人血管平滑肌细胞的原代培养及其钙化模型的建立
气道平滑肌细胞的原代培养14内毛...
摘要器官移植长期以来受到捐献数量不足以及移植排斥的影响，组织工程作为再生医学的重要工具，目的就是为了解决器官移植的不足。
然而传统组织工程使用生物可降解材料或注射细胞悬液的方法也有诸多不足，生物可降解支架的生物相容性需要验证，某些生物支架会造成植入部位附近组织发炎增生，生物可降解支架的降解也会引起炎症反应。
其次，支架降解会留下一定空间，而这些空间通常会被增殖的细胞以及大量的胞外基质填满，但是过多的胞外基质以及支架降解残留物又会造成组织纤维化，从而产生病变。
因此，研究者们创造出新的组织工程的方法来制备组织，即使用温敏性高分子材料制备温敏性细胞培养基底，并以此制备细胞片应用于组织工程中。
本文首先探讨气道平滑肌细胞的原代培养与鉴定，接着通过使用聚异丙基丙烯酰胺以普通细胞培养皿为基础制备温敏性细胞培养基底，并在其上培养气道平滑肌细胞，以观察温敏性培养基底对气道平滑肌细胞生长的影响以及其调控细胞的黏附行为，并通过温敏性培养基底制备气道平滑肌细胞片。
主要目的是掌握大鼠气道平滑肌的原代培养和鉴定以及温敏性细胞培养皿的制备工艺，并为将来更深层次的研究打下基础。
本文主要实验结论如下：①使用水和异丙醇作为溶剂制备异丙基丙酰胺溶液，结果发现以水作为溶剂的异丙基丙酰胺溶液经照射后无法达到温敏性培养基底的标准，原因是异丙基丙烯酰胺在水里的溶解度过低，通过聚合无法使异丙基丙烯酰胺与普通培养皿表面形成良好的共价连结。
②利用西南医院辐照中心γ射线以及四川原子能研究院电子加速器对涂覆有异丙基丙烯酰胺单体的普通细胞培养皿进行辐照。
结果发现，使用γ射线辐照能够制备聚异丙基丙烯酰胺水凝胶，但无法制备温敏性培养基底。
原因是γ射线辐照所需时间过长，导致溶剂异丙醇溶剂已挥发完全。
相反，电子加速器辐照则很好地解决了这个问题。
③以异丙醇为溶剂配制不同质量浓度比例40%，45%，50%，55%的异丙基丙酰胺溶液，结果发现45%质量浓度下制备的温敏性培养基底细胞黏附性最佳。
关于兔血管平滑肌细胞三维培养模型的建立
关于兔血管平滑肌细胞三维培养模型的建立作者：潘勇艾玉峰张琳西熊猛【关键词】血管平滑肌细胞关键词: 血管平滑肌细胞;三维培养;细胞培养/方法摘要:目的观察兔血管平滑肌细胞（VSMCS ）在三维培养系统中的生物学特性. 方法在兔主动脉中膜来源的VSM-CS 单层培养系统的基础上，将VSMCS 培养在胶原凝胶中，形成VSMCS 三维培养系统.并对细胞的形态结构、生长增殖及其影响因素进行研究. 结果①三维培养VSMCS 在凝胶形成后3～4h，形成多个细胞突起，呈星状.后继续伸展，呈梭形、纺锤形.②张力条件下，三维培养VSMCS 可呈一定的方向性排列.③三维培养VSMCS 与经典的单层培养相比，细胞活力无统计学差异.但细胞增殖受到一定程度的抑制. 结论运用VSMCS 三维培养系统不仅可以观察和研究细胞的形态结构、生长增殖等方面，还可研究在张力条件下的细胞生物学特征，对组织工程化血管的研究将产生积极的影响.Keywords:vascular smooth muscle cell;three-dimensional culture;cell culture/methodsAbstract:AIM To study the biologic characteristics of rab-bit vascular smooth muscle cell（VSMCS ）cultured in“three-dimensional”cell culture system.METHODS Based on the monolayer cell culture system，we resuspended VSMCS de-rived from the media of arterial wall in a solution of polymer-izing collagen to develop a“three-dimensional”cell culture system.In this system，we studied the morphology，growth，proliferation and metabolism of VSMCS ，and the shape and arrangement of VSMC influenced by retraction of thesub┐strate.RESULTS ①After VSMCS were cultured in“three-dimensional”cell culture system for3～4hours，they formed many cell prominences.With cells extending，the shape of the cells changed from star to shuttle or spindle.②Under the conditio n of tension，VSMCS cultured in“three-dimensional”cell culture system took ondirectionally specific arrange-ment.③In contrast to the monolayer cell culture system，the livingness of VSMCS cultured in“three-dimensional”cell cul-ture system had no statistical difference，but collagen re-strained cell proliferation.CONCLUSION VSMCS “three-di-mensional”culture system will have a positive effect on the study oftissue-engineering vessel.0 引言血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCS ）位于动脉壁中膜，它对管壁的完整性和调节血管的紧张性起着重要作用.在经典的单层培养系统中，VSMCS 离开了在体内与细胞外基质共同构成的三维立体生长环境，因而所表现出的生物学特性与在体状态存在较大的差异.我们在VSMCS 单层培养的基础上，将兔主动脉VSMCS 置于胶原凝胶中，使其在体外与细胞外基质形成一个整体，观察其在三维状态下的生物学特征，为构造结构和功能与在体血管中膜相似的中膜组织，最终形成组织工程化血管提供实验依据.1 材料和方法1.1 VSMCS 培养 VSMCS 来自新西兰大耳白雄性家兔，体质量2.0～2.5kg（由本校实验动物中心提供）.30～40mg・kg-1 戊巴比妥钠静脉麻醉后，在无菌条件下，迅速将主动脉自胸腔取出，放入盛有D-Hanks液的平皿中.清洗凝血块，剥除外膜，将血管翻转使内膜面朝外，用刀片自上而下刮1～2遍，去除血管内皮细胞.然后用显微镊撕下血管中膜的平滑肌层，用显微剪将其剪碎（0.5～1mm3 ），接种于培养瓶中，在950mL・L-1 空气，50mL・L-1 二氧化碳，37℃，饱和湿度条件下放置2.5～3h，使组织块较牢固地粘附于瓶壁，加入含200mL・L-1 新生牛血清（Hyclone公司）的DMEM（Dulbecco’s modified minimal essential medium，Gibco公司）培养液，3～4d更换含100mL・L-1 新生牛血清的DMEM培养液1次.细胞生长形成致密单层时，细胞呈典型的峰-谷样表现（Fig1）.此时可用1.25g・L-1 胰蛋白酶（Sigma公司）消化，按1∶2比例分种传代培养，5～6d可继续分种传代1次.VSMCS 行α-激动蛋白抗体（中山公司）SABC法免疫组化染色鉴定（Fig2）.实验采用第2～4代细胞进行研究.1.2 胶原制备［1］实验所用胶原溶液为可溶性鼠尾腱胶原，其主要成分为I 型胶原.