第二章菌种的来源
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第二章+菌种的来源1
第二章：发酵工业菌种 一、常用的工业微生物 二、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 三、发酵工业菌种改良
对产物进行菌种筛选时，有两条经验： 对产物进行菌种筛选时，有两条经验：
进化上向上兼容 次生代谢在进化上后移， 次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才有 筛选意义。 筛选意义。
最常用的工业微生物
细菌
醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 醋杆菌属的醋化醋杆菌、 乳酸杆菌 枯草杆菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌 谷氨酸棒状杆菌
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工 业目的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株 寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。 寻找老产品的新的优良菌株。 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点 选择性 灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤
样品采集
→样品的预处理→目的菌富集培养
→菌种初筛→菌种复筛→菌种发酵性能鉴定 →菌种保藏。 菌种保藏。
3. 新种分离与筛选的步骤
查阅资料） 调查研究（查阅资料）
菌种纯化
试验方案设计
所需微生物？） 样品采集（所需微生物？）
初 筛
A
µ
B
S0
基质浓度对A、 两种菌的比生长速率 两种菌的比生长速率（ ） 基质浓度对 、B两种菌的比生长速率（µ）的影响
富集什么菌株？ 当S<S0时，富集什么菌株？ 富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
对产物进行菌种筛选时，有两条经验： 对产物进行菌种筛选时，有两条经验：
进化上向上兼容 次生代谢在进化上后移， 次生代谢在进化上后移，芽孢菌以上才有 筛选意义。 筛选意义。
最常用的工业微生物
细菌
醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 醋杆菌属的醋化醋杆菌、 乳酸杆菌 枯草杆菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌 谷氨酸棒状杆菌
2. 分离筛选工作在实际中应用的几个方面
从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于工 业目的的优良菌株 ； 从已知菌种和大自然中分离新菌株 寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找新的发酵产品的产生菌； 寻找老产品的新的优良菌株。 寻找老产品的新的优良菌株。 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 从保藏机构获取菌种进行分离筛选有两个好处： 经济性 指导性
设计筛选方案时必须考虑两个要点 选择性 灵敏度
3. 新种分离与筛选的步骤
样品采集
→样品的预处理→目的菌富集培养
→菌种初筛→菌种复筛→菌种发酵性能鉴定 →菌种保藏。 菌种保藏。
3. 新种分离与筛选的步骤
查阅资料） 调查研究（查阅资料）
菌种纯化
试验方案设计
所需微生物？） 样品采集（所需微生物？）
初 筛
A
µ
B
S0
基质浓度对A、 两种菌的比生长速率 两种菌的比生长速率（ ） 基质浓度对 、B两种菌的比生长速率（µ）的影响
富集什么菌株？ 当S<S0时，富集什么菌株？ 富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？
第二章+菌种来源
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
8、短杆菌 (Brevibacterium) 氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也 是酶法合成生产辅酶A的菌种
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
细胞直杆状，G－，无芽孢，极生鞭毛
在含蔗糖的琼脂平板上形成圆形、边缘整齐、粘稠光滑的黄 色菌落；液体培养形成黄色粘稠的胶状物——荚膜多糖，其黄色 为一种水溶性色素 野油菜黄单胞菌(X. campestris) 可以淀粉生产黄原胶(Xanthan gum)
AS1.393 蛋白酶 BF7658 -淀粉酶
2、大肠杆菌 (Escherichia coli)
可利用大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸、缬氨酸等 大肠杆菌的谷氨酸脱羧酶在工业上被用来进行谷氨酸 的定量分析 基因工程的很好材料
3、乳酸杆菌 (Lactobacillus sp.)
