第二章 菌种选育
第二章菌种选育
带图象分析系统的微生物菌种
显微观察装置
一、菌种的来源
?根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；
?从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
1、分离思路
?新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
?实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。
?有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。
2、新种分离与筛选的步骤
3、具体方法
?1）采样
?2）样品的预处理
?3）纯种分离
?4）生产性能的测定
1）采样
（1）采样对象
以采集土壤为主。一般田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。
从自然界筛选
?（2）采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
?（3）采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，
盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。
2）样品的预处理
?在分离之前，含微生物材料的标本首先进行预处理，可大大提高菌种分离的效率。
3）纯种分离
?在自然界获得的标本，是很多种类微生物的混杂物，一般采用平板划线或平板稀释法进行纯种分离。
?由于土壤或其它样品中所含的各种微生物数量有很大差别，若估计到要分离的菌种的数量不多时，就得设法增加分离的机率，可通过富集培养增加该菌种的数量。
?利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的，这种方法又被称为施加选择性压力分离法。
平板划线分离
稀释分离
分离的培养条件--控制营养成分
?各种微生物对营养物质的要求是有差异的。控制分离培养基的营养成分对提高分离效果是有好处的。
?用淀粉作为唯一碳源，则具有淀粉酶类的微生物就能很好生长。在一般情况下，也可以按照各大类微生物常用的培养基进行分离，例如分离细菌常用蛋白胨牛肉膏琼脂培养基，分离放线菌常用淀粉琼脂培养基，分离酵母、霉菌常用麦芽汁或米曲汁培养基等。
分离的培养条件--培养基酸碱度
?微生物生长繁殖的适宜酸碱度是不同的。细菌和放线菌一般要求中性或偏碱性的培养基（pH7.0或稍高），酵母和霉菌一般要求偏酸性（pH4.0~6.0）。所以，结合一定的营养，将培养基调至一定的pH值，更有利于排除不需要的微生物类型。
?筛选一些产有机酸类型的菌种，采用控制pH值的方法更为见效。例如，用酸性滤纸法筛选柠檬酸产生菌，就是利用含30%甘薯粉醪和10%的柠檬酸的培养基，使pH值在2.0~2.5。
将这种培养基和土壤稀释液相混合，用无菌毛细管吸取少量，点布在铺于培养皿中的灭菌滤纸上（2~3层），在30℃培养，这样得到的菌种几乎全部是产柠檬酸的黑曲霉。若要分离其它霉菌，在分离培养基中滴加几滴乳酸就可抑制细菌生长。
热处理
?每一种微生物都有它的最高生长温度，超过最高生长温度就不能生长和繁殖，甚至死亡。?热处理就是根据芽孢对热的耐性而淘汰不产芽孢的细菌和其他微生物。一般不产芽孢的细菌和其他微生物的营养型细胞，在60-70℃温度下10分钟被杀死，而芽孢则能抵抗100℃或更高的温度。
?要筛选芽孢杆菌，可将样品稀释液经过80℃，10分钟的水浴处理，将不产芽孢的营养细胞杀死，然后再进行分离，这样的筛选效果就很高。至于热处理条件，由于芽孢的耐热性，会因培养条件不同而产生差异，所以应根据具体情况有所变化。
添加抑制剂
?分离用的培养基，除控制营养，调节pH值外，还可添加一些专一性抑制剂，这样筛选效果还会提高。例如在分离放线菌时，可先在土壤样品的悬浮液中加10%的酚数滴，以抑制分离时霉菌和细菌的生长。添加一些抗菌素对某些微生物更有专一性的抑制，如分离酵母和霉菌，在培养基中添加一定量的青霉素、链霉素或新霉素以抑制细菌的生长。
?对不同菌类起抑制作用的抗菌素种类和浓度是有差异的。一般的抑制剂对芽孢和孢子的作用力弱，对营养细胞的作用力强，所以也应区别分离对象，灵活添加。
?分离霉菌时，特别是菌丝蔓延的根霉、毛霉等，菌落有的很快连成一片，不易挑取单菌落。若在培养基中添加去氧胆酸钠约0.1%左右，或山梨糖（在察氏培养基中加山梨糖0.1%，蔗糖0.01%），这样可防止菌丝蔓延，便于挑取。
控制培养温度
?不同种类的微生物适宜生长温度是不同的。一般嗜冷微生物最适温度在15℃左右，嗜温微生物在25-37℃，嗜热微生物在 55℃，甚至更高，除特殊要求外，我们筛选的主要是嗜温微生物。
（2）随机分离方法
?有些微生物的产物对产生菌的筛选没有直接的选择性指示作用，因此常采用随机分离法进行分离。
4）生产性能的测定
?分离后获得菌种才是筛选工作的第一步。在菌种分离中，获得大量的各种菌株，虽然它们可能有一些共同的特点，但是只有进一步进行生产性能的测定，才能确定哪些菌株适合生产要求，可用于生产。
?一般分两步进行，即初筛和复筛，经过多次重复筛选直至获得1-3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验，并进而作为育种的出发菌株。这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株。以区别于人工育种方法得到的变异菌株。
生产性能测定的特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值和提取工艺等。
自然界中的一些微生物在一定条件下是产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其是与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、
黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无需作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。
二、菌种选育
?菌种选育是一门应用科学技术，其理论基础是微生物遗传学、生物化学等，而其研究目的是微生物产品的高产优质和发展新品种，从而促进生产发展。
?菌种选育方法：自然选育、诱变育种、杂交育种、原生质体融合、基因工程等。
?一般来说，优良的生产菌种应该具备如下的基本特征：
?1、生产菌种应具有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力；
?2、在发酵过程中不产生或少产生与目标产品性质相近的副产物及其他产物；
?3、生长繁殖能力强，有较强的生长速率，产生孢子的菌种应该具有较强的产孢子能力；?4、能够高效地将原料转化为产品，这样可以降低生产成本，提高产品的市场竞争力；?5、有利用广泛来源原材料的能力，并对发酵原料成分的波动敏感性较少；
6、对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体物质作为一般碳源利用；
7、在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数、提高单罐产量、降低成本有重要意义；