将体质量200～250g的SD大鼠尾部剪下，浸入70mL・L-1 乙醇溶液中，20min后在无菌条件下抽出尾腱并将其剪碎，置入0.5mL・L-1 的醋酸溶液中（约150mL/尾），在4℃条件下不时搅拌.48h后离心（10000r・min-1 ，11000g，LG10-2.4A，北京医用离心机厂）约1.5h，去渣.上清液用100g・L-1 NaCl溶液盐析，最后将沉淀的蛋白质溶于4℃1mmol・L-1 的HCl溶液中备用.Lowry法测定蛋白浓度为4g・L-1 .1.3 VSMCS 三维培养系统的建立［2］将第2～4代指数生长期VSMCS 用1.25g・L-1 胰蛋白酶消化，调整细胞悬液浓度为5×109 个・L-1 .按细胞悬液2V∶新生牛血清1V∶5×DMEM液2V∶胶原溶液5V的比例，4℃条件下将四种成分快速混匀，加入数滴1mol・L-1 NaOH调pH值至中性（培养液中酚红指示），形成VSMCS -胶原混悬液，并立即将该混悬液移入6孔培养板（Nunc公司）内，0.5mL/孔，置37℃培养箱内10min，混悬液即形成凝胶状，即VSMCS 三维培养系统.每孔加入2mL含100mL・L-1 新生牛血清的DMEM液，3d换液1次.1.4 观察指标①细胞形态学观察:在含VSMCS 凝胶块形成后4，12，24，48，72h和1wk时，在倒置显微镜下观察凝胶块中VSMCS 形态学的改变.将培养24h的凝胶块经30mL・L-1 戊二醛原位固定、脱水、干燥、喷金行S-2700型扫描电镜（HITACHI公司，西安交通大学电镜室）观察.②张力条件下的细胞形态学改变:在上述的VSMCS 三维培养24h后，用无菌注射器针尖轻轻将凝胶块与培养皿的周边部分分离，使胶原收缩并漂浮在培养液中，保持凝胶块的中心部分在整个培养过程中都贴附在培养皿的底部.在倒置显微镜下观察张力条件下凝胶块中VSMCS 形态学变化.③活细胞染色及细胞计数:将用MTT（四甲基偶氮唑，Gibco公司）配成的染液适量滴入培养液中，4h后，MTT被细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶还原成难溶性的蓝紫色结晶物，沉积在细胞内或细胞周围，使活细胞显蓝黑色，而死亡细胞则不着色.在倒置显微镜下逐个计数细胞，并以活细胞的百分率表示细胞活力（即每视野100个细胞的活细胞数）.胶原凝块用细菌胶原酶（4g・L-1 ，Sigma公司）消化成细胞悬液，用血球计数板在镜下行细胞计数.④统计学分析:所得资料应用t检验进行比较分析.2 结果2.1 三维培养的VSMCS 形态含VSMCS 的胶原网形成时呈透明状态，凝胶化后变得不透明，并形成可被握持的凝胶块，粘附在培养皿的底部及四壁上.在倒置相差显微镜下，可清楚地看到各个层次的细胞及其形态.VSMCS 在凝胶中的位置固定，并分布于不同的层次，说明此时VSMCS 已经粘附在胶原支架上.约3～4h，呈圆形的VSMCS 表面逐渐伸展延长，形成多个胞质突起，呈星状（Fig3），表明VSMCS 已开始与胶原纤维发生粘着.扫描电镜下可见VSMCS 的胞质突起粘附在呈无续网状分布的胶原丝上（Fig4）.随时间推移，胞质突起继续伸展，部分细胞呈现梭形、纺锤形（Fig5）. 2.2 张力作用下的细胞形态学改变在凝胶与培养皿壁分离前，细胞生长无一定的方向性.当凝胶与培养皿壁分离时，凝胶块发生收缩，方向朝向中心部，在分离的瞬间，VSMCS 的胞质突起消失.随着时间的延长，细胞又逐渐出现胞质突起，但周边漂浮的凝胶块中的VSMCS 与贴附于器皿底的凝胶块中心中的细胞出现了不同的形态:周边部细胞以梭形、纺锤形，呈同心圆环状生长（Fig6）;中心部细胞生长与分离前无大的差异.伴随凝胶块的收缩，两部位的平滑肌细胞均变得愈加致密.有时互相交织呈网络.2.3 细胞的活力与增殖 VSMCS 在胶原形成的基质中培养10d后，观察细胞的形态学改变和细胞计数结果表明:胶原凝胶中细胞数无增加.说明在三维培养系统中，VSMCS 并未出现增殖现象.同时MTT染色结果表明:三维培养的VSMCS 能够保持足够的活力（86±5，n=10）.与10d前接种当日（90±3，n=10）相比较，细胞活力无显著性差异.3 讨论VSMCS 的体外培养始于20世纪70年代［3］ .它将血管中膜的VSMCS 从体内复杂的影响因素中分离，并置于一定控制因素的直接作用下，连续、直接地观察和研究活细胞的形态结构、细胞活动、生长增殖、物质代谢及其影响因素.然而，单层培养系统中的细胞呈二维方式生长，VSMCS 脱离了在活体状态下与细胞外基质共同构成的连续整体.近年来，大量研究表明，细胞外基质不仅在维持组织结构方面发挥重要作用，而且具有重要的生物学特性.细胞与细胞外基质相互依存，相互作用，才能维持细胞的正常形态，进行正常的代谢，增殖、分化、迁移及信号传递［4］ .因此，将VSMCS 培养在胶原这种细胞外基质成分中，使之构成一个整体，在模拟活体血管组织的环境中表达各种生物学特性，使体外研究结果能更加真实地反映体内情况，结果也必定具有更为重要的参考价值.图1 －图6 略胶原是细胞外基质最基本的结构，它以支架形式为细胞和其他细胞外基质成分提供结合部位.鼠尾腱胶原在结构和抗原性方面与人体组织的I型胶原基本相同，它的来源广泛，成分较为单一，制备较方便，VSMCS 在该基质中能长时间地保持活力，故被选用作为培养基质.VSMCS 的形态学变化充分反应了细胞与胶原纤维相互作用的过程.在早期，由于纤维排列的多向性，VSMCS 的胞质沿纤维运动并产生多向性突起，使细胞呈星状.随着两者的相互作用，纤维发生改构，其排列逐渐由多向性转变为单向性，VSMCS 的胞质突起也随之表现为双极性，细胞呈梭形，较单层培养系统中的细胞更具立体感.同时，在三维系统中，尽管存在血清的刺激作用，但因VSMCS 受到胶原基质的抑制作用，所以生长增殖为相对静息状态.含VSMCS 的胶原网架在一定浓度血清存在时可发生收缩反应［5-7］ .我们利用凝胶块的周边部分漂浮并发生收缩，使周围游离开的部分向中心聚集，产生张力作用.结果VSMCS 排列方向与此张力作用的方向垂直，表明细胞外基质的收缩影响了VSMCS 的形状和排列;VSMCS 的形状和排列与其所受的张力的方向存在密切关系.国内有关三维培养系统的研究，多运用成纤维细胞，而国外细胞外基质多采用纯化Ⅰ型胶原，关于以鼠尾胶为支架的VSMCS 三维培养研究未见报道.应用三维细胞培养系统研究VSMCS 生物学行为具有良好的临床应用价值.由于这一系统可以将细胞、细胞外基质以及参与血管形成过程的一些调控因素如激素、生长因子、各种药物等构成一个有机整体，从而使实验结果能更加真实地反映活体血管组织中膜的生物学特性，所以这一培养系统的应用和发展对组织工程化血管的研究将产生积极的影响.参考文献［1］Montesano R，Orci L.Tumor promoting phorbol esters induce angiogenesis in vitro ［J］.Cell，1985;42（2）:469-477.［2］Yang L，Lu KH，Wang Q，Ai YF，Wang SC.Three-dimensionculture of scar-derived fibroblasts in human skin collagen ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1998;19（5）:588-589.［3］Wang H，Liu B，Fu M.Primary-explant method of culturing human arterial smooth muscle cells ［J］.Hua Hsi I Ko Ta Hsueh Hsueh Pao，1995;26（1）:105-108.［4］Friedl P，Brocker EB.The biology of cell locomotion within three-dimensional extracellular matrix ［review］［J］.Cell Mol Life Sci，2000;57（1）:41-64.