革兰氏阳性，无芽孢，厌氧或兼性厌氧
3、根据代谢控制的要求，选择单产高的营 养缺陷型突变株或调节突变株或野生菌株。 4、选育抗噬菌体能力强的菌株，使其不易 感染噬菌体。 5、菌种纯粹，不易变异退化，以保证发酵 生产和产品质量的稳定性。 6、菌种不是病原菌，不产生有害的生物活 性物质和毒素，以保证安全。
（一） 细菌 （二） 放线菌 （三）酵母菌 （四）霉菌
可由菌体提取大量脂肪、-胡萝卜素
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii ) 又名棉病囊霉，能危害许多重要的经济作物，如棉 花、柑橘、番茄等 该菌具有大量合成核黄素的能力，是核黄素生产的 重要菌种
9、毕赤氏酵母 ( Pichia ) 能利用石油或农副产品及工业废料产生菌体蛋 白，有些菌株能生产麦角固醇、苹果酸、磷酸甘露 聚糖 近年来其在基因工程中的作用日益得到重视
2菌种的来源
工业微生物应具备的要求 如何从自然界中分离微生物一、工业化菌种应具备的条件A.生产成本1.工艺条件:2.能源消耗:3.生产周期:简单廉价的培养基快速的繁殖速率温和的反应条件B. 生产质量1.产量:2.质量纯度：代谢途径尽可能简单，副产物少无毒：菌种不致病，或不易染菌稳定：菌种优良性状稳定能利用廉价培养基，目标物产量高，稳定性好，繁殖快，所需的生产条件温和，抗污染能力强，不致病等特点目标产物产量高二、目的微生物从自然界中分离采样时要注意的问题结合产品特点和微生物的生理特征有选择的采集土样注明时间、地点、温度、气候等客观环境条件如何使样品中所含微生物的可能性大？问题1：¾富集方法三、目的微生物富集的一些基本方法¾富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。
物理法：加热、膜过滤、离心等化学法：pH ，温度，底物，培养时间等如：细菌和放线菌的分离？(生物特性的利用，耐热)（μ）筛选，存max在选择压力的控制、移种时间和次数等问题μ）筛选基质浓度对/jpkc四、菌落的分离从产物角度出发在培养时以产物的形成有目的的设计培养基利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素从形态的角度菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。
如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选采样（造纸厂）→80度30分钟处理文献:产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌0.0075%曲利本蓝＋1%CMC （羧甲基纤维素），pH10.5培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落从285个土样中获得62株26株为组成型36株为诱导型↓工业微生物应具备的要求 如何从自然界中分离微生物富集的目的和一般方法分离的一般方法小节思考题微生物工程概念简述一般菌种分离和筛选步骤？工业生产上的优良菌种应该具备的哪些基本特性菌种的分离分为和＿＿＿法，如果样品中所需微生物并不一定是优势菌或数量有限，则可采用＿＿＿＿方法增加待分离菌的数量。
第2章 生产菌种的来源
诱饵法
2.2
菌种的分离
2．2．1 施加选择性压力分离法
在自然界获得的标本,是很多种类微生物的
混杂物,一般采用平板划线或平板稀释法进行纯
种分离。但大多数采集的样品中，所需微生物并
不一定是优势菌或数量有限。
为了增加分离成功率，可通过富集培养增加
待分离菌的数量。
富集培养
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖
诺卡氏菌 游动放线菌属 小瓶菌属 角质菌属
处理方法 加热，55℃，6分钟
100℃，1h或40℃， 2—6h 膜过滤法 离心法 空气搅拌法
土壤、根土 水 海水、污泥 发霉的稻草
化学方法
含1%几丁质培养基 用CaCO3提高pH进 行培养
用涂石蜡的棒置于碳 源培养基中 花粉 蛇皮 人的头发
土壤 土壤
土壤 土壤 土壤 土壤
2.2.2.4 抗病毒药物产生菌的分离
• 由于病毒增殖是在细胞内，药剂难以达到。利用 作用于核酸的方法筛选得到的药物毒性高。
– 如利用鸡胚线维芽细胞的噬菌斑形成法，发现了抗病 毒的壳二孢氯素（Ascochlorin）和衣霉素 （Tunicamycin）。 – 用小平板测定由病毒引起的细胞变性效果（CPE）也 是一种有用的筛选方法。 – 检测病毒复制中特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶 抑制剂，也是一种选择性更高的筛选方法。
• 一般认为能作用于细胞表面酶的物质，可能具有 免疫修饰作用。 • 因此以存在于细胞表面的氨基肽酶B，白氨酸氨 基肽酶，氨基肽酶A，碱性磷酸脂酶为靶性物质， 研究了这些酶的抑制剂，发现抑制这些酶，会增 强细胞性免疫或抗体产生能力。 • 这说明可以用细胞表面酶的抑制法，筛选免疫激 活剂产生菌（见书p21）。
细菌菌种筛选的原则
第二章生产菌种的来源
32
工业发酵菌种必须具备的基本特征
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能生成较 多的发酵产物； 培养条件如温度、渗透压等易于控制； 抗杂菌和抗噬菌体能力较强； 遗传稳定性高、不易退化； 不产生有害的生理活性物质或毒素（食品或医药微生 物菌株）
33
4、性能测定（毒性试验）
自然界的一些微生物在一定条件下会产毒； 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作 为食用无须作毒性试验外，其他均需 2年以上的毒性试 验； 医药卫生上的产品，还须通过安全试验和临床试验，获 得国家的药品生产许可证，方能使用； 生产性能测定； 生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、温度、 pH值、提取工艺等； 经自然界分离筛选获得的有价值的菌种进一步进行人工 选育。
具体方法： 在固体选择培养基中加入酶作用的底物培养微生物，能够 利用此底物的酶产生菌得以生长，并且往往会在其菌落周 围形成一透明圈。 透明圈的大小与酶活力的高低成正相关，可以作为菌种初 筛的判断标准。 如：蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤 维素酶等
22
目的微生物筛选方法的研究进展 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。 微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干 年的研究重点。 －－陈文新院士 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定 目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作 用。如 :16SRNA同源性分析，基因序列分析及 DNA/DNA杂交技术等。
30