8、具有抗噬菌体感染的能力；
9、遗传特性稳定，这样才能保证发酵过程能够长期、稳定地进行，同时有利于实施最佳的工艺控制。
一）自然选育
?在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自然突变（Spontaneons Mutatition）而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。
?所谓自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。
?一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。多因素低剂量的诱变效应是指自然突变实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射。互变异构效应是指四种碱基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式出现，平衡一般倾向于酮式和氨基式，因此，在DNA 双链结构中以AT和GC碱基对为主，在偶然情况下，T也会以稀有的烯醇式形式出现，在DNA 复制时，其相对的位置上就不出现A而是G。
自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9
自然突变有两种情况：
一种是我们生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。
另一种是我们生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。
自然选育在工业生产上的意义
问题：高产菌株是正突变高，还是负突变高？
回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变
自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。
自然选育操作步骤：
一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。
二)诱变育种
?诱变育种：诱变育种就是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。?诱变育种的理论基础：基因突变
?突变：指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。主要包括染色体畸变和基因突变。
?染色体畸变：指染色体或DNA片断的缺失、易位、逆位、重复等。
?基因突变：指DNA分子机构中的某一部位发生变化，又称点突变。
（一）诱变剂和诱变处理
?1、物理诱变剂：如紫外线、X—射线、γ—射线，快中子。
?物理因素中目前使用得最方便且十分有效的是紫外线。紫外线诱变一般用菌（孢子）悬浮液进行处理，采用15W紫外线杀菌灯，波长为260nm左右。灯与处理物的距离为30cm左右，照射时间依菌种而异，一般为几秒至几十分钟。一般我们常以细胞的死亡率表示，希望照射的剂量以死亡率控制在70～80%为宜。
?紫外线的作用机制：主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体变异甚至死亡。
?其他的几种射线都是电离性质的，有一定的穿透力，一般都由专业人员在专门的设备中使用，否则有一定危险性。
2、化学诱变剂：
化学因子如碱基类似物、5—氟尿嘧啶、烷化剂等。
化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。
1）氮芥
氮芥是一种极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一般使用它的盐酸盐。
诱变机制：引起染色体畸变
2）亚硝酸
诱变机制：脱去碱基中的氨基
3）N-甲基-N’硝基-亚硝基胍（NTG）
亚硝基胍是亚硝基烷基类化合物的一种，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到12%-80%的营养缺陷型菌株，故有超诱变剂之称。
使用化学诱变剂的优缺点：
1）大多数情况下，就突变数量而言，要比电离辐射更有效。
2）化学诱变剂是很经济的，因为只需要少量的合适的诱变剂，设备是实验室的一般玻璃器皿，一个蒸气罩。而用电离辐射进行工作时，设备费用大，并要注意安全性。
3）大部分诱变剂是致癌剂，所以在使用时必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，有人对某些诱变剂极其敏感，甚至未直接接触就会过敏，这就更要当心。
3、航天育种
所谓航天育种即利用空间环境高真空、微重力和强辐射的特点，在宇宙射线辐射的作用下，使生物的遗传性状发生变异，从而选育出优良菌种。
（二）诱变育种步骤出发菌株的选择
菌悬液的制备
诱变处理
中间培养
分离和筛选
1、出发菌株的选择
1) 挑选出发菌株的标准：产量高、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广。
2）从自然界新分离的野生型菌株，对诱变处理较敏感，容易达到好的效果。
3) 在生产中经生产选种得到的菌株与野生型较相似，也是良好的出发菌株。
4) 每次诱变处理都有一定提高的菌株，往往多次诱变能积累较多的提高。
5) 出发菌株开始时可以同时选2～3株，在处理比较后，将更适合的出发菌株留作继续诱变。
6) 要尽量选择单倍体细胞、单核或核少的多细胞体来作出发诱变细胞，这是由于变异性
状大部分是隐性的，特别是高产基因。
7) 根据采用的诱变剂或根据细胞生理状态或诱变谱选择诱变剂，因为同一诱变剂的重复
处理会使细胞产生抗性，使诱变效果下降。有的诱变剂是作用于营养细胞，就要选对数期的细胞；有的作用于休止期，就可选用孢子。
2、菌悬液的制备
?这一步骤的关键是制备单细胞或单孢子状态的、活力类似的菌悬液，为此要进行合适培
养基的培养，并要离心，洗涤，过滤。
3、诱变处理
根据前面有关诱变剂及诱变处理的介绍，结合诱变对象的实际，设计诱变处理方案。
4、中间培养
由于在发生了突变尚未表现出来之前，有一个表现延迟的过程，即细胞内原有酶量的稀释过程(生理延迟)，需3代以上的繁殖才能将突变性状表现出来。这个过程对今后的筛选和获得稳定菌株都是极为重要的。
方法：
让变异处理后的细胞在液体培养基中培养几小时，以让细胞的遗传物质复制，让细胞繁殖几代，以得到纯的变异细胞。这样，隐性的变异就会显现出来，若不经液体培养基的中间培养，直接在平皿上分离就会出现变异和不变异细胞同时存在于一个菌落内的可
能，形成混杂菌落，以致造成筛选结果的不稳定和将来的菌株退化。
5、分离和筛选
?筛选分初筛和复筛。初筛以迅速筛出大量的达到初步要求的分离菌落为目的，以量为主。?复筛则是精选，以质为主，也就是以精确度为主。因此在具体方法上就有差异。
例如初筛可以在平皿上直接以菌落的代谢产物与某些染料或基质作用形成的变色圈或透明圈的大小来挑取参加复筛者，而将90%的菌落淘汰。在数量减少后就要仔细比较参加复筛和再复筛的菌株，最后才能选得优秀菌株。在以后的复筛阶段，还应不断结合自然分离，纯化菌株。
三）杂交育种
?杂交育种是指将两个基因型不同的菌株经吻合（或接合）使遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。
