位】贵阳市第一人民医院,550002;贵阳市第一人民医院,550002;贵阳市第一人民医院,550002;贵阳市第一人民医院,550002;贵阳市第一人民医院,550002;贵阳市第一人民医院,550002;贵阳市第一人民医院,550002;贵阳市第一人民医院,550002;贵阳市第一人民医院,550002【正文语种】中文【中图分类】R318.11经皮冠脉介入术后靶血管再狭窄、血栓形成及血管舒缩功能丧失是其临床应用面临的重大难题。
近年研究认为，血管平滑肌细胞具有较强的增殖能力，其异常增殖和迁移是导致经皮冠脉腔内血管成形术（PTCA）和冠状动脉旁路移植术（CABG）术后相关血管病变处再狭窄发生的基础［1］。
抑制血管平滑肌增殖对血管成形术后再狭窄的预防至关重要。
体外培养血管平滑肌细胞是研究血管平滑肌细胞生物特性及血管再狭窄形成机制的基础。
本实验利用大鼠腹主动脉成功分离、培养出血管平滑肌细胞，实验操作简单、易行，希望能为该类实验研究提供帮助。
1 材料与方法1.1 材料150g Sprague－Dawley（SD）雄性大鼠（第三军医大学新桥医院实验动物中心）；DMEM－L液（Hyclon公司）；胎牛血清（Hyclon公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；兔抗大鼠α2actin单克隆抗体（Sigma公司）；即用型SABC 免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，中国）。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心肌细胞功能的重要模型细胞。
分离、鉴定和培养大鼠心肌细胞是心血管研究的基础工作之一，本文将介绍关于大鼠心肌细胞的分离、鉴定以及培养的方法。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 材料准备（1）取得3-5天大的小鼠；（2）取得适合的心肌分离培养试剂盒，如Worthington试剂盒；（3）取得离心机和培养箱等实验设备。
2. 心肌细胞的分离（1）将小鼠处死，取出心脏放置在含有生理盐水的培养皿中；（2）迅速将心脏移至足够的胶原酶/胶原酶B混合液中，加入2-3ml的混合液，用剪刀将心脏切成小块；（3）将含有心肌切块的培养皿放入37度水浴箱中37±1度水浴中消化，酶解30-50min，要不断观察；（4）将消化液收集至15ml离心管内，并逐渐加入适量的生理盐水；（5）将含有细胞的离心管放入离心机，1500rpm离心去沉淀心肌细胞；（6）吸去上清液，加入足够的DMEM/F-12培养基，轻轻振动混匀；二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 细胞形态鉴定（1）将培养皿内心肌细胞移至显微镜下观察细胞形态；（2）通过显微镜观察细胞的形态、大小、颜色等；（3）正常大鼠心肌细胞呈长条形，且贴附于培养皿底部。
2. 免疫荧光染色鉴定（1）将培养皿内的细胞进行PBS溶液洗涤；（2）加入4% paraformaldehyde固定细胞，洗涤；（3）加入常用的抗心肌肌动蛋白抗体，孵育；（4）洗涤后加入FITC标记的二抗或荧光素进行荧光染色；（5）用荧光显微镜观察细胞的荧光情况，确定心肌细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 培养基的配制（1）将DMEM/F-12培养基加入10%的胎牛血清、1%的青霉素和链霉素，混匀；（2）将培养基过滤灭菌后，置于4度冰箱储存备用。
2. 心肌细胞的培养（1）将心肌细胞悬液加入到预先涂覆明胶的培养皿中；（2）将培养皿放入CO2培养箱中37度培养，第二天更换新的培养基；（3）每2-3天更换一次培养基，直至细胞形成充分的单层。
酶消化法分离培养大鼠血管平滑肌细胞方法的改良
酶消化法分离培养大鼠血管平滑肌细胞方法的改良
李宪伟;姜维良
【期刊名称】《哈尔滨医科大学学报》
【年(卷),期】2011(45)1