几种重要生物活性物质产生菌的分离方法 抗病毒药物产生菌：用小平板测定由病毒引起的细胞 变性效果，是一种有用的筛选方法；检测病毒复制中 特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂，是另一 种选择性更高的筛选方法。
31
生长因子产生菌：通过观察分离菌能否促进营养 缺陷型菌株的生长来检出。 免疫激活剂产生菌：可以用细胞表面酶的抑制法， 筛选免疫激活剂产生菌； 多糖产生菌：可以通过菌落外观的观察来识别 （黏稠)
菌种的来源
BCRC 台湾生物资源保藏研究中心，台湾新竹
长江大学生科院生物工程系
13
国外菌种保藏机构
ATCC(American Type Culture Collection）美 国典型菌种保藏中心 NBRC (NITE Biological Resource Center)日本 技术评价研究所生物资源中心 NRRL (Agricultural Research Service Culture Collection) 美国农业研究菌种保藏中心 CBS (Centraalbureauvoor Schimmelcultures) 荷兰微生物菌种保藏中心 UKNCC (The United Kingdom National Culture Collection ) 英国国家菌种保藏中心
2018年10月18日星期四
ISF 中国农业科学院土壤肥料研究所 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 SIA 四川抗菌素工业研究所 AS 中国科学院微生物研究所 CFCC 林业微生物菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 NICPB 卫生部药品生物制品监察所 CVCC 兽医微生物菌种保藏管理中心 YM 云南省微生物研究所 CCTCC 中国典型培养物保藏中心 CMBGCAS 海洋微生物中心 CUHK 香港中文大学保藏中心
国内菌种保藏机构27
ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 SH 上海市农业科学院食用菌研究所 IA 中国医学科学院抗菌素研究所 CGMCC 普通微生物菌种保藏管理中心 AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 CAF 中国林业科学院菌种保藏管理中心 IFFI 轻工业部食品发酵工业科学研究所 ID 中国医学科学院皮肤病研究所 IV 中国医学科学院病毒研究所 CIVBP 中国兽医药品监察所 GIMCC 广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心 CCDM 华中农业大学菌种保藏中心 HKUCC 香港大学保藏中心
第二章 生产菌种的来源
4、其他防线菌生产的抗生素
其他生产的抗生素的防线菌有： 诺卡氏 其他生产的抗生素的防线菌有 ： 菌 形 放 线 菌 （ Nocardioform Actinomycetes ） 、 游 动 放 线 菌 （ Actinoplanetes ） 及 足 分 枝 菌 （Maduromyetes）。
5、青霉属（Penicillum） 青霉属（
6、粘细菌（Myxobacteria） 粘细菌（
粘细菌次级代谢产物中抗菌活性物质的检 出率非常高，并且许多都是新发现的抗生素。 出率非常高 ， 并且许多都是新发现的抗生素 。 如纤维素堆囊菌（ 如纤维素堆囊菌 （ Sorangium cellulosum ） 产 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、 生的大环内酯类抗生素堆囊菌素、
四、有机酸
柠檬酸 :黑曲霉 ,酵母 (解脂假丝酵母 、解脂 复膜孢酵母季也蒙假丝酵母 ） 乳酸 ：德氏乳杆菌 、赖氏乳杆菌 、植物乳杆 菌 、米根霉 苹果酸 ：黄曲霉 、米曲霉 、寄生曲霉 、华根 无根根霉、 霉 、无根根霉、膜醭毕赤酵母 衣康酸 ：土曲霉 、衣康酸曲霉、假丝酵母S-10 衣康酸曲霉、假丝酵母S
青霉菌属于腐生菌， 青霉菌属于腐生菌，广泛生存于土壤和 腐败的水果和蔬菜中。 腐败的水果和蔬菜中。 由于第一个工业化生产的抗生素青霉素是 中发现的， 由青霉属中的Penicillum notatum中发现的， 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 至今青霉素极其半合成抗生素仍是产量最大、 用途最广的抗生素， 用途最广的抗生素，因此青霉素在抗生素工 业中具有特别重要的地位。 业中具有特别重要的地位。
纤维素酶
纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的 总称。它不是单种酶， 总称。它不是单种酶，而是起协同作用的多组分 酶系。 酶系。 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 纤维素酶是由绿色木霉、康氏木霉、黑曲霉、 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 青霉和根霉等菌株经深层发酵制成的酶制剂产品。 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、 此外，漆斑霉、反刍动物瘤胃菌、嗜纤维菌、产 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、 黄纤维单孢菌、侧孢菌、黏细菌、梭状芽孢杆菌 等也能产生纤维素酶。 等也能产生纤维素酶。
2、菌种的来源
（4）菌的稳定性。
（5）菌的产物得率和产物在培养液中的浓度。（6）容易从培养 Nhomakorabea中回收产物。
（3）—（6）是用来衡量分离得到的菌种的生产性 能，如能满足这几条便有希望成为效益高的生产菌种。 但在投入生产之前还必须对其产物的毒性，和菌种的 生产性能作出评价。
以上所述菌种有些必须从自然环境中分离得到。 但若是工业微生物学者也可从菌种保藏委员会中索取。 尽管购买菌种的性能一般比较弱，但可作为模型来改 良和发展分析技术，然后再用于评定天然分离株。 理想的分离步骤是从土壤环境开始的，土壤中富于 各种所需的菌。设计的分离步骤应有利于具有工业重 要特性的菌的生长，如加入某些对其他类型菌生长不 利的化合物或采用选择性培养条件。
用连续培养，通过改变限制性基质浓度可以控 制两种菌的比生长速率，
用连续富集技术分离用于连续发酵生产的 菌种特别适合。因用分批富集培养和在固体培 养基上纯化的方法分离得到的菌株在连续培养 中的表现很差。 B 固体培养基的使用
碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋 白。产生一清晰圈。清晰圈的大小不能完全作 为选择高产菌的依据。因在沉浸培养中碱性蛋 白酶的单位与平板上的圈的大小之间不成比例。
2.2.6 未来的发展
近来发展了一种更为理性化的微生物筛选技 术，现已到实用阶段。采用遗传或生理操纵的 办法有可能发现新的代谢物或提高现有分离株 的生产能力。
A 天然基质的选择 现己有可能做到较为定向的选择。在大的 生态环境（海洋）中还有不少新微生物待发掘。 了解生态环境内的微环境变化会有助于分离出 更多的不同类型的菌株。例如在寻找有用产物 时往往忽视了厌氧微生物。
用一种很专一的筛选技术可以检出新的抗菌药物。
B 药理活性化合物的筛选