(一)细菌的杂交育种
?在细菌中实现杂交的种类尚不多，主要是大肠杆菌，其他还有鼠伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、淋病奈氏球菌等。
?细菌的杂交可以通过细菌结合、F因子转导、R因子转移、转化和转导等方法促进基因重组。
（二）放线菌的杂交育种
基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似．
放线菌的遗传体系和杂交原理：
异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无
重组体出现。
接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分
合子。整+部分、部分+部分。
异核系的形成：部分合子产生的无性繁殖系。能在基
本或选择培养基上生长。
（单交换，二体区）
重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重
组子，产生重组子孢子。
放线菌的杂交方法：
1）混合培养法
A）选择性平板法：将带有互补的营养缺陷型的两个亲株混合后，接种到丰富培养基上，待孢子形成后制备单孢子悬液，然后在选择性平板上分离，长出的单菌落即为各种不同类型的重组体。
B）异核系分析法
2）平板杂交法
先将菌株培养在非选择性培养基上，在菌落形成孢子后，用影印法把菌落印至已铺有试验菌孢子的完全培养基平板上，再培养至孢子形成，然后将此孢子影印到一系列选择性培养基上，筛选各种重组体子代。
3）玻璃纸转移法
（三）霉菌的杂交育种
?1、准性生殖的过程
?准性生殖是指真菌不通过有性生殖的基因重组过程。准性生殖过程包括异核体的形成、
杂合二倍体的形成和体细胞的重组。
霉菌的准性循环
?2、霉菌的杂交技术
?步骤：
?1）选择直接亲本。
?2）异核体的形成。在基本培养基上，接种两个营养缺陷型亲本，强迫其进行营养互补。?3）双倍体的检出。可以从扇面上直接挑出孢子进行分离纯化，获得双倍体。也可以把异
核体菌丝打碎，在基本培养基和完全培养基平板上分离异核体菌落。还可以将大量异核体孢子分离于基本培养基上，从中长出野生型原养性菌落，挑出分离纯化即得杂合双倍体。
?4）分离子的检出。将杂合双倍体单孢子分离于完全培养基平板上，培养至菌落成熟，检
查菌落的斑点或扇面，从斑点处挑取孢子接种到完全培养基上斜面上，培养后经过纯化和鉴别即得分离子。然后用选择性培养基筛选分离子。
四）原生质体融合技术
?原生质体融合就是把两个亲本的细胞壁分别通过酶解作用加以瓦解，使菌体细胞在高渗
环境中释放出只有原生质膜包裹着的球状体（称原生质体）。两亲本的原生质体在高渗条件下使之混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝聚，发生细胞融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。在再生成细胞的菌落中就有可能获得具有理想性状的重组子。
原生质体融合育种步骤
1．标记菌株的筛选和稳定性验证。
2．原生质体制备。
3．等量原生质体加聚乙二醇促进融合。
4．涂布于再生培养基，再生出菌落。
5．选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。
6．生产性能筛选。
原生质体融合育种的要点
（一）标记菌种的选择
获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种，筛选出营养缺陷型或（和）抗药性菌株。
这里最重要的是标记必须稳定。
采用抗药性菌株除可作标记外，在实验室中还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合的成功，可以采用多标记菌种。
(二)原生质体的制备
原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加入细胞壁分解酶，将细胞壁剥离，结果剩下由原生质膜包住的类似球状的原生质体，它保持原细胞的一切活性。
在放线菌和细菌中，制备原生质体主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或纤维素酶等。
（三）原生质体的融合
（１）聚乙二醇融合法
作用原理：带负电荷的聚乙二醇和带正电荷的Ca2+与细胞表面的分子相互作用，形成分子桥，使带电的原生质体膜容易附着而促进融合。
（２）电融合法
原理：基于电降解和双向电泳。其过程就是原生质体在电场中极化成偶极子，并沿电力线方向排列成串，再加直流脉冲击穿原生质体膜，导致原生质体发生融合。（四）原生质体的再生
把融合的原生质体涂布于添加渗透稳定剂的高渗琼脂培养基上，或者把原生质体悬液混合在培养基中，进行琼脂夹层培养，使其再生细胞壁。
（五）融合子的选择
融合子的选择主要靠两个亲本的选择性遗传标记，在选择性培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。
五）DNA重组技术
?DNA重组技术（DNA recombination technology)：是指按人的意志，将某一生物（或供
体）的遗传信息在体外经人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另一生物体（受体）细胞中，使被引入的外源DNA片段在后者内部得以表达和遗传。
分子育种：就是利用基因工程技术、原理和设备，在分子水平上改良菌种。
分子育种改良菌种主要有以下几个方面：
1、增加生物合成基因量而增加抗生素产量；
2、导入强启动子或抗性基因而增加抗生素产量；
3、把两种不同的生物合成基因在体外重组后再导入受体内而产生杂交抗生素；
4、激活沉默基因，以产生新的生物活性物质或提高抗生素产量；
5、把异源基因克隆到宿主中表达，以期待彻底改变生产工艺。
DNA重组技术基本过程
?DNA重组技术基本过程是将一个含有目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，并转入一受体细胞（通常多为细菌），使之扩增、表达的操作过程。
?DNA重组整个操作包括：
?（一）含目的基因的DNA片段的准备；
?（二）载体；
?（三）含目的基因的DNA片段与载体在体外连接；
?（四）将重组DNA分子导入宿主细胞，并于其中复制、扩增；
?（五）筛选出带有重组DNA分子的转化细胞；
?（六）鉴定外源基因的表达产物。
含目的基因的DNA片段的准备
?1）通过建立基因文库分离靶基因
?基因文库包括两类：基因组文库；鸟枪法。
?cDNA：即反转录法。用mRNA反转录成单链DNA，再经DNA聚合酶的作用产生双链DNA。可去除真核生物基因中不表达的内含子。
?鸟枪法：目前一般用限制性内切酶切开染色体DNA。该法常用于建立基因文库和原核生物基因的克隆。
?2）人工合成
2、PCR技术
?根据需扩增片段的两端设计引物。
?使DNA解链（高温），引物结合于基因的两端（低温），在合适温度下开始合成（链延长）反应。
?特点：需要很少的DNA模板，且能直接从基因组中得到目的基因。
DNA扩增
载体
?载体(vector)是携带外源DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的DNA；
?载体一般是通过改造质粒、噬菌体或病毒等构建的。