［5］Stadler E，Campbell JH，Campbell GR.Do cultured vascular smooth muscle cells resemble those of the artery wall?If not，Why not ［J］?J Cardiovasc Pharmacol，1989;14（Suppl）:1-8.［6］Song J，Rolfe BE，Campbell JH，Campbell GR.Changes in three-dimensional architecture of microfilaments in cultured vas-cular smooth muscle cells during phenotypic modulation ［J］.Tissue Cell，1998;30（3）:324-333.［7］Thie M，Schlumberger W，Semich R，Rauterberg J，RobenekH.Aortic smooth muscle cells in collagen lattice culture:Ef-fects on ultrastructure，proliferation and collagen synthesis ［J］.Eur J Cell Biol，1991;55（2）:295-304.。
体外培养血管平滑肌细胞的同步方法
清 楚 ，但揭示 Ｖ ＭＣ增 生 或 增 殖 的信 号 通 路 具 有重 ０ ０ ｌＬＰ Ｓ ｐ ７ ２ 清洗 ５ｍｎＸ Ｓ ． １ｍｏ Ｂ （ Ｈ ． ） ／ ｉ ３次；用 ９０ｍＬ Ｌ无水 ５ ／ 要 意义 ， 增 殖信 号转 导 最 终 的共 同通 路 是 细 胞 周 乙醇室温下 固定 ２ ｉ ， 而 ０ｍ ｎ 同上清洗 ；１０ｍＬ Ｌ正常 山羊 血清 ０ ／ 期 进展 … 。 因此 ，研 究 细胞 周 期 与 Ｖ ＭＣ之 间 的 关 封闭液 ，湿盒 内温 育 ３ ｎ Ｂ 洗 ；加１ １０（ 鼠抗大 Ｓ ０ｍｉ，Ｐ Ｓ清 ：０ 小 系 ， 立有 效 的能将 Ｖ ＭＣ同步 各 个 细胞 周 期 阶段 ， 建 Ｓ 对 于揭 示动 脉 粥样 硬 化 的发病 机 制 具 有 重 要 的指 导 作 用 。 以往 一直 着力 于 Ｖ ＭＣ增 殖方 面 的研 究 ’ ， Ｓ
０／ ６孔培养板 中， 按不 同分组分别加 ２０Ｉ ０ Ｌ Ｌ 饿法 同步 Ｇ／ ０Ｇ 期 ’ ， 而对 于 Ｇ／ ｌＳ期 、Ｓ期 、Ｇ／ １ 孔 接种 细胞 于 ９ ２Ｍ
期 的 同步 效 果 尚未见 报 道 ，我 们 通 过 原 代 培 养 的 大 鼠 Ｖ ＭＣ， 用胸 苷 、秋 水仙 素 同步化 ，寻 找 同 步方 Ｓ 采 法 的最佳 条件 ，利 用 流 式 细 胞 术 （ Ｃ 测 定 其 同 步 Ｆ Ｍ） 效果 ， 分析 在不 同细 胞周 期 中 Ｖ ＭＣ的 Ｄ Ａ含 量 情 Ｓ Ｎ 况 ，为冠 状动 脉 粥 样 硬 化 的发 病 机 制 的研 究 提 供 实
体外 培 养 血管 平 滑肌 细 胞 的 同步 方 法
原代细胞培养
二、实体组织材料的分离方法
• 实体组织细胞间结合紧密，为了使组织中的细 胞充分分散，形成细胞悬液，可采用： • （一）机械分散法 • （二）消化分离法
（一）机械分散法
• 适用组织：纤维成分少的软组织。如脑组织，部 分胚胎组织 • 方法： • 采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞 • 将已充分剪碎分散的组织放在注射器内使细胞通 过针头压出 • 在不锈钢网内用钝物压挤使细胞从网孔中压挤出。 • 特点：简便、快速，但对组织机械损伤大，而且 细胞分散效果差。
细胞培养之
---原代细胞的培养
基本概念
• 来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方 法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。 • 能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞 系。
• 经单细胞克隆、纯化，大量扩增后所形成的生物 学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株。
原代细胞的培养
• 原代细胞的培养是从供体取得组织细胞在体外
第二节 原代细胞的分离和制作
• 一、悬浮细胞的分离方法 • 组织来源：血液、羊水、胸水或腹水 • 方法：1000r/min的低速离心10 min→沉淀用 无钙、镁PBS洗两次，培养基洗一次→调整适 当细胞浓度→分瓶培养 • 若选用悬液中某些细胞，加入细胞分层液，经 离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中 形成不同层。 • 如：淋巴细胞分离
注意事项
• （1）组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、 镁离子和血清对胰酶和EDTA的抑制作用。
• （2）胰酶浓度不宜过高，作用时间不能太长， 以避免毒性作用。 • （3）消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以 避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的 细胞随漂洗而丢失。
第三节 原代细胞的培养方法
气道平滑肌原代培养实验设计
气道平滑肌原代培养实验设计气道平滑肌是呼吸系统中的重要组成部分，其中包括气管、支气管和肺泡等结构。
气道平滑肌的异常收缩和松弛与许多呼吸系统疾病如哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等有关。
为了研究气道平滑肌的功能和调控机制，可以进行气道平滑肌原代培养实验。
实验目的：1.建立气道平滑肌原代培养模型。
2.研究气道平滑肌的功能及其调控机制。
实验材料：1.健康人的气道组织样本。
2.气道平滑肌细胞培养基。
3.酶消化液（如胰蛋白酶和DNA酶）。
4.培养皿、离心管、离心机、显微镜等实验仪器和耗材。
实验步骤：1.收集健康人的气道组织样本，并迅速将样本转移至含有冷平衡无菌PBS（磷酸盐缓冲液）的离心管中。
2.将气道组织样本在冰上快速剁碎，然后用酶消化液消化组织块，以获得气道平滑肌细胞。
3.将消化得到的细胞悬浮液经过离心分离，去除上清液。
收集沉淀的气道平滑肌细胞。
4.将气道平滑肌细胞转移至含有培养基的培养皿中，用显微镜观察细胞形态和数量。
5.将培养皿放入恒温培养箱中，保持温度、湿度和CO2浓度适宜的条件，进行细胞培养。
6.定期观察细胞的生长状态和形态，并更换培养基。
7.可以进行细胞增殖、侵袭和迁移等功能实验，以研究气道平滑肌的功能。
8.可以添加不同的生物活性物质或药物，并观察其对气道平滑肌的影响。
9.可以进行蛋白质或基因的表达分析，以研究气道平滑肌的调控机制。
实验注意事项：1.实验过程中需要保持无菌操作，以避免细菌或其他污染物的存在。
2.实验室工作人员需要穿戴好防护服和手套，以避免对自身和实验样本的污染。
3.实验室应具备恒温培养箱、培养皿、离心机、显微镜等实验仪器和耗材。
4.培养基的配制需要严格按照相关实验方法和要求进行。
5.实验过程中需要注意细胞的生长状态和形态，并定期更换培养基以维持细胞的正常生长。
气道平滑肌原代培养实验是研究气道平滑肌功能和调控机制的重要手段。
通过建立气道平滑肌原代培养模型，可以模拟体外条件下气道平滑肌的生长和功能特性，为深入研究呼吸系统疾病的发生机制和寻找治疗方法提供重要依据。
气道平滑肌原代培养实验设计
气道平滑肌原代培养实验设计在本实验中，我们旨在培养和研究气道平滑肌的原代培养模型。
为了成功进行这一实验，我们需要按照以下步骤进行实验设计。
1. 器材准备：- 细胞培养皿：选择适合培养气道平滑肌的细胞培养皿，如培养瓶或多孔板。