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菌种的来源
第二章：菌种的来源
微生物的特性及工业微生物的要求 一些工业化产品生产菌种的特点 自然界中有目的微生物分离的原则 菌种选育、分子育种
菌种的来源
❖ 微生物的特性及工业微生物的要求
第一节 微生物的特性及工业微生物的要求
一、微生物的特性 有些微生物能在厌氧的条件下生长 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自 身的生长 有些微生物能进行复杂的代谢 有些微生物能利用较复杂的化合物 有些微生物能在极端的环境下生长
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍 三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于 食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的 仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢杆菌 和地衣芽孢杆菌
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍 三、常用的基因表达系统
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
例：醛肟水解酶的筛选--Journal of biotechnology 94(2002), 65-72
培养基中含0.05% of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基 不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落
菌种的来源
❖ 微生物的特性及工业微生物的要求
二：工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物
有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强
遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关） 生产特性要符合工艺要求
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则 第三节 自然界中有目的微生物分离的原则
一、菌种分离的一般过程
土样的采取 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择
→ 产品的鉴定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 问题： 如何使样品中所含微生物的可能性大
如何在后续的操作中使这种可能性实现
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则 二、采样时要注意的问题
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）
文献:产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌
采样（造纸厂） →80度30分钟处理
↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落
从285个土样中获得62株
26株为组成型 36株为诱导型
菌种的来源
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
➢ 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
AK:天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶 黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成 调节机制
Байду номын сангаас
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
第二节 已工业化产品生产菌的介绍
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
气候、水分、空气 来源要广 结合产品的特点 标签：地点、时间、气候等
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
三、目的微生物富集的一些基本方法
➢富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。
➢富集的三种方案： 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑， 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等 但主要是通过培养的方法
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
定向培养的富集方法
1、底物
2、pH条件
3、培养时间
4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速 度的手段，培养（固体、液体；分批 连续）后使目的微生物在种群中占优 势。
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例：
礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
菌种的来源
二、氨基酸生产有关的微生物
50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点：
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
四、菌落的选出
从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素
从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖
产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍 (二) 真核细胞表达系统
➢ 酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
第二章：菌种的来源
微生物的特性及工业微生物的要求 一些工业化产品生产菌种的特点 自然界中有目的微生物分离的原则 菌种选育、分子育种
菌种的来源
❖ 微生物的特性及工业微生物的要求
第一节 微生物的特性及工业微生物的要求
一、微生物的特性 有些微生物能在厌氧的条件下生长 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自 身的生长 有些微生物能进行复杂的代谢 有些微生物能利用较复杂的化合物 有些微生物能在极端的环境下生长