含目的基因的DNA片段与载体在体外连接
?主要有两种方式：黏性末端黏接与钝端的拼接。通常用T4DNA连接酶进行。
?（1）黏端连接：如果将外源DNA及载体用一种酶或具有同一黏性末端的酶切开，会产生相同的黏性末端，在退火时能很方便地配对。这是最常用的连接方法。
?（2）平头连接：如供体与载体的5’端及3’端产生平头，也可用T4连接酶连接，但酶量要加大，因此不被普遍采用。
?（3）加接头：接头是使两种DNA片段连接起来时所使用的核苷酸链。
转化
转化是指细胞在一定生理状态（感受态）时可摄取外源遗传物质，并经体内重组，成为其染色体的一部分，导致受体细胞某些遗传性状发生改变。在基因工程中将重组质粒送入受体细胞，尽管不一定发生重组现象，但宿主因而发生某些遗传特性的变化，也称之为转化。
转染和感染
?利用噬菌体DNA作为载体时可经两种方式导入受体菌。一种是感染，即在体外将噬菌体DNA 包装成病毒颗粒，然后使其感染受体菌。另一种方式是转染，即在DNA连接酶作用下使噬
菌体DNA环化，再象重组质粒一样转化进受体菌。但习惯上常把以噬菌体DNA为载体构建成的重组子导入细胞的过程统称为转染。
宿主细胞必须符合以下条件
?１）对载体的复制和扩增没有严格的限制；
?２）不存在特异的内切酶体系降解外源DNA；
?３）在重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰；
?４) 重组缺陷型，不会产生体内重组；
?５) 容易导入重组DNA分子；
?６) 符合重组DNA操作的安全标准。
表达产物鉴定
?1）DNA序列测定
?这是从密码的角度来判断产物的准确与否。此法是在已知该目的基因产物（肽或蛋白质）一级结构的基础上进行的。
?2）产物鉴定
?直接测定产物的活性、功能或氨基酸序列；也可通过免疫沉淀来验证产物的存在。?3）功能互补
?具体进行时，可与初筛工作同时进行，但对一些非受体系统的蛋白或肽，如真核基因产物，无法在受体中直接观察其功能，有时可通过宿主遗传标记得到校正而被识别。
六）基因工程菌的稳定性
?基因工程菌在传代中常出现质粒不稳定和表达产物不稳定现象。质粒不稳定常分为分裂不稳定和结构不稳定两种情况。质粒的分裂不稳定是指基因工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。质粒的结构不稳定是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起基因工程菌性能的改变。
1、工程菌不稳定性的表现：
1）质粒丢失
2）重组质粒发生DNA片段脱落
3）表达产物不稳定
2、解决工程菌不稳定性的对策：
1）组建合适载体
2）选择适当宿主
3）施加选择压力：抗生素添加法、抗生素依赖变异法、营养缺陷型法
?4）控制基因过量表达
?5）控制培养条件
?6）在质粒构建时，插入一段能改良宿主细胞生长速率的特殊的DNA片段，也能起到稳定质粒的效果。
?7）可转移性因子会促进插入和丢失的出现，因此所使用的质粒不应带有可转移因子。?8）冗长的DNA对宿主细胞是一种负担，并会增加其体内进行DNA的重排，所以尽可能将质粒上的不需要的DNA部分除去。
?9）固定化重组菌以提高基因工程菌的不稳定性。
三、菌种保藏
?菌种保藏的基本原理：根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使微生物处于代谢不活泼，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。
?一般可通过降低培养基营养成分、低温、干燥和缺氧等方法，达到防止突变、保持纯种的目的。
理想的菌种保藏方法应具备的条件
(1) 经长期保藏后菌种存活健在；
(2) 保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产
的高产能力；
(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。
一）工业微生物菌种保藏技术
1、转接培养或斜面传代保藏；
2、超低温或在液氮中冷冻保藏；
3、冷冻干燥或真空干燥保藏；
4、土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。
冷冻保藏
?冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。
?通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速度。
?冷冻保藏的缺点之一是培养物运输较困难。
冷冻保藏种类
1) 普通冷冻保藏技术(-20℃)
2) 超低温冷冻保藏技术(-60－-80℃)
3)液氮冷冻保藏技术
1）普通冷冻保藏技术(-20℃)
?将液体培养物或从琼脂斜面培养物收获的细胞分接到试管或指管内，然后贮藏于一冰箱的冷藏室中，或于温度范围在-5～-20℃的普通冰箱(-20℃)中。或者将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。
?用此方法可以维持若干微生物的活力1－2年。
2）超低温冷冻保藏技术(-60－ -80℃)
?要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60℃以下进行保藏。
?在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
?（1）离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞；
?（2）用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；
?（3）加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；
?（4）混匀后分装入冷冻指管或安瓿管中，于-70℃超低温冰箱中保藏。
?如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获菌种悬液。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。
3）液氮冷冻保藏技术
在液氮冷冻保藏中，最常用的冷冻保护剂是二甲亚砜和甘油，最终使用浓度一般为甘油10％、二甲亚砜5％。所使用的甘油—般用高压蒸汽灭菌，而二甲亚砜最好为过滤灭菌。
3. 冻干保藏
?冷冻干燥的基本方法：是在较低的温度下快速将微生物细胞或孢子冻结，保持菌种的细胞完整，然后通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥，这样使细胞的生长代谢等生命活动处于停止状态，得以长期保存。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。
?原理：创造干燥和低温的保藏环境。
?冷冻干燥过程中必须使用冷冻保护剂，常用脱脂牛奶和血清。
?大部分微生物菌种可以在冻干状态下保藏10年之久而不丧失活力。
传代保藏
?传代保藏是指将菌种定期在新鲜琼脂培养基上传代，然后在一定的生长温度下生长和保存的保藏方法。
?广泛适用于细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等的短期保藏。一般保存期3－6个月。?此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。