【摘要】目的改良酶消化法并建立一种简单方便且高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。
方法在无菌条件下分离大鼠胸主动脉,0.1%Ⅱ型胶原酶消化分离血管平滑肌细胞并进行培养。
用倒置相差显微镜观察血管平滑肌细胞的生物学特性,用免疫组化染色法检测细胞胞浆内α-肌动蛋白(α-actin)的表达。
结果相差显微镜下细胞呈现"谷和峰"的生长特点,α-actin胞浆染色阳性细胞数占总细胞数的98%以上。
结论单纯Ⅱ型胶原酶可消化分离培养血管平滑肌细胞,且有成活细胞数多、传代周期短的特点。
【总页数】4页(P58-60)
【关键词】胸主动脉;血管平滑肌细胞;大鼠;培养
【作者】李宪伟;姜维良
【作者单位】哈尔滨医科大学附属第二医院血管外科
【正文语种】中文
【中图分类】R-332
【相关文献】
1.胶原酶消化法分离、培养大鼠触须毛乳头的方法 [J], 陈先才;陈海滨;蔡博治;林常敏
2.酶消化法分离老龄SD大鼠血管平滑肌细胞 [J], 王明勇;陈枫;陈庄
3.酶消化法分离培养家兔血管平滑肌细胞 [J], 王生兰;刘辉琦;王丽华;王树人
4.二步酶消化法分离大鼠主动脉血管平滑肌细胞及活性鉴定 [J], 刘幸平;沈岱菲;郑燕珊;方欢;高分飞
5.Ⅱ型胶原酶/弹性蛋白酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞 [J], 涂永生;黄红林;朱炳阳;廖端芳
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大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养心肌细胞是构成心脏肌肉的主要细胞类型，具有重要的生理功能。
研究大鼠心肌细胞具有重要的意义，可以探究心血管疾病的发生和发展机制，以及开发相关的药物治疗。
大鼠心肌细胞的分离可通过以下步骤进行：1. 预处理：取出大鼠心脏，迅速放置在冷却的维生素-free Hanks盐溶液中。
然后，用冷却过的Hanks盐溶液洗涤心脏，去除血液和杂质。
2. 细胞分离酶处理：将心脏切成小块，并放入含有0.1%胰蛋白酶和0.1%胆汁酸的预温化酶解缓冲液中。
在37℃的恒温摇床上进行酶解处理。
3. 细胞分离：酶解后的心脏组织经过轻微的摇晃，并用玻璃棒将组织块轻轻破碎。
将破碎的组织悬浮液通过细胞筛过滤器，并用高离心力离心收集上清液。
4. 细胞沉降：将上清液经过离心，去除上清液，留下细胞沉淀。
再次加入含有0.1%胰蛋白酶的预温化酶解缓冲液，并摇动细胞沉淀，使细胞悬浮。
5. 细胞富集：采用密度梯度离心法，将细胞悬液慢慢加入含有离心液的离心管中进行离心。
心肌细胞将沉积在密度梯度的底部。
6. 细胞培养：将心肌细胞的上清液去除，留下沉积的心肌细胞，加入预先准备好的心肌培养基中。
将细胞培养于37℃恒温孵化箱中，并提供适当的营养物质。
1. 形态学鉴定：使用显微镜观察细胞的形态结构。
正常的心肌细胞呈长条状，具有交叉纹理的横纹。
如果细胞形态发生变化，如变形、伸长或成球状，则可能表示细胞出现异常。
2. 免疫细胞化学鉴定：使用免疫荧光染色或免疫组化染色的方法，检测心肌细胞特异性标记物，如肌球蛋白（myosin）等。
正常的心肌细胞应表达这些标记物。
3. 功能鉴定：利用心肌细胞的特殊功能特点，如收缩、钙离子跨膜转运等，进行鉴定。
可通过记录细胞的膜电位变化、细胞的跳动频率等指标来评估细胞功能。
心肌细胞的培养需要特别注意以下事项：1. 培养基的选择：根据不同研究需求选择适当的培养基，如DMEM、Dulbecco改良的培养基等。
培养基应添加适量的血清、营养物质和生长因子，以提供细胞所需的营养和生长环境。
大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的原代培养及鉴定