- 细胞培养基：选择适合气道平滑肌细胞生长的培养基，如DMEM/F12基础培养基。
- 细胞分离试剂：选择合适的消化酶（如胰蛋白酶）和抗生素/抗菌药物来分离和培养气道平滑肌细胞。
2. 细胞来源：- 来源选择：根据实验需求，选择适合的组织来源获取气道平滑肌细胞，如人类气道组织或动物模型。
- 组织处理：将组织进行机械剪切或酶消化以释放细胞，然后通过过滤或离心分离来获得单个细胞。
3. 细胞培养：- 接种细胞：将获得的气道平滑肌细胞悬浮在适当的培养基中，并根据需要调整细胞浓度。
- 培养条件：将细胞培养在37°C恒温培养箱中，添加5%二氧化碳以提供合适的培养条件。
- 细胞培养基更新：每2-3天更换培养基，以保持适当的营养供应和细胞健康。
- 细胞观察和细胞增殖：使用显微镜观察细胞形态，并记录细胞增殖情况。
4. 刺激试验：- 药物处理：根据实验设计，向培养基中添加不同的刺激物，如药物或生物因子。
- 反应观察：根据实验目的，观察细胞对刺激物的反应，记录并分析相关数据。
5. 实验数据采集和分析：- 数据记录：记录实验过程中的各项观察结果，包括细胞形态、生长状况和反应情况等。
- 数据分析：对实验数据进行统计学分析，如均值、标准差和相关性等。
- 结果解释：根据数据分析结果解释实验结果，并将其与已知文献或其他实验结果进行对比。
通过以上实验设计，我们可以建立气道平滑肌原代培养模型，并对其进行进一步研究和探索。
这将有助于我们更好地了解气道平滑肌的生物学功能和相关疾病的发生机制，从而为新药研发和临床治疗提供有价值的参考。
血管外膜细胞钙化及其钙化机制研究
血管外膜细胞钙化及其钙化机制研究谭小青,张旭升,樊小容,黄战军摘要 目的:研究经体外诱导钙化建立大鼠血管外膜细胞钙化模型,检测钙化过程中成骨相关指标及凋亡㊁自噬相关蛋白的表达变化,旨在为心血管疾病模型提供更精确的细胞模型,并初步探讨其钙化机制㊂方法:原代提取大鼠胸主动脉外膜纤维细胞,取3~6代细胞使用诱导培养基(高糖DMEM +10%胎牛血清+10mmol/L β-甘油磷酸+0.05mmol/L 抗坏血酸+100mmol/L 地塞米松)诱导钙化,诱导时间为3d ㊁6d ㊁9d ㊁12d ㊁15d ,筛选出诱导细胞钙化的最佳时间㊂对细胞采用茜素红S 染色㊁细胞内钙含量测定和碱性磷酸酶(ALP )活性检测,鉴定是否成功构建钙化模型㊂采用实时定量聚合酶链式反应(PT -PCR )检测成骨相关因子骨形态生成蛋白2(BMP2)和核心结合因子α1(Runx2)的mRNA 含量,蛋白免疫印迹法(Western Blot )检测凋亡蛋白Bax ㊁Bcl -2和自噬相关蛋白微血管相关蛋白(LC3)㊁Beclin -1的表达水平,找出血管外膜细胞钙化的潜在机制㊂结果:当诱导钙化时间为15d 时,血管外膜细胞中主要钙化指标胞内钙含量及ALP 活性上调(P <0.05),茜素红S 染色显示钙化组有明显钙盐沉积㊂血管外膜细胞经钙化诱导后,BMP2和Runx2的mRNA 水平上调,Bax 蛋白水平上调,Bcl -2和Beclin -1蛋白水平下调,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值上调(P <0.05)㊂结论:钙化诱导培养基培养血管外膜细胞15d 可成功构建钙化细胞模型,血管外膜细胞钙化可能与细胞向成骨样表型转化有关,血管外膜细胞钙化过程涉及细胞自噬及凋亡调控㊂关键词 血管外膜细胞;钙化;成骨样表型转化;自噬与凋亡;实验研究d o i :10.12102/j.i s s n .1672-1349.2023.18.010 Calcification of Vascular Adventitial Cells and Its MechanismTAN Xiaoqing,ZHANG Xusheng,FAN Xiaorong,HUANG Zhanjun Longgang District People 's Hospital of Shenzhen,Shenzhen 518172,Guangdong,China Corresponding Author ZHANG Xusheng,E -mail:*****************Abstract Objective:To investigate the mananism of calcification of rat vascular adventitial cells,establish the calcification model of rat vascular adventitial cells,and detect the expression changes of osteogenesis -related indicators,apoptosis,and autophagy -related proteins during the calcification process.It aimed to provide more accurate cell models for cardiovascular disease and initially explore the mechanism of calcification.Methods:Rat thoracic aortic adventitial fibroblasts were extracted from the primary generation,and the 3rd to 6th generation cells were used for induction medium(high glucose DMEM +10%fetal bovine serum +10mmol/L β-glycerophosphate +0.05mmol/L ascorbic acid +100mmol/L dexamethasone)to induce calcification,the induction time was 3,6,9,12,and 15d,and the optimal time for inducing cell calcification was selected.The cells were stained with alizarin red S,detected by intracellular calcium content and alkaline phosphatase(ALP)to identify whether the calcification model was successfully constructed.Real -time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT -PCR)was used to detect the mRNA levels of osteogenesis -related factors bone morphogenetic protein(BMP2)and runt -related transcription factor 2(Runx2);Western Blot was used to detect the apoptosis proteins Bax,Bcl -2,the autophagy -related proteins LC -3,and Beclin -1expression level;then the potential mechanism of vascular adventitial cell calcification would be revealed.Results:When calcification was induced for 15days,the intracellular calcium content in the adventitial cells of the main calcification indicators and ALP activity