?因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水
平。
?斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性。
?此方法一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏方法。
矿物油中浸没保藏
?将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温下保藏，此方法简便有效。
?可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。
?矿物油作用：防止培养基失水并隔绝氧气，降低微生物的代谢作用。
?浸没保藏的操作要点：首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油，矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。
?以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡
下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株2～3年也应做一次存活试验。
4、沙土管干燥保藏
?这种保藏方法适用于产生孢子的丝状真菌和放线菌，或形成芽孢的细菌。其原理是造成干燥和寡营养的保藏条件。
?除了用沙、土作为载体外，还可用硅胶、磁珠或多孔玻璃珠来代替。
二）基因工程菌的保藏
?由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。
质粒基因通常为宿主细胞生长非必需的。
?一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快。
?当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。
?专家建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中。
三）微生物活力和稳定性测定
?在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。
?对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。
?成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保藏6个月、1年或更长时间后的存活百分率(或存活单位)；细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性；以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要。作业
?名词解释：自然选育；诱变育种；航天育种；杂交育种；原生质体融合；DNA重组技术?简答：
?1、什么是施加选择性压力分离法？
?2、试述从自然界中筛选工业微生物的步骤和方法。
?3、简述诱变育种的主要程序。
?4、简述原生质体融合育种的基本步骤。
?5、简述DNA重组技术的基本过程。
?6、保存菌种的原理是什么？理想的菌种保藏方法应具备的条件有哪些？
微生物菌种的扩大培养技术
菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序，该工序又称之为种子制备。种子制备不仅要使菌 体数量增加，更重要的是，经过种子制备培养出具有高质量的生产种子供发酵生产使用。因此，如何提供发酵产量高、生产性能稳定、数量足够而且不被其他杂菌污染的生产菌种，是 种子制备工艺的关键。 种子扩大培养的任务 工业生产规模越大，每次发酵所需的种子就越多。要使小小的微生物在几十小时的较短 时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。菌种扩 大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。因为发酵时间的 长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。因此，种子 扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的菌体，而且还要获得活力旺盛的、接种数量足够的菌体。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数，抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，常常采用三级种子扩大培养。一般50 t发 酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。有些酶制剂发酵生产也采用 三级发酵。而谷氨酸及其他氨基酸的发酵所采用的菌种是细菌，生长繁殖速度很快，一般采 用二级发酵。 种子制备的过程 细菌、酵母菌的种子制备就是一个细胞数量增加的过程。细菌的斜面培养基多采用碳源 限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。细菌培养温度大多数为37 ℃， 少数为28 ℃，细菌菌体培养时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培养5～10天。 霉菌、放线菌的种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制 备和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。 ⒈孢子制备 孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。孢子的质量、数量对以后菌 丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。 ⑴放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些 适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。碳源和氮源不要太丰 富(碳源约为1％，氮源不超过0.5％)，碳源丰富容易造成生理酸性的营养环境，不利于放线 菌孢子的形成，氮源丰富则有利于菌丝繁殖而不利于孢子形成。一般情况下，干燥和限制营 养可直接或间接诱导孢子形成。放线菌斜面的培养温度大多数为28 ℃，少数为37 ℃，培养 时间为5～14天。
蘑菇菌种与生产知识
