脐动脉血管平滑肌细胞的分离与培养

脐动脉血管平滑肌细胞的分离与培养材料1) 培养基和维持平滑肌细胞生长的溶液a) 培养基: DMEM /F12b) 基本培养基的添加剂(final concentrations):100 U/mL penicillin,100 µg/mL streptomycin10% (v/v) FBS.通常消毒冷冻储备。

完全培养基4°C可达1 个月，常规细胞培养使用前预温到37°C。

分离过程用无FBS 的培养基。

c) Hanks’平衡盐溶液(HBSS, Sigma)：用于组织标本的收集培养基。

下面的添加剂在使用之前加入储备液中(final concentrations):100 µg/mL Gentamicin0.025 M HEPES20 mM bicarbonate0.001% phenol redHBSS 可分装储存于4°C最多2周。

d) Bicarbonate (4.4%, 0.52 M)-Phenol red (0.03%) solution:44 g NaHCO3 +30 mg phenol red in 1000 mL组织培养级的去离子水,高压灭菌消毒10 min at 115°C.15 mL分装4°C储存可达6 mo，2 aliquots used in 400 mL of medium.2)Penicillin and streptomycin stock solution (80X concentrate):480 mg penicillin+1.5g streptomycin sulfate in 200 mL组织培养级的去离子水0.5 µm滤膜预过滤，0.22 µm滤膜过滤消毒。

5 mL分装，–20°C储存，1 aliquot used in 400 mL of medium.3)Gentamicin solution (80X concentrate):750 mg gentamicin sulfate in 100 mL组织培养级的去离子水0.22 µm滤膜过滤消毒。

5 mL分装，–20°C储存，1 aliquot used in 400 mL of HBSS.4)HEPES solution (1 M):47.6 g of HEPES in 200 mL组织培养级的去离子水0.22 µm滤膜过滤消毒。

5 mL分装，–20°C储存，2 aliquots used in 400 mL of HBSS.5)胰蛋白酶溶液(2.5 %):Trypsin from porcine pancreas (Sigma) is dissolved (2.5 g/100 ml) in PBS-A0.22 µm滤膜过滤消毒。

10 mL分装，–20°C储存6)乙二胺四乙酸(EDTA) solution (1%):EDTA disodium salt is dissolved (500mg/ 50 mL) in 组织培养级的去离子水0.22 µm滤膜过滤消毒。

5 mL分装，4°C储存7)Trypsin (0.1 %)-EDTA (0.02 %, 0.5 mM) solution10 mL Trypsin (2.5%) +5 mL EDTA (1%) to 250 mL sterile PBS-A.使用前预温至37°C ，用于从培养瓶分离细胞。

4°C储存可达2 mo.8) SMC酶分解a)胶原酶, Type II (Sigma).冰上，溶解胶原酶在无血清培养基(3 mg/mL) 。

0.5-µm滤膜过滤移除微粒0.22 µm滤膜过滤消毒。

5-10 mL分装，–20°C 长期储存b)弹性蛋白酶, type IV from porcine pancreas (Sigma).使用前现配，弹性蛋白酶溶解到无血清培养基(1 mg/mL)pH调整到6.8 with 1 M HCl.0.22 µm滤膜过滤消毒。

均在冰上操作9)Immunofluorescence Microscopya) mouse monoclonal antibody to _-smooth muscle actin (Sigma).b) Normal rabbit serum (Sigma).c) Fluorescein isothiocyanate conjugated rabbit antimouse antibody (Dako). d) Methanol (100 %).10)Equipment所用操作均在无菌，II类层流安全厨内进行。

