分子遗传学第7章基因突变与重组-遗传学
(整理)第7章真核生物的遗传分析
第七章真核生物的遗传分析重点：真核生物的基因组；真菌的遗传分析；真核生物重组的分子机制。
难点：顺序四分子分析。
第一节真核生物基因组一、C值悖论二、N值悖论三、真核生物基因组DNA的复杂度一、C值悖论基因组（genome）：一个物种单倍体的染色体数目及其所携带的全部基因称为该物种的基因组。
genome -- The complete set of sequences inthe genetic material of an organism. Itincludes the sequence of each chromosomeplus any DNA in organelles.C值（C-value）：是指生物体的单倍体基因组所含DNA总量。
每种生物各有其相对恒定的C值，不同物种的C值之间有很大差别。
最小的C值是支原体，小于106bp；最大的C值是某些显花植物和两栖动物，可达1011bp。
C值同生物的进化有什么关系? 生物的C值，即基因组的DNA总量是不是随着生物的进化而相应地增加?一方面，随着生物结构和功能复杂程度的增加，需要的基因数量和产物种类越多，因此C值也相应地增加。
另一方面，在结构与功能相似的同一类生物中，以及亲缘关系很近的物种之间，则看不到这种规律。
因此，物种的C值及其进化复杂性之间没有严格的对应关系，这种现象称为C值悖理(C —value paradox)。
C-value paradox:the lack of direct relationshipbetween the C value and phylogenetic complex.人们对C值悖理已经提出许多解释：包括基因组的部分或完全加倍、转座、返座已加工假基因、DNA 复制滑动、不等交换和DNA扩增等。
Petrov等又提出一个解释是：各种生物基因组的大小是由于基因组中长期积累起来的过量的非编码DNA被清除的速率不同所造成的结果，即DNA丢失的速率愈慢，那么基因组DNA含量愈高。
分子遗传学第七章
SNP是出现频率最高的标记，人类基因组中平 均每1000 bp中就有1个SNP，总数可达300万个。 SNP 既能在编码基因也能在非编码基因中发生， 在编码基因中出现的称为cSNP，这种cSNP可能会影 响蛋白质的结构和表达水平，对分析基因与性状的 关系有重要意义。 由于编码序列选择压力大，杂合度可能性要小 一些。而非编码序列（HLA）杂合度达5-10%。
图 7-4 DNA 扩 增 原 理
○ PCR—RFLP
如果已知多态性位点周围的DNA序列，则可 用PCR快速而简单地进行RFLP分析。
首先根据多态位点两侧序列设计和合成引物； 以基因组DNA为模板进行PCR扩增；用相应的内切 酶进行消化；再进行电泳，分析PCR区带判断多 态性。
图7-5 PCR—RFLP
染色体核型（染色体的数目、大小、随体、 着丝粒位置、核仁组织区等）、带型和数量的变 异,呈现出的染色体在结构上和数量上的遗传多态 性称为遗传标记。
优点——不受环境影响，呈孟德尔方式遗传。
缺点——工作量大，多态性较局限，常伴有对 生物有害的表型，获取材料困难。
（3）免疫遗传标记
以动物的免疫特征为标记，包括红细胞抗原多态性 和白细胞抗原多态性。
○
○
二
○
RFLP标记
限制性片段长度多态性（restiction fragment length polymorphism,RFLP）是
1980年建立的第一代遗传标记。RFLP是指用限制性 内切酶切割不同个体的DNA时，会产生长度不同的 DNA片段，电泳后用克隆探针方法可检测出这些片 段。
其基本过程是：取得DNA样本——酶切——电泳——转移 至硝酸纤维膜上——DNA探针杂交——放射自显影。
图7-7 VNTR的多态性
第七章遗传重组
图 23－8 Holiday 重组模型。
b
12
B 3’ 5’ 5’ 3’
3’ 5’ 5’ 3’
3’ 5’ 5’ 3’ 移动联会 3’ 5’
5’ 3’ 交叉连接
3’ 5’ 5’ 3 链交叉
B 3’ 5’ 5 3’
点移动
(8)
A
B
两臂旋转
b a
(9)
A
B
b a
(10)
A
B
A B
b a
(11) A
B
a
b
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4、RecA蛋白的作用方式
RecA蛋白首先与单链DNA结合（约每分子可结合５个核苷 酸），形成一条DNA－蛋白质细丝（需消耗ATP），RecA 蛋白即被活化； 活化的RecA将双螺旋解旋和分离，同时试图将其结合的单 链与被解旋区域退火，如此继续，直到找到互补顺序。 一旦有一小部份被真正“退火”，ATP供应的能量就会继 续驱使配对反应趋于完成，其方向是５’→３’（单链部 分）。 新的杂交双链形成时，RecA蛋白即从原来的单链掉下来。
A
B
a
b
b a
A
b
a
B
A
b
a
B
图 23－8 Holiday 重组模型。