were up -regulated(P <0.05).Alizarin red S staining showed obvious calcium deposits in the calcification group.After calcification was induced in adventitial cells,the mRNA levels of BMP2and Runx2up -regulated,the protein levels of Bax up -regulated,the protein levels of Bcl -2and Beclin -1down -regulated,and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰdown -regulated(P <0.05).Conclusion:Adventitial cells cultured in the calcification -inducing medium for 15days could successfully construct a calcified cell model.calcification of adventitial cells might be related to the transformation of cells to an osteoblast -like phenotype.The Calcification process of adventitial cells involved autophagy and apoptosis regulation.Keywords adventitial cells;calcification;osteogenic phenotype transformation;autophagy and apoptosis;experimental study血管钙化常见于动脉粥样硬化㊁血脂异常㊁高血压㊁糖尿病㊁慢性肾病及衰老等人群[1],血管钙化引起血管硬度增加㊁顺应性降低,导致心肌缺血㊁心力衰竭㊁血栓形成等,增加脑卒中㊁心脏病㊁动脉粥样硬化斑块破裂等的风险,被认为是影响心血管疾病的重要因素之一[2-4]㊂目前关于血管内膜㊁中膜和心脏瓣膜钙化的关注和研究相对较多㊂临床工作中发现,血管外膜也可发生钙化,然而调查发现,现阶段对血管外膜钙化的作者单位 深圳市龙岗区人民医院(广东深圳518172)通讯作者 张旭升,E -mail :*****************引用信息 谭小青,张旭升,樊小容,等.血管外膜细胞钙化及其钙化机制研究[J ].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(18):3347-3350.关注较少,因此,需要更多的研究来阐明血管钙化的致病机制㊂最初血管钙化被认为是被动和退行性病变,标志着血管老化,但是越来越多研究表明血管钙化是类似于胚胎骨形成的病理生物学过程[5-6]㊂Bostr öm 等[7-8]研究发现,钙化过程中大鼠血管中膜细胞由原有收缩表型转变成为成骨样细胞表型,原有的收缩标志物如平滑肌肌动蛋白α(α-SMA )等表达减少,并表达核心结合因子α1(Runx2)㊁骨形态生成蛋白2(BMP2)等多种成骨样标志物,从而介导骨基质在血管中沉积㊂细胞凋亡与自噬为2种细胞死亡的方式,与血管钙化息息相关,研究表明,血管中膜细胞在细胞凋亡过程中释放凋亡小体,促进细胞钙化,而细胞自噬通过多种机制调控细胞钙化[9-10]㊂本研究对大鼠血管外膜细胞进行体外诱导钙化,建立大鼠血管外膜细胞钙化模型,并检测钙化过程中成骨相关指标及凋亡㊁自噬相关蛋白的表达变化,旨在为心血管疾病模型提供更精确的细胞模型,并初步探讨其钙化机制㊂1材料与方法1.1试剂胎牛血清(FBS,Gibco),青霉素,链霉素(Gibco,美国),茜素红S溶液,β-甘油磷酸,抗坏血酸,地塞米松(Sigma,美国),抗GAPDH抗体(Bioworld),抗Bcl-2, Bax,Bcelin1和微血管相关蛋白(LC3)抗体(CST),碱性磷酸酶检测试剂盒㊁钙(Ca)检测试剂盒(南京建城生物工程研究所)㊂1.2大鼠血管外膜细胞分离与培养取10只4~6周龄雄性Wistar-Kyoto大鼠(体质量120~180g)胸主动脉分离血管外膜,采用组织黏附法培养㊂使用添加10%胎牛血清的高糖DMEM培养基(Gibco dmem)在37ħ㊁5%二氧化碳条件下培养细胞㊂当细胞增殖至80%~90%融合时,用0.25%胰酶消化传代㊂使用第3代至第6代的细胞进行后续实验㊂1.3体外钙化模型的建立钙化诱导培养基为含10%胎牛血清,10mmol/L β-甘油磷酸钠,0.05mmol/L抗坏血酸和100mmol/L 地塞米松的高糖DMEM培养液㊂将第3代至第6代细胞分为对照组和钙化组,待细胞长至50%融合时,使用钙化诱导培养基培养,每3d更换1次培养基,连续培养15d㊂1.4碱性磷酸酶(ALP)酶活测定细胞钙化诱导后,弃去培养基,1ˑ磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗细胞3次,加入裂解液500μL(1%T ritonX-100),冰上裂解40min后,离心,取上清液㊂使用上清液根据试剂盒说明书检测ALP活性及总蛋白含量㊂1.5细胞内钙含量检测细胞钙化诱导后,弃去培养基,1ˑPBS洗细胞3次,每孔加入500μL0.6mol/L的盐酸4ħ脱钙过夜,取上清,根据钙测试试剂盒说明书检测钙含量㊂将脱钙后的细胞用4ħPBS洗3次,每孔加入500μL NaOH/0.1%SDS裂解细胞,取上清,用二喹啉甲酸法(BCA)测定细胞蛋白含量㊂1.6茜素红S染色细胞钙化诱导15d,弃去培养基,1ˑPBS洗细胞3次,加入0.5mL4%多聚甲醛室温固定15min,用双蒸水洗3次,加入1mL0.1%茜素红室温孵育15min,吸去染液,双蒸水洗3次,在倒置显微镜下观察㊂1.7实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)检测细胞钙化诱导后,弃去培养基,1ˑPBS洗细胞3次,使用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取总RNA,使用PrimeScrip TM RT reagent Kit将所提取的RNA逆转录合成cDNA,以cDNA为模板,通过SYBR Green I嵌合荧光定量RT-PCR检测BMP-2㊁Runx2和GAPDH的表达量㊂引物序列见表1㊂表1引物序列基因方向序列Runx2正向5'-TGGCTTTGGTTTCAGGTTAGG-3'反向5'-TGGAGATGTTGCTCTGTTCG-3' BMP-2正向5'-TGAGGATTAGCAGGTCTTTGC-3'反向5'-TCTCGTTTGTGGAGTGGATG-3' GAPDH正向5'-GGCTGCCCAGAACATCAT-3'反向5'-CGGACACATTGGGGGTAG-3'1.8蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞钙化诱导15d,弃去培养基,1ˑPBS洗细胞3次,提取细胞总蛋白㊂使用12%SDS-PAGE胶电泳分离,并转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,封闭后,加入一抗(Bax1ʒ1000,Bcl-21ʒ1000,Beclin11ʒ1000, LC31ʒ1000,GAPDH1:1000)稀释液,4ħ孵育过夜;加入二抗稀释液(1ʒ10000)室温孵育1h后,使用ECL发光试剂盒显影并计算灰度值㊂1.9统计学处理应用SPSS19.0软件进行统计处理,符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示,比较采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1大鼠血管外膜细胞可在体外被诱导钙化为验证高磷是否能诱导大鼠血管外膜细胞钙化,使用钙化诱导培养基培养细胞,在不同时间点检测ALP活性和胞内钙含量㊂随着培养时间延长,ALP活性逐渐上升,在培养第12天达到峰值,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);诱导第3天开始所测得的胞内钙含量与对照组比较升高(P<0.05),ALP 