蘑菇菌种与生产 蘑菇生长繁殖离不开菌种。在英语中，蘑菇菌种译为“Spawn”，此词来源于拉丁文，为扩大的意思，因此蘑菇接种的本意是“移植”。 第一节有关菌种的概念 蘑菇的“种籽”是孢子，通常所用的菌种是菌丝体，相当于高等植物的秧苗。种籽一般处于休眠状态，而秧苗常处于生长状态。蘑菇栽培用的菌种是菌丝体，就如水稻不用种籽，而用秧苗一样。 蘑菇菌种由三部分组成，即蘑菇菌株的纯菌丝体、菌丝体着生的基质和包装容器。蘑菇菌种因培养基质结构不同，有固体菌种与液体菌种之分。在固体菌种中，按基质成分的不同，又分为粪草菌种、谷粒菌种等。若按菌种生产繁殖过程的先后，又有母种、原种、栽培种之分，或称其为一级种;二级种、三级种。 蘑菇菌种的生产与作物种子的扩繁有本质的差别，其原因是菌种生产为无性繁殖过程，不发生遗传重组，母种、原种和栽培种之间的基因型是不变的，所以蘑菇菌种的分级尤其是原种与栽培种的划分是人为的。在生产实践中，原种与栽培种可能有一定的差别，这种差别不是由于菌种本身种性的差别，而是在菌种生产过程中由于隐性污染，栽培种的纯度可能比原种低。 做为食用菌生产者，弄清有关蘑菇菌种的概念是很有益的，本节介绍有关知识。 一、种、品种、菌株及菌号的区别 （一）种“种”（species）是生物分类的基本单位，在“属”（Genus）之下，特指具有一定形态特性和生理特性以及一定自然分布区的生物类群。同一种的个体之间遗传特性相似，彼此间交配可育。不同种间的个体则不能相互交配或交配后不能产生有生育能力的后代。生物的每个种都有学名，学名按双名法，用两个拉丁词组成。前一个为属名，用拉丁文名词表示，如Agaricus 意为“蘑菇属”;后一个为种名，常用拉丁文形容词表示，以描述该种的主要特征，如bisporus意为“双孢的” 。 （二）品种每一个品种均有共同祖先，有一定的经济价值，是遗传性状比较一致的人工栽培的食用菌群体，蘑菇品种参照农作物对品种的定义(variety指植物；breed指动物)。品种是人工选择的结果，是人们利用同一物种不同个体间的差异，按照人炎的经济目的不断选择培培育而成，能适应环境条件和栽培条件，在产量和品质上比较符合人类的要求。农作物品种一般指具有高产、优质、农艺性状好，可人工大量栽培的品系，所以品种的定义为“具有生产应用价值的菌株”。我国农作物品种的应用需要经过品比试验，区域性栽培试验，最后须经过作物品种审定委员会评审，批准后取得品种资格方可应用于生产。因而选育一个优良的品种往往需要几年甚至十几年。 （三）菌株在微生物学中，菌株（strain或line）又称为“品系”、“菌系” 或“小系”，含义是起源于共同祖先的相似的个体，如同一种、同一品种、同一子实体分离出来的纯的培养物。在遗传学中一般是指自交或近亲繁殖若干代后，所获得的遗传性状比较稳定的后代。菌株与品种是两个不同的概念，所有的分离培养物只要具有差异性，都可认为是不同的菌株。而品种强调的是生产性状要有代表性，品种可以是某一菌株，但不是所有的菌株都是品种，因为品种必须经过权威部门审定。优良菌株经过鉴定、品比、繁育后，即可成为品种。菌株可作为育种材料，但不是所有的菌株都具有生产应用价值。 不同菌株之间的差异可以是形态差异，也可以是农艺性状或是生理生化方面的差异。区别不同菌株传统的做法是进行拮抗实验或极性测定，现在还可应用同工酶图谱、DNA指纹图谱等鉴别技术。 （四）菌号按国际细菌命名法规（1976），菌株(Strain number)的命名可用任何形式，可
发酵来源的化学药物的菌种鉴别
发酵来源的化学药物的菌种鉴别 审评四部审评七室 张明平 通过发酵获得的化学药物同其他化学合成的药物一样，审评时应适用同样的技术要求。但通过发酵获得的化学药物同纯化学合成的药物也存在不一样的特点，在应用以上原则时会有不同的具体要求。在发酵的过程中，原本在化学合成中的一步或多步化学反应在菌体内，通过菌体的初级或次级代谢完成。而目前尚无有效手段，可对这些代谢过程如调控化学反应一样进行精细的监控。但可以通过对菌种，发酵条件和工艺过程的确认，间接的判断生产工艺的可行性。为了降低这种间接的判断带来的药品质量方面的安全性风险。因此研发单位应对菌种鉴别和发酵工艺进行深入研究；寻找药品质量与二者之间的直接联系，判断和控制影响药品质量的关键参数。 本文将根据文献调研的结果，结合审评工作的实践，对发酵来源的化学药物的菌种鉴别的技术要求谈一点自己的看法。 通过发酵得到的药物很多，大体可分为以下三类。第一类是由生物整体或部分实体的药物；如菌苗、疫苗、类毒素等自动免疫制品；抗毒素、抗血清等被动免疫制品；诊断用菌液、血清、毒素、抗原、抗体等诊断制剂以及治疗用抗体制剂等，统称为生物制品。该类制品不在本文讨论的范畴。第二类为微生物初级代谢产物；如构成机体大分子骨架的氨基酸、核苷酸，和辅酶、酶的辅基、维生素等非机体构成物以及与物质代谢、能量代调有关的有机酸、醇类等。第三类为来源于微生物次级代谢产物的药物；其中最著名的一类药物就是抗生素；其他还包括酶抑制剂与诱导剂，免疫调节剂与细胞功能调节剂、受体拮抗剂与激动剂以及具有其他药理活性的物质。 初级代谢产物和次级代谢产物的生产依赖于其生产菌种特异性的积累目标产物，因此原则上要求菌种鉴别的专属性越高越好；一般应当将生产菌株与同种不同株的其他菌株区分开。对菌株进行鉴别提供形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学成分四方面的资料。此外还
生产菌种的扩大培养与保藏
生产菌种的扩大培养与保藏 目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。要从保藏在试管中的微生物菌种逐级扩大为生产用种子是一个由实验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不同的生产品种和菌种种类而异。如细菌、酵母菌、放线菌或霉菌生长的快慢；产孢子能力的大小；及对营养、温度、需氧等条件的要求均有所不同。因此，种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。种子液质量的优劣对发酵生产起着关键性的作用。 种子扩大培养：是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。 发酵工业生产过程中的种子的必须满足以下条件： （1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短； （2）生理形状稳定； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； （4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力。 第一节种子的制备过程 在发酵生产过程中，种子制备的过程大致可分为两个阶段： （1）实验室种子制备阶段 （2）生产车间种子制备阶段
一、实验室种子的制备 实验室种子的制备一般采用两种方式： 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌。对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。 （一）孢子的制备 1，细菌孢子的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。培养温度一般为37℃。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。 2，霉菌孢子的制备 霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。培养的温度一般为25~28℃。培养时间一般为4~14天。 3，放线菌孢子的制备 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间为5~14天。 （二）液体种子制备 1，好氧培养 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产链霉素的灰色链霉菌（S. griseus）、产卡那霉素的卡那链霉菌（S. Kanamuceticus）可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。