7）Holliday中间体拆分 （二次切断），可以有 两种情况： Holliday中间体二次切 割发生在原断裂的两条 单链上，称为非交换型 重组，双链中存在异源 区域(图10, 11, 12)； Holliday中间体二次切 割发生在另外两条单链 上，称为交换型重组 (图10’, 11’, 12’)。
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RecA蛋白促进的各类DNA分子间的联会
参与联会的DNA分子可以 是多种不同的形态分子 的组合； 但无论那种组合，其中 一个分子是单链分子， 或者有足够长度的单链 区。
遗传学中的基因突变与变异
遗传学中的基因突变与变异遗传学是研究遗传现象、遗传规律的科学分支，通过研究基因突变与变异，可以了解生物体在遗传层面上的变化与多样性。
基因突变与变异广泛存在于各个生物体中，在科学研究和临床实践中起着重要的作用。
基因突变是指基因序列发生永久性的变化。
它可以分为点突变、插入突变、删除突变和移位突变等不同类型。
点突变是指一个碱基被替换为另一个碱基，导致氨基酸序列发生改变。
插入突变是指某一段额外的DNA序列被插入到基因中，导致基因序列变长。
删除突变是指基因中的某一部分序列被删除，导致基因序列变短。
移位突变是指基因序列内部的一部分被移动到其他位置，导致序列发生改变。
基因变异是指同一种基因拥有不同的等位基因。
通常情况下，基因变异可以分为两大类：等位基因的不同导致基因型的变异，以及一个基因在不同个体之间表达不同导致表型的变异。
基因型的变异是指由于等位基因的不同而导致基因表达的差异。
一个基因座上存在不同等位基因时，个体之间基因型的组合具有多样性，从而导致表型的差异。
而表型的变异则是指同一个基因座上的等位基因在不同个体之间导致的表型差异。
基因变异不仅仅存在于个体之间，也可以在种群中广泛分布，从而形成了基因多样性。
基因突变和变异不仅是遗传学研究的重要内容，也对我们理解遗传疾病的发生与发展具有重要意义。
基因突变是遗传疾病的主要原因之一。
一些突变可能导致基因功能的改变，进而导致疾病的发生。
例如，囊性纤维化是一种由于基因突变导致的常见遗传疾病。
在囊性纤维化患者中，CTFR基因发生突变，导致这个膜蛋白的功能受损，从而引发多器官疾病。
另一方面，基因变异对人类进化和适应环境的过程也具有重要影响。
基因变异的存在使得物种能够适应环境的变化。
例如，黑猩猩与人类基因组上的差异仅约为1%，但正是这些微小的差异导致了我们今天的进化和智慧。
这种基因变异是自然选择的结果，只有最好适应环境的个体才能在繁殖中存活下来。
基因变异使得物种具有适应性和可塑性，从而能够在环境的挑战中生存并繁衍后代。
分子遗传学的内容
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mRNA基因转录激活及其调节
• mRNA基因是蛋白质基因，在基因组中占据 绝大多数，由RNA聚合酶II转录，真核RNA 聚合酶II与十几种基本转录因子结合成转录 起始复合物，对蛋白质基因进行转录。基本 转录因子中只有TFII D可以和TATA盒结合. TFII D由TBP（TATA结合蛋白）和十几种 TBP相关因子（TAF）构成。真核基因调节 的三大要素是顺式作用元件 反式作用因子 和RNA聚合酶，它们通过DNA和蛋白质及 蛋白质和蛋白质的相互作用调节的转录。
• （1） DNase I超敏位点: 由于转录激活区组 蛋白部分脱落，产生DNase I超敏位点 。
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• （2）DNA 拓扑构像发生变化，DNA转录 时，RNA 聚合酶的前面是正超螺旋，后面 是负螺旋。
• （3） DNA碱基修饰变化 转录激活的基因 处于低甲基化状态。
• （4）组蛋白的数量、结构和化学修饰发生 变化
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• 二、真核基因表达调节特点:
• （A） RNA聚合酶 原核生物只有一种RNA 聚合酶，真核生物有三种，分别转录不同的 RNA，RNA聚合酶II负责转录蛋白质的基 因 ，因此该酶最为重要 。
• （B） 活性染色质结构的变化 基因转录可 在染色质水平上调节，基因转录激活的染色 质在结构和性质上发生如下变化；
• 男性性别基因丢失九成 千万年后男人将消失! 澳大利亚国立大学的遗传学家詹妮?格雷夫斯教授 在近日的第15届国际染色体代表会议上发表讲话
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• 称，1000万年后目前现存的这种男人类型将 在地球上消失。3亿年前，当男性特有的Y 染色体产生之际曾含有1438个基因，但到目 前为止其中的1393个基因已经消失了，剩下 的45个基因也将在1000万年后消失。这就意 味着负责睾丸发育和男性荷尔蒙分泌的SRY
基因工程第七章 重组子的筛选和鉴定
菌落PCR出现假阴性 避免将琼脂培养基挑到PCR管中及其他原因:
酶失活；引物质量不好（设计、合成、保存）；物 理原因（变性、退火的温度、时间）。