活性和钙含量升高具有时间依赖性㊂详见图1㊁图2㊂诱导15d所测得钙含量最高,因此,后续实验选择的诱导时间为15d㊂对钙化诱导15d的细胞进行茜素红S染色,结果显示,对照组细胞呈长梭形,而钙化组细胞变成菱形㊂茜素红S染色后,钙化组可观察到大量的橘红色钙结节(见图3),而对照组完全没有㊂这也证明大鼠血管外膜细胞可在体外被钙化培养基诱导钙化㊂图1钙化诱导培养基诱导外膜细胞后ALP含量(与0d时比较,*P<0.05)图2钙化诱导培养基诱导外膜细胞后胞内钙含量(与0d时比较,*P<0.05)图3培养15d时细胞经茜素S红染色切片图(ˑ100)2.2血管外膜细胞钙化与细胞向成骨样表型转化有关血管钙化的增加与成骨细胞特异性标志物如BMP2㊁和Runx2的增加有关[11]㊂RT-PCR结果显示,与对照组比较,钙化组的成骨细胞特异性标志物BMP2和Runx2mRNA表达量增加,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)㊂详见图4㊂图4外膜细胞钙化过程中BMP2和Runx2mRNA表达量(与对照组比较,*P<0.05)2.3血管外膜细胞钙化过程涉及细胞自噬及凋亡调控通过Western Blot检测凋亡和自噬相关蛋白的表达量变化㊂与对照组比较,钙化组促凋亡蛋白Bax表达上调,抑凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P<0.05)㊂详见图5㊂钙化组自噬相关蛋白Beclin1表达上调,LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比例上调(P<0.05),说明钙化诱导培养后细胞内凋亡水平上调㊁自噬水平升高㊂详见图6㊂图5诱导钙化后促凋亡蛋白及抑凋亡蛋白表达变化图6诱导钙化后凋亡及自噬蛋白Beclin1等表达变化3讨论血管钙化作为心血管疾病病人的并发症之一,其发病率与严重程度逐年增高及加重,是导致心血管疾病病人高死亡率的重要因素㊂血管钙化缺乏有效的治疗药物㊂因此,探究血管钙化发病机制,在分子水平寻找有效的诊断和防治靶点是急需开展的基础研究工作㊂本研究证明,使用10mmol/Lβ-甘油磷酸+0.05 mmol/L抗坏血酸+100mmol/L地塞米松培养外膜细胞即可诱导大鼠血管外膜细胞在体外发生钙化,这是通过茜素红S染色㊁ALP活性检测及胞内钙含量检测结果得以确定的㊂血管钙化过程中,血管中膜细胞向成骨样细胞表型转变并表达相关成骨标志物,从而引起骨基质的沉积,是血管钙化的重要特点及机制[5]㊂本实验所用的血管外膜细胞钙化条件与血管中膜细胞钙化条件一致,说明血管外膜细胞钙化的机制可能与中膜细胞钙化的机制部分一致㊂血管中膜细胞钙化过程中,细胞表达成骨相关的转录因子如Runx2等,进而促进下游表达骨相关蛋白如骨形态发生蛋白BMP2等的表达,从而促使细胞向成骨样细胞主动分化[12-13],本研究也观察到类似的机制㊂通过PT-PCR检测,发现钙化培养基培养大鼠血管外膜细胞15d后,BMP2和Runx2的mRNA表达水平升高㊂本研究通过对钙盐沉积与成骨样细胞表型转变2个维度的探讨,证明血管外膜细胞可在体外被诱导钙化,丰富了血管钙化的分型㊂血管钙化的发生机制复杂,涉及多种信号通路,如细胞自噬和凋亡㊁Wnt/β-catenin信号通路激活㊁内质网应激等均参与调控血管钙化的过程㊂自噬作为一种细胞应激的适应性反应,在维持血管结构与功能中十分关键㊂研究表明,血管钙化过程中自噬水平增高[14-15]㊂在体外实验中,高磷可提高大鼠血管中膜细胞的自噬水平,增加细胞内自噬体数量,从而抑制凋亡与钙化[16]㊂还有研究表明,自噬可通过抑制大鼠血管中膜细胞氧化应激,抑制血管内皮细胞的炎症反应,对三酰甘油等脂代谢进行调控,从而减轻血管钙化[17-18]㊂LC3和Beclin1是2种典型的自噬标志物,Western Blot实验结果表明,用钙化培养基诱导大鼠血管外膜细胞15d,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率升高,Beclin1蛋白水平表达升高,说明细胞内自噬水平升高㊂多项研究表明,细胞凋亡参与促进血管钙化的发生,抑制细胞凋亡和抑制钙化[16-17]㊂在对大鼠的体内研究发现,成纤维细胞生长因子21通过内质网应激调控Caspase-12信号通路来减少血管内中膜细胞凋亡,从而抑制血管钙化[18]㊂另外,提高培养基中的Pi 或Ca2+浓度,可诱导细胞质膜形成并释放基质囊泡(如凋亡小体),从而导致细胞外基质钙化,这种基质钙化可能成为血管钙化的成核位点[19]㊂Bax和Bcl-2是2种典型的凋亡和抑制凋亡蛋白,本实验结果证明,利用钙化培养基对血管外膜细胞诱导钙化过程中,细胞内凋亡水平升高㊂同时细胞内自噬水平也升高,这可能是细胞自我调控以对抗钙化的结果㊂本研究证实血管外膜细胞可在体外被诱导钙化,且外膜钙化过程与骨组织钙化过程类似,为主动可调控的过程㊂血管钙化是一个复杂的过程,涉及细胞凋亡和自噬等调控通路,仍需进一步研究㊂参考文献:[1]梁英权,段亚君,韩际宏.血管钙化分子机制研究进展[J].中国动脉硬化杂志,2020,28(11):921-929.[2]NICOLL R,HENEIN M Y.The predictive value of arterial andvalvular calcification for mortality and cardiovascular events[J].Int J Cardiol Heart Vessel,2014,3:1-5.[3]JOHNSON R C,LEOPOLD J A,LOSCALZO J.Vascularcalcification:pathobiological mechanisms and clinical implications[J].Circulation Research,2006,99(10):1044-1059.[4]YAMADA S,GIACHELLI C M.Vascular calcification in CKD-MBD:roles for phosphate,FGF23,and Klotho[J].Bone,2017,100:87-93.[5]LIN M E,CHEN T M,WALLINGFORD M C,et al.Runx2deletion insmooth muscle cells inhibits vascular osteochondrogenesis andcalcification but not atherosclerotic lesion formation[J].Cardiovascular Research,2016,112(2):606-616.[6]DURHAM A L,SPEER M Y,SCATENA M,et al.Role of smoothmuscle cells in vascular calcification:implications in atherosclerosis andarterial stiffness[J].Cardiovascular Research,2018,114(4):590-600.[7]BOSTRÖM K I,RAJAMANNAN N M,TOWLER D A.The regulationof valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens[J].Circulation Research,2011,109(5):564-577.