其过程如下： 试管→三角瓶→摇床→种子罐 2，厌氧培养 对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等），其种子的制备过程如下： 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐 例如生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或MYPG培养基（培养基配制：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克琼脂与升水中）的斜面上，于4℃冰箱内保藏。每年移种3-4次。将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培养2-3天后，再扩大至含有250-500ml 麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于25℃培养2天后，移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培养罐中，于15-20℃培养3-5天即可作100L麦芽汁的发酵罐种子。从三角
第二章 生产菌种的选育
第二章生产菌种的选育 工业化菌种的要求 ?能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物 ?有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强 ?遗传性能要相对稳定 ?不易感染它种微生物或噬菌体 ?产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关） ?生产特性要符合工艺要求 生产菌种的育种方法 第一节工业微生物的分离筛选 (Separation and screening) 一、菌种的来源 ?根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；?从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 二、从自然界中分离筛选菌种的方法步骤 从自然界中分离筛选菌种的目的是高效地获取一株高产目的产物的微生物。 具体步骤如下： 1.采样：有针对性地采集样； 2.富集培养：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能； 3.纯种分离：纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落； 4.菌落的选择：利用筛选模型，选择具有目的产物合成能力相对高的菌株；
5.生产性能测定：测定代谢产物或其它目的性状。 采样 1、采样对象 以采集土壤为主。 根据微生物营养类型。 根据微生物的生理特性。 极端环境条件下。 ?2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 ?3、采土方式： 在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛 入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件 等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分 批寄回，以便及时分离。 富集方法（enrichement） 物理方法：加热、膜过滤等 等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连 续）后使目的微生物在种群中占优势。 纯种分离 1．稀释分离法 2．平板划线分离法 ⑴涂菌： ⑵划线分离： 菌株分离（seperation）就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、有效的方法对它们进 行分离、筛选，进而得到所需的微生物的过程。
第二章 菌种选育
第二章菌种选育 带图象分析系统的微生物菌种 显微观察装置 一、菌种的来源 ?根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买； ?从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 1、分离思路 ?新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 ?实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。 ?有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。 2、新种分离与筛选的步骤 3、具体方法 ?1）采样 ?2）样品的预处理 ?3）纯种分离 ?4）生产性能的测定 1）采样 （1）采样对象 以采集土壤为主。一般田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。 从自然界筛选 ?（2）采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。 ?（3）采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，
盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。 2）样品的预处理 ?在分离之前，含微生物材料的标本首先进行预处理，可大大提高菌种分离的效率。 3）纯种分离 ?在自然界获得的标本，是很多种类微生物的混杂物，一般采用平板划线或平板稀释法进行纯种分离。 ?由于土壤或其它样品中所含的各种微生物数量有很大差别，若估计到要分离的菌种的数量不多时，就得设法增加分离的机率，可通过富集培养增加该菌种的数量。 ?利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的，这种方法又被称为施加选择性压力分离法。 平板划线分离 稀释分离 分离的培养条件--控制营养成分 ?各种微生物对营养物质的要求是有差异的。控制分离培养基的营养成分对提高分离效果是有好处的。 ?用淀粉作为唯一碳源，则具有淀粉酶类的微生物就能很好生长。在一般情况下，也可以按照各大类微生物常用的培养基进行分离，例如分离细菌常用蛋白胨牛肉膏琼脂培养基，分离放线菌常用淀粉琼脂培养基，分离酵母、霉菌常用麦芽汁或米曲汁培养基等。 分离的培养条件--培养基酸碱度 ?微生物生长繁殖的适宜酸碱度是不同的。细菌和放线菌一般要求中性或偏碱性的培养基（pH7.0或稍高），酵母和霉菌一般要求偏酸性（pH4.0~6.0）。所以，结合一定的营养，将培养基调至一定的pH值，更有利于排除不需要的微生物类型。
2015版药典菌种传代 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书