一般重组子克隆的PCR反应条带比较亮且宽, 形状较规则,而假阳性和假阴性的PCR条带，多数 不太亮,条带细而且不规则，有时拖尾。
4、Broome-Gilbert双位点检测法 可用于检测融合蛋白。 既检测外源基因产物又检测载体基因产物。 质粒基因A 插入基因B
重组质粒
表达 融合蛋白 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B
固相支 持滤膜
125I标记的 抗A抗体 质粒蛋白A 外源蛋白B 抗B抗体
发光，底片曝光
硝酸银： 灵敏度高、可检出2-5ng/带。
② 转到膜上进行染色。
直接染色电泳结果
2、Western blotting
（1）Western（转膜） 电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转 到膜上（硝酸纤维素膜、中性尼龙膜等）。
胶里的蛋白质带在电场 的作用下横向转移到正
94℃ 10min
94℃ 5min
94℃ 40s 62℃ 30s 72℃ 90s 25～30 cycle
94℃ 40s 58℃ 30s 72℃ 90s 35～40 cycle
72℃ 7min 4℃ for ever
72℃ 7min 4℃ for ever
预变性时间延长为10 min, 使得细菌能够充分 破裂，DNA 大量释放并充分变性。
菌落），用无菌牙签挑选单菌落，将菌落转至 PCR管中（牙签在无菌水中洗一下），然后将牙 签点在LB（+Amp）平板，记录号码。 在PCR管中加其他成分（最后加酶） 设定PCR程序，开始PCR。 电泳检测。 LB平板过夜培养，选取正确的菌落。
遗传学课件基因突变
羟胺（hydroxylamine，HA）
可使胞嘧啶（C）的化学成分发生改变，而不能 正常地与鸟嘌呤（G）配对，而改为与腺嘌呤（A） 互补。经两次复制后，C-G碱基对就变换成T-A碱基 对。
在DNA复制过程中由互变异构作用引起的突变
DNA复制中的错误环出产生的碱基插入和缺失
（二）、自发的化学损伤
1、脱嘌呤
脱嘌呤是自发化学变化中最常见的一种，它是由 于碱基和脱氧核糖间的糖苷键断裂，从而引起一个鸟 嘌呤或一个腺嘌呤从DNA分子上脱落下来。
研究发现，在37℃条件下培养一个哺乳动物细胞 20小时，会有数以千计的嘌呤通过脱嘌呤作用自发地 脱落。如果这种损伤得不到修复，就会引起很大的遗 传损伤，因为在DNA复制过程中，无嘌呤位点将没有 特异碱基与之互补，而可能随机地选择一个碱基插进Biblioteka 去，结果导致突变。一、静态突变
二、动态突变
一、静态突变（static mutation）
是在一定条件下生物各世代中以相对稳定 的频率发生，并且能够使之随着世代的繁衍、 交替而得以稳定传递的基因突变。
可分为点突变和片段突变。
点突变（point mutation）
DNA链中单个碱基或碱基对的改变，包括 两种形式：碱基替换和移码突变。
碱基替换（base substitution）
DNA分子中原有的某一特定碱基或碱基对 被其他碱基或碱基对置换、替代的突变形式。
转换（transition）:一种嘌呤-嘧啶对被另一种
嘌呤-嘧啶对所替换。
颠换（transvertion）:一种嘌呤-嘧啶对被另
分子生学技术-第七章 DNA的重组与转座
2、复合式转座子
它是一类较复杂的转座子，由两个重复序列 夹着一个或多个结构基因组成。除了含有转位相 关的功能外，还带有一些其他基因，如抗药性基 因、抗重金属离子基因等。 它们都具有末端反向重复序列、可编码基因 和插入位点的正向重复序列
TnA转座子：
结构较复杂，长度约5000bp。两端没 有IS结构，仅含有两个末端反向重复序列， 一般约38bp。内部通常含有转位相关的基 因和抗药性基因等，插入位点约5bp。
②果蝇中的转座子—P转座子 两端有31bp的反向重复序列,靶位点产生8bp 的正向重复序列,有四个外显子和三个内含子， 在体细胞中,只有前两个内含子被切除,产生一个 转座阻遏蛋白;在卵细胞中,三个内含子全部被切 除,可产生转座酶,导致P转座子转座和后代不育。
四、转座的遗传学效应
a、转座引起插入突变 各种IS、Tn转座子都可引起突变 b、转座产生新的基因 转座上存在一些抗药性基因或抗重金属基因 等
一、霍利迪结构(Holliday Structure)
霍利迪结构：它是DNA重组过程中的一个中间体， 重组时两个DNA双链体以四股DNA在连结点形成的十字 形DNA分子构象。
异源双链 (Hetero duplex)：指在重组部位，每条双 链中均有一段DNA链来自另一个双链中的相对链。
分支迁移（Branch migration）：一旦两个重组的 DNA分子形成霍利迪结构，交叉连接点很容易像拉链一 样移动，从而扩大异源双链体区域，这一过程叫分支迁 移。
2、Rec BCD核酸酶 Rec BCD蛋白具有DNA解螺旋酶、核 酸内切酶和外切酶的活性。它可以帮助有游 离末端的DNA形成单链DNA片段，从而有 利于RecA 蛋白作用。 它识别并切割Chi序列：5'GCTGGTGG-3'