[8]SPEER M Y,YANG H Y,BRABB T,et al.Smooth muscle cells giverise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes incalcifying arteries[J].Circulation Research,2009,104(6):733-741.[9]PROUDFOOT D,SKEPPER J N,HEGYI L,et al.Apoptosisregulates human vascular calcification in vitro:evidence forinitiation of vascular calcification by apoptotic bodies[J].Circulation Research,2000,87(11):1055-1062.[10]AN S J,BOYD R,ZHU M,et al.NADPH oxidase mediatesangiotensin 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[16]CICERI P,ELLI F,CAPPELLETTI L,et al.A new in vitro model todelay high phosphate-induced vascular calcification progression[J].Mol Cell Biochem,2015,410(1/2):197-206.[17]BYON C H,JAVED A,DAI Q,et al.Oxidative stress inducesvascular calcification through modulation of the osteogenictranscription factor Runx2by AKT signaling[J].The Journal ofBiological Chemistry,2008,283(22):15319-15327.[18]OUIMET M,FRANKLIN V,MAK E,et al.Autophagy regulatescholesterol efflux from macrophage foam cells via lysosomal acidlipase[J].Cell Metabolism,2011,13(6):655-667.[19]REYNOLDS J L,JOANNIDES A J,SKEPPER J N,et al.Humanvascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediatedcalcification in response to changes in extracellular calcium andphosphate concentrations:a potential mechanism for acceleratedvascular calcification in ESRD[J].Journal of the AmericanSociety of Nephrology,2004,15(11):2857-2867.(收稿日期:2022-03-30)(本文编辑王雅洁)。
胎兔动脉导管平滑肌细胞的原代培养及鉴定
胎兔动脉导管平滑肌细胞的原代培养及鉴定摘要目的：建立胎兔动脉导管平滑肌细胞的体外培养方法。
方法：采用组织块改良贴壁法（玻片压迫组织块贴壁方法）进行胎兔动脉导管平滑肌细胞的体外原代培养，并行免疫组织化学法对培养细胞的进行鉴定。
结果：经10～14天培养后，培养皿底及盖玻片上铺满梭状细胞，免疫组织化学法鉴定确认为胎兔动脉导管平滑肌细胞。
结论：植块改良贴壁法可以成功的进行胎兔动脉导管平滑肌细胞的体外培养，且本法简便，可靠，短时间内可以获得大量细胞，从而为动脉导管未闭发病机制的研究奠定了实验基础。
关键词平滑肌细胞动脉导管细胞培养胎兔动脉导管未闭（pda）是小儿先天性心脏病常见的类型之一，占先天性心脏病发病总数的15%。
胎儿时期，动脉导管的被动开放是血液循环的重要通道，它分流了超过一半的右心室输出量绕过未膨胀的肺进入脐循环进行气体交换。
出生后，随着首次呼吸的建立，动脉氧分压的增高，肺循环阻力的降低，动脉导管逐渐关闭。
而早产儿由于动脉导管平滑肌发育不良，平滑肌对氧分压的反应性低于足月儿，因此早产儿动脉导管未闭的发生率较高，约占早产儿的20%，且伴呼吸窘迫综合征的早产儿发病率更高。
因此，对于动脉导管未闭发生机制的研究及适当的干预和治疗在预防和降低早产儿的死亡率上具有重要的意义。
动脉导管平滑肌细胞（dasmcs）是构成动脉导管中层的主要细胞成分，其增殖、迁移及凋亡均与生后动脉导管的关闭密切相关。
因此，体外培养动脉导管平滑肌细胞是研究动脉导管未闭发病机制的重要手段。
由于影响血管平滑肌细胞体外培养的因素很多，尤其是动脉导管因其组织量较少，培养难度更大，因此国内少见有动脉导管平滑肌细胞的体外培养模型。
本课题组，参照国内外有关文献，采用组织贴块法成功培养出胎兔动脉导管平滑肌细胞，为动脉导管未闭发生机制的体外研究，提供了足量的细胞材料[1，2]。
资料与方法实验取材：选取孕29天的日本大耳白胎兔为研究对象，购于郧阳医学院实验动物中心。
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[作者简介] 程孝中,男,安徽大学生命科学学院在读硕士研究生,主要从事细胞生物学研究[作者单位] 1.安徽大学生命科学学院,合肥 230039;2.军事医学科学院生物工程研究所,北京 100850[通讯作者] 钟 辉,Te:l010-66931809,E-mai:ltowall@yahoo.com;黄 蓓,E-mai:lbeihuang@163.com#安徽大学生命科学学院和军事医学科学院生物工程研究所共同为第一单位
人血管平滑肌细胞的原代培养及其钙化模型的建立程孝中1,2#,宋 婷2,黄 蓓1,钟 辉2[摘要] 目的 利用B-甘油磷酸盐处理人血管平滑肌细胞(humanvascularsmoothmusclecells,HVSMCs)制备体外血管钙化模型。方法 用组织贴壁法从人胚胎脐带动脉中分离原代人主动脉平滑肌细胞,原代细胞通过抗体A-sm-actin染色鉴定,将传4~6代的细胞分为钙化组和对照组,对照组用正常DMEM培养基培养,钙化组加入10mmol/LB-甘油磷酸盐诱导细胞钙化,连续培养10d。茜素红S染色及碱性磷酸酶法鉴定。结果:分离的原代细胞经S-P染色鉴定为阳性,呈淡黄色。钙化组细胞诱导钙化后,细胞增殖缓慢,并形成囊泡结构,茜素红S染色形成红色的钙化结节,钙化组碱性磷酸酶活性较对照组在不同时间点(4,6,8,10d)都有所增加(P<0.01)。结论:B-甘油磷酸盐体外能够诱导HVSMC钙化,此方法诱导的钙化模型是一种良好的研究血管疾病方面的体外模型。[关键词] 人胚胎血管平滑肌细胞;原代培养;钙化模型[中图分类号] R543.5[文献标志码] A[文章编号] 1000-5501(2010)01-0037-03
PrimarycultureofhumanvascularsmoothmusclecellsandtheircalcificationmodeCHENGXiao-zhong1,2#,SONGTing2,HUANGBei1*,ZHONGHui2*(1.LifeScienceDepartmentofAnhuiUniversity,Hefei230039,China;2.BeijingInstituteofBiotechnology,Beijing100850,China)*Correspondingauthor,ZHONGHu,iTe:l010-66931809,E-mai:ltowal@lyahoo.com;HUANGBe,iE-mai:lbeihuang@163.com