大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的原代培养及鉴定敖锋;张自力;宋健【摘要】Objective To investigate the primary culture and identification of the smooth muscle cel s (SMC)from the medial of vascu-lar wal inrats.Methods SMC from the medial of vascular wal were cultured by modified tissue culture.The cel ular morphology was observed under inverted phase contrast microscope.SMC were isolated and identified with immunofluorescence.Results SMC were isolated successful y and cultured.The cel s had a typical peak val ey like growth,and showed fusiform.The positive rate of cel s i-dentified with immunofluorescence were more than 95%.Conclusion The modified tissue culture can isolateand cultivate SMC with high purity and good activity under in vitro conditions with simple,reliable method.%目的：探讨一种方便、快捷、大量原代培养大鼠血管壁中膜平滑肌细胞的方法,为心血管疾病的体外研究提供可靠的实验材料。
方法利用改良的组织贴块法进行血管壁中膜平滑肌细胞原代培养,使用倒置相差显微镜观察细胞形态,并用免疫荧光染色鉴定分离培养的细胞。
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养
大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养大鼠心肌细胞是研究心脏疾病和心脏功能的重要细胞模型。
对大鼠心肌细胞的分离、鉴定和培养是进行心血管疾病研究的基础工作。
本文将介绍大鼠心肌细胞的分离鉴定以及培养的方法和步骤。
一、大鼠心肌细胞的分离1. 器材准备分离大鼠心肌细胞需要使用一些基本实验器材，包括离心机、显微镜、细胞培养箱、灭菌培养仪、移液器等。
还需要一些特殊器材，如细胞分离酶、细胞培养耗材等。
2. 细胞分离液的制备将适量的细胞分离液（比如包含胰酶和胰蛋白酶的消化液）配制好，根据具体的实验目的和所用试剂的浓度来调配。
3. 大鼠心脏的取样将需要的大鼠的心脏取出，迅速置于含有氧合液的离心管中，将其置于4°C的冰箱中等待使用。
4. 心肌细胞的分离将心脏组织放入离心管中，使用消化液进行酶解，经过一定时间的消化后，使用吸管或移液器将含有心肌细胞的上清液取出，用培养基冲洗数次，离心收集细胞。
5. 细胞的筛选用胶原酶进行细胞的预遴选，再用显微镜进行筛选。
二、大鼠心肌细胞的鉴定1. 形态学鉴定通过显微镜观察心肌细胞的形态结构，确定细胞形态是否符合心肌细胞的特征。
2. 免疫细胞化学染色使用心肌细胞特异性的标记物（如肌球蛋白、肌凝蛋白等）进行染色，观察细胞的染色情况，确定细胞的心肌细胞特异性。
3. 免疫细胞化学鉴定通过Western blot和免疫荧光染色等技术，对心肌细胞的标志性蛋白进行检测和鉴定，确保细胞的特异性。
三、大鼠心肌细胞的培养1. 细胞培养基的配制根据实验需要，配制适当的细胞培养基，为心肌细胞提供适宜的培养环境。
2. 细胞的培养将鉴定合格的大鼠心肌细胞转移到含培养基的培养皿中，放入细胞培养箱中进行培养，定期更换培养基，观察细胞的生长状态。
3. 细胞的传代当心肌细胞的密度适宜时，可以进行细胞的传代，将细胞分离并转移至新的培养皿中进行继续培养。
4. 细胞的应用经过培养的大鼠心肌细胞可以用于细胞生物学实验、药物筛选、毒性测试等领域的研究，为心血管疾病的研究提供重要的细胞模型。