解剖设备均应清洗，70% 酒精浸泡消毒或121°C 高压灭菌20 min.a) 25 cm 和75 cm组织培养瓶，90-mm 皮氏培养皿。

b) 5和10 mL消毒的巴斯德移液管。

c) 30-mL消毒普通容器和10-mL离心管。

d) 解剖刀和刀片，小剪刀，watchmaker’s 镊子，皮下注射针头。

e) 铝箔覆盖的解剖用软木板，均喷洒70 %酒精消毒。

f) 各种大小的锥形瓶。

g) Lab-Tek chamber slides (Nunc).Methods1) 收集组织样本整条脐带放在HBSS收集培养基内储存在4°C。

这样储存可48小时内使用。

也能在收集对应的脐静脉内皮细胞后再收集动脉SMC。

5-cm长的脐动脉仔细从脐带分离，保证有最少的周围结缔组织，然后储存在新的收集培养基。

2)媒介分离SMCsa)应尽可能从动脉周围剔除结缔组织，用新HBSS收集培养基冲洗。

然后放置在无菌解剖板和HBSS覆盖以保持湿润。

b) 动脉一端用皮下注射针固定在解剖板，然后用小剪刀纵向剖开，管腔表面向上。

c) 沿整个动脉长度用无菌手术刀刮除血管内皮细胞，用HBSS重新湿润。

d) 动脉壁的的厚度和性质取决于该组织的来源，但是，一般的动脉内膜和中膜用钟表镊子和手术刀剥成1 - 2毫米宽横向条带。

肌条被转移到一个含HBSS90毫米皮氏培养皿中。

此过程将在动脉的整个表面重复进行。

e)大部分HBSS被吸出，用剪刀或刀片把肌条切成1-2 毫米立方体。

然后在新HBSS洗并转入消毒的已知重量的锥形瓶，根据组织的质量确定酶溶液的体积。

f) 接着，无血清培养基中的胶原酶溶液加到组织【组织(g)/酶溶液(ml)大约1/5 (w/v)】。

烧瓶然后用无菌铝箔覆盖，37°C水浴摇晃30 min。

g) 准备弹性蛋白酶溶液，加入含有组织和胶原酶的溶液中。

烧瓶重新放回37°C水浴摇晃，随后的2-5小时每30 min在无菌安全厨内用移液管混合悬浮。

h) 每间隔30 min，10 µL悬浮样本转移到细胞计数板检查单细胞外观。

重复该操作，直至被消化，没有大的细胞聚集。

消化不能超过5小时，避免细胞活性丧失。

(See Note 3)i) 细胞悬液被分到10-ml的离心管，50–100g离心5 min。

仔细吸出上清，加入2–5 mL预温的完全培养基用无菌移液管重悬浮细胞。

然后接种到25-cm 培养瓶（密度8 ×10 cells /ml），置于37°C, 5% CO2孵育箱，松开瓶盖。

j)有活性的SMC应该在24 h内贴壁；更换培养基。

每2–3 d 更换培养基的一半，直至融合成单层的SMC 。

3) SMCs外植体培养的分离The sample is first treated exactly as described in steps 1–3 of Subheading 3.2., and then the following procedure is adopted:a) 用手术刀把动脉切成2-m m方块，用巴斯德移液管放在25-cm培养瓶的表面，墙面与烧瓶壁接触。

用HBSS持续保持动脉湿润，当每个立方块放到烧瓶时，都应该滴一滴含血清的培养基。

b) 25-cm 的烧瓶均匀分布12–16立方块。

在转移到37°C, 5% CO2孵育箱前，烧瓶直立，5 mL 含血清的培养基直接加到烧瓶的底部，放入孵育箱后应放松瓶盖。

要使外植体组织粘附到培养瓶，在孵育箱保持直立2-4小时，然后小心放平，使培养基完全覆盖组织块。

c)此后4 d内不要动组织块，每天观察有无感染( see Note 4)。

每4 d，任何为贴壁的组织块移除，并换掉培养基的一半。

1–2 wk内，细胞开始向外迁移。

3 –4 wk后，外植体周围有了足够的SMC密度，这时移除组织块。

用无菌巴斯德移液管，轻轻地从培养瓶表面取出培养快，吸出培养基。

更换培养基，2–4 d的增殖后就形成了融合的单层SMC。

(see Note 5).SMCs 传代培养1)一旦在25-cm培养瓶形成单层细胞（上面两种分离方法），SMC就可以传代到25-cm培养瓶或75-cm培养瓶。

移除培养基，用预温的无菌PBS-A 洗两次，移除残留血清。

2) 预温trypsin/EDTA溶液(0.5 mL for 25 cm flask or 1 mL for a 75-cm flask)覆盖细胞，37°C孵育2–4 min。

显微镜检查，确保细胞完全分离。

也可以用力敲击培养瓶边3–6次，打碎细胞聚集。

(see Note 6).3)含血清的培养基(5 mL) 加入，终止胰蛋白酶的作用。

吹打悬浮细胞4–6 次打碎细胞团。

4) 然后转移到新的培养瓶（1/3）含血清的培养基加入新的培养瓶(5 mL in a 25-cm and 10 mL in a 75-cm flask). 放回到37°C, 5 % CO2孵育箱，如上更换培养基。

5) SMC能传10–20代，依赖于物种，后增值力明显降低。

SMCs 的特征融合的单层血管平滑肌细胞具有”峰和谷”特点。

分离的原代细胞可以用抗α-actin抗体阳性反应来识别，并且von willebrand因子阴性染色或缺乏乙酰化LDL摄取这两个EC特异性标志。

下面简要介绍异硫氰酸荧光素（FITC标记）标记抗平滑肌细胞α-actin抗体染色鉴定SMC的方法。

1) SMCs 传代培养至Lab-Tek腔室培养玻片，48 h后观察其特征。

.2)培养基从小室内移除，用无血清培养基轻轻地洗细胞3次，用冰冷的甲醇(100%)固定45s，然后用冰PBS-A 洗3次。

3) 用小鼠单克隆抗α-actin 抗体（用PBS-A稀释1/50）室温孵育细胞1小时。

只用PBS-A孵育作文阴性对照。