[Abstract] Objective Toestablishacalcificationmodeinvitroofhumanvascularsmoothmusclecells(HVSMCs)in-ducedbyB-GP.Methods PrimaryHVSMCswereobtainedfromhumanembryobyplantmethodandconfirmedbystainwithA-sm-actinantibody.Thecellsafter4-6passagesweredividedintotwogroups.ThecontrolgroupwasincubatedwithnormalDMEMmediumwhilethecalcificationgroupwasincubatedwiththemediumcontaining10mmol/LB-glycerophosphatefor10days.CalcificationwasconfirmedbyalizarinredSstainandalkalinephosphatase(ALP)assays.Results TheprimarycellsobservedbyS-Pstainwerepositiveandthecellsafterbeingstainedwerepaleyellow.AfterbeinginducedwithB-GP,thecellsofcalcificationgroupbeganconcentricgrowthandformedvesicles.AlizarinredSstainingshowedthatthereactionofcalcifyingnoduleswasred,ALPactivitywashigherthanthatofcontrolsatvarioustimepoints(4d,6d,8dand10d,P<0.01).Conclusion TheHVSMCscouldbeinducedintocalcificationinvitrobyB-GP,andthismodelcontribatestofur-therstudiesofvasculardiseases.[Keywords] humanembryovascularsmoothmusclecells;primaryculture;calcificationmode
随着年龄的增长,多数老年人的主动脉都存在着渐进的钙盐沉积,即动脉钙化,其最终会导致高血压、动脉粥样硬化等血管疾病[1~3]。而血管平滑肌细胞(vascularsmoothmus-clecells,VSMCs)是动脉发生钙化的主要细胞,VSMCs体外诱导钙化是研究心血管疾病发病机制的重要细胞模型。目前,VSMCs的体外原代培养主要来源于大鼠,本研究对分离自人胚胎组织的人VSMCs(HVMCs)进行体外原代培养,并经B-GP诱导形成钙化,旨在为研究心血管疾病发病机制提供更准确的细胞模型。
1 材料与方法1.1 材料人胚胎(胎龄32周),解放军总医院提供;DMEM培养基购自Gibco公司;小牛血清购自杭州四季青生物工程材料公司;B-磷酸甘油酯(B-GP)、茜素红购自北京欣经科生物技术有限公司;羊抗A-SM-actin(带HRP标签)购自SantaCruz公司;碱性磷酸酶检测试剂盒购自南京建成生物工程公司;其他试剂均为国产或进口分析纯。
37 军事医学科学院院刊 2010年2月第34卷第1期 BullAcadMilMedSc,iVol34,No1,Feb,2010 1.2 方法1.2.1 HVSMCs的分离培养及其纯化 取离体2h的胚胎,无菌操作取出胸主动脉,用D-Hanks液反复冲洗,去除残留血液,小心剥去外膜,将主动脉放入DMEM液(含4.5g/L葡萄糖,10mmol/L丙酮酸,2mmol/L谷氨酰胺,100U/L的青霉素及链霉素,20%加强型小牛血清)中,用眼科剪纵行剪开主动脉,用刀片轻刮内膜2~3遍以去除内膜,然后将主动脉剪成约1mm@1mm小块,用吸管吸取小块植入培养瓶底,小块间相距约0.5cm为宜,轻轻翻转培养瓶使瓶底朝上,置于37e、5%CO2细胞培养箱中静置4~5h使小块微干涸,然后加入少许培养基,静置于培养箱中5~6d后换液,待细胞长满培养瓶底面积80%后用0.25%的胰酶消化传代,传代2h后吸取上清液接种于另一培养瓶中,24h后根据细胞贴壁情况收取未贴壁细胞悬液,离心5min,重悬后接种到新的培养瓶中,反复多次差速贴壁法纯化细胞,实验用第5~8代细胞。1.2.2 细胞鉴定 在六孔板内用消毒的盖玻片制作细胞爬片,待细胞贴壁生长至60%~70%融合时,弃去培养基,用1@PBS洗涤1~2次,爬片用95%乙醇固定30min,1@PBS洗2次,每次2min,加入抗体A-SM-actin(1B100稀释),37e孵育30min后滴加链亲和素生物素复合物(SABC),37e孵育20min,1@PBS洗4次,每次5min。DAB显色,苏木素轻度复染,经分化,脱水,透明,封片,在显微镜下观察。1.2.3 体外钙化模型的建立 将第4~8代细胞分为正常组和钙化组,待细胞长至70%汇合时,正常组仍用正常DMEM(10%胎牛血清)培养,钙化组使用钙化培养基(含10mmol/LB-GP)培养[4],每2d更换培养液,连续培养10d。1.2.4 碱性磷酸酶测定 细胞弃去培养液,1@PBS洗细胞3次,每孔加入500Ll0.1%TritonX-100(0.9%NaCl制备),4e过夜,反复吹打使细胞破碎,收集于离心管中,1200r/min离心3min,收取上清,按碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒操作测定ALP活性。1.2.5 茜素红染色 细胞弃培养液,1@PBS洗细胞3次,加入0.5ml4%多聚甲醛室温固定20min,然后用重蒸水洗3次,加入1ml1%茜素红室温孵育20min,吸去染液,用重蒸水洗4次,放置2~3min使重蒸水挥发,在倒置显微镜下观察。1.2.6 统计学处理 定量资料用x?s表示,采用SAS9.1.3统计软件进行统计分析。本研究采用具有一个重复测量的两因素设计,用F检验对交互作用效应的平均值进行两两比较,P<0.01表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 原代细胞培养 人主动脉植块贴壁5d后可见细胞从植块周边游离出来,细胞呈梭形生长,致密排列成束状,细胞传代后,未贴壁时细胞呈椭圆型,不透明,4~6h后开始贴壁,贴壁后的细胞逐渐伸展,透明度增加,相互重叠生长,呈典型的峰谷形状(图1)。
图1 分离自人胚胎主动脉的原代HVSMCs (@7)2.2 细胞鉴定运用S-P免疫组化染色纯化后的平滑肌细胞,胞浆呈棕黄色,胞核蓝染(图2)。
图2 经S-P染色的HVSMCs (@7)2.3 碱性磷酸酶活性检测碱性磷酸酶活性测定结果显示,对照组与实验组平均值之间的差异有统计学意义,F=7162.29,P<0.0001;6个时间点平均值之间的差异有统计学意义,F=2238.53,P<0.0001;组别与时间交互作用项平均值之间的差异有统计学意义,F=1928.23,P<0.0001。除0,2d外,其余各时间点对照组与实验组比较差异均有统计学意义,对应的t值分别为:-0.47,-0.39,-2.34,-33.86,-61.02,-109.22;P值分别为0.6416,0.6985,0.0277,<0.0001,<0.0001,<0.0001。因此,在4,6,8,10d实验组平滑肌细胞表达ALP的活性强于对照组(表1)。
表1 钙化组和非钙化组血管平滑肌细胞在不同时间点ALP值(x?s,n=3)组别ALP(U/100ml)时间(t/d)0246810实验组11.42?0.1511.82?0.20 12.96?0.11** 25.23?0.29** 35.97?0.43** 54.57?0.45**对照组11.24?0.1011.67?0.2912.06?0.1012.38?0.1312.82?0.1313.13?0.41 **P<0.01,与对照组比较