2015版药典菌种传代中国药典2010年版二部及菌种使用 说明书 导读:就爱阅读网友为您分享以下“中国药典2010年版二部及菌种使用说明书”的资讯，希望对您有所帮助，感谢您对https://www.360docs.net/doc/7111713197.html,的支持! 依据: 中国药典2010年版二部及菌种使用说明书 1.标准菌的来源 标准菌株由中国药品生物制品检定所医学菌种保藏中心(China Medical culture collection ,CMCC)提供的冷冻干燥菌种(0代)或由上级药检部门已接种好的菌种斜面(3代)。黑曲霉的0代菌种为保存于含15%甘油的0.9%无菌氯化钠溶液中的孢子悬液冷存管。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌种的标签 1 CMCC(B)代表细菌(bacteria),CMCC(F)代表真菌(fungi)每种菌具有固定的代号。 2.标准菌的验收 从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括:菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于,20?，有效期为三年。从上级药检部门购买的已接种好的菌种斜面(3代)应检查菌种管是否完好。储存于2, 8 ?，有效期为3个月。 3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备
3.1物品及试剂:接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球 3.2培养基 2 改良马丁琼脂培养基:用于黑曲霉复苏、复壮. 液体硫乙醇酸盐培养基:用于生孢梭菌复苏、复壮. 营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。 改良马丁培养基:用于白色念珠菌复苏、复壮. 3.3操作步骤: a.打开洁净工作台。 b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。 c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开(开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂)。 d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5,0.8 ml 到安瓿中。 e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌 3 种和液体培养基充分混合并完全溶解。 f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。 g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度(细菌培养温度30,35?，培养18,24小时;真菌培养温度23,28?，培养3,5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长;若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。 h.黑曲霉的菌悬液先室温待菌悬液融化后用无菌吸管吸取管内液体1,2滴滴在改良马丁琼
为菌种来源
Exp.1 Cultural transfer techniques 結果： 表一、S. aureus broth culture 為菌種來源 表二、S. aureus slant culture 為菌種來源 回答課本問題：1、2、3 Exp. 2 Techniques for isolation of pure cultures 結果： Part A：檢視分離菌的分布及菌落特徵
Part B ：繪製瓊脂斜面上細菌之分布及生長 菌種：S. aureus 顏色： 回答課本問題：1、2 Exp.3 Cultural characteristics of microorganisms 結果：
Exp. 8 Preparation of bacterial smears 回答課本問題：1、2、3 Exp.9 Simple staining 1. 畫出代表視野中之微生物形態。 2. 描述各菌之形狀（桿菌、球菌、螺旋體）及其排列（鏈狀、成簇、成對）。 回答課本問題：1、2、3 Exp.10 Negative staining 繪製一鏡檢視野 菌名： 形狀： 排列： 回答課本問題：1、2、3 Exp. 11 Gram stain 1. 繪製一代表視野。 2. 描述各菌形態、排列及呈色，並根據顏色將菌分為革蘭氏陽性菌或陰性菌。
回答課本問題：2、3、4 Exp. 12 Acid-fast staining 1.繪製一代表視野。 2.描述各菌形態、排列及呈色，並根據顏色將菌分為抗酸性菌或非抗酸性菌。 ＊回答課本問題：1、2、3 Exp. 13 Differential staining for visualization of bacterial cell structures Part A: Spore staining procedure 1.畫出各菌之代表視野。 2.描繪內胞子於生長型細胞中之位置，如中央、近終端或終端等。 3.表明內胞子及生長型細胞之顏色。
菌种保藏方法
菌种保藏方法 (来源:微生物保藏管理中心) ?定期移植法 亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。 操作步骤如下： 1 培养基制备 1.1 器皿准备 培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。 1.2 溶解培养基配料 先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。 1.3 调pH值 配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 1.4 加凝固剂 配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。 1.5 过滤分装 在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。 1.6 包扎标记 将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。 1.7 灭菌 根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。 1.8 斜面摆放 灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。 1.9 无菌检查 将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。 2 接种 2.1 斜面接种 2.1.1 点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。 2.1.2 中央划线 从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。 2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 从斜面底部自下而上划“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。