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍 三、食品酶制剂生产有关的微生物
开发一个新酶，都要经过一系列研究的毒理试验。关于 食品用酶，美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的 仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。
α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草芽孢杆菌 和地衣芽孢杆菌
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍 三、常用的基因表达系统
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
例：醛肟水解酶的筛选--Journal of biotechnology 94(2002), 65-72
培养基中含0.05% of Z-PAOx 每隔2-3天移去一半培养物，补充新鲜培养基 不断分析样品，2-3个月后Z-PAOx降低后，稀释分离条菌落
菌种的来源
❖ 微生物的特性及工业微生物的要求
二：工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成 产物
有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强
遗传性能要相对稳定 不易感染它种微生物或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关） 生产特性要符合工艺要求
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则 第三节 自然界中有目的微生物分离的原则
一、菌种分离的一般过程
土样的采取 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择
→ 产品的鉴定 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物 问题： 如何使样品中所含微生物的可能性大
如何在后续的操作中使这种可能性实现
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则 二、采样时要注意的问题
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选（国家七五攻关项目）
文献:产生菌为中性芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌、放线菌及霉菌
采样（造纸厂） →80度30分钟处理
↓ 0.0075%曲利本蓝＋1%CMC（羧甲基纤维素），pH10.5 培养3～4天，选择有凹陷圈的菌落
从285个土样中获得62株
26株为组成型 36株为诱导型
菌种的来源
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
➢ 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分泌功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
AK:天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶 黄色短杆菌中赖氨酸、苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸的合成 调节机制
Байду номын сангаас
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
氨基酸生产菌的要求： 代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
第二节 已工业化产品生产菌的介绍
一、抗生素生产有关的微生物
抗生素是次级代谢产物，需要生物体进行复杂的代谢， 目前发现的生物来源如下：
放线菌（链霉素 四环素；红霉素 等）
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
气候、水分、空气 来源要广 结合产品的特点 标签：地点、时间、气候等
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
三、目的微生物富集的一些基本方法
➢富集的目的： 让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 得可能。
➢富集的三种方案： 定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件，进行培养。 当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑， 不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
定向培养的方法
物理方法：加热、膜过滤等 但主要是通过培养的方法
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
定向培养的富集方法
1、底物
2、pH条件
3、培养时间
4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速 度的手段，培养（固体、液体；分批 连续）后使目的微生物在种群中占优 势。
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例：
礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
菌种的来源
二、氨基酸生产有关的微生物
50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵，是 发酵工业发展历史上的一个转折点：
代谢控制发酵：用人工诱变的方法，有意识地改变微生 物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地 称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
四、菌落的选出
从产物角度出发 在培养时以产物的形成有目的的设计培养基 利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素
从形态的角度 菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖
产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观 上就可以初步识别。
菌种的来源
❖ 自然界中有目的微生物分离的原则
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
菌种的来源
❖ 已工业化产品生产菌的介绍 (二) 真核细胞表达系统
➢ 酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。