体内药物分析 药学

体内药物分析

分析方法建立后需进行包括准确度、精密度等一系列的评价项目进行验证，请问：对所建立的药物的体外及体内分析方法，其验证要求有何不同，为什么？试举两例文献说明。

药物的分析方法均需验证：准确度、精密度（重复性、中间精密度和重现性）、检测限、定量限、专属性、线性、范围、耐用性

药物分析是测定原料药、制剂及有关杂质的含量，控制药物生产至临床应用前药物的质量；体内药物分析则是药物体内研究和临床用药期间测定生物样品中药物的含量。由于生物样品取样量少、药物浓度低、内源性物质的干扰（如无机盐、脂质、蛋白质、代谢物）及个体差异等多种因素，因此体内药分比药物分析在灵敏度和专属性上的要求更高，自然两者的方法验证要求也不同。

药物分析方法的验证

1、准确度（accuracy）准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，用百分回收率表示。数据要求：规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如制备高、中、低三个不同浓度样品各测三次。

2、精密度（precision）精密度是指在规定条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。用偏差（d）、标准偏差(SD)、相对标准偏差(RSD)（变异系数，CV）表示。

（1）重复性(repeatability):在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度；在规定的范围内，至少用9次测定结果评价

（2）中间精密度同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备所得结果的精密度。

（3）重现性(reproducibility)不同实验室，不同分析人员测定结果的精密度。

3、检测限（limit of detection，LOD）检测限系指试样在确定的实验条件下，被测物能被检测出的最低浓度或含量。

4、定量限（1imit of quantitation，LOQ）指样品中被测物能被定量测定的最低量，结果应具有一定准确度和精密度要求。

5、专属性（specificity ）（选择性）：指有其他成分（杂质、降解物、辅料等）可能存在情况下采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映该方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力，是指该法用于复杂样品分析时是否受到相互干扰程度的度量。

6、线性（Linearity）在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。

线性通常用最小二乘法处理数据求得回归曲线的斜率（Slope）来表示。数据要求：至少需要五个浓度考察线形，需提供相关系数、y截距（是检定的可能偏差）、回归斜率及方差等参数，应列出回归方程数和线性图。

7、范围（Range）：指达到一定精密度、准确度和线性的条件下，测试方法适用的高、低限浓度或量的区间。

范围的确定可因测定项目不同而有不同要求：含量测定范围为80%-120%；含量均匀度范围为70%-130%；杂质测定应为被测杂质限度的50%-120%；溶出度应为测定范围的±20%。

8、耐用性指测定条件稍有变动时，结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。是衡量实验室和工作人员之间在正常情况下实验结果重现性的尺度。

体内分析方法的验证

1、特异性必须证明所测定的物质是原形药物或特定的活性代谢物，内源性物质和相应的代谢物及同时服用的其他药物不得干扰样品的测定。对于色谱法至少要提供6 个不同

来源的空白体内样品色谱图、空白体内样品外加标准物质色谱图（注明浓度）及用药后的体内样品色谱图。

2、标准曲线与线性范围根据所测定物质的浓度与响应的相关性，用回归分析方法获得标准曲线。标准曲线的高低浓度范围为线性范围，在线性范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。必须用至少6个浓度建立标准曲线，应使用与待测样品相同的生物介质，线性范围要能覆盖全部待测浓度，不允许将线性范围外推求算未知样品的浓度。建立标准曲线时应随行空白体内样品，但标准曲线不包括零点。标准曲线上各浓度点的实测值与标示值的偏差（bias）在可接受范围内时，可判定标准曲线合格。标准曲线上各浓度点偏差的可接受范围一般规定为：最低浓度点的偏差在±20%以内，在其余各浓度点的偏差在±15%以内。只有合格的标准曲线才能用于临床待测样品的浓度计算。

3、定量下限定量下限（LLOQ）是标准曲线上的最低浓度点，：要求至少能满足测定3～5 个半衰期时样品中的药物浓度，或Cmax 的1/10～1/20 时的药物浓度，其准确度应在真实浓度的80%～120%范围内。RSD 应小于20%，S/N 应大于 5.应由至少5 个标准样品测试结果证明。

4、精密度与准确度要求选择高、中、低3 个浓度的质控（quality control，QC）样品同时进行方法的精密度和准确度验证。其中，低浓度接近定量下限（lower limit of quantitation，LLOQ），在LLOQ 的3 倍以内；高浓度接近标准曲线的上限（即定量上限，upper limit of quantitation，ULOQ），中间选一个浓度，每一浓度至少测定5 个样品。精密度用QC 样品的批内（intra-batch）和批间（inter-batch）RSD 表示，RSD 一般应小于15%，在LLOQ 附近应小于20%. 在测定批内RSD 时，每一浓度至少制备并测定 5 个样品。为获得批间RSD 应至少在不同天连续制备并测定3 个分析批，至少45 个样品。准确度是指用特定方法测得的体内样品浓度与真实浓度的接近程度，一般应在85%～115%范围内，在LLOQ 附近应在80%～120%范围内。

5、样品稳定性根据具体情况，对含药体内样品在室温、冰冻和冻融条件下以及不同存放时间进行稳定性考察，以确定体内样品的存放条件和时间。还应注意考查储备液的稳定性以及样品处理后的溶液中分析物的稳定性，以保证测试结果的准确性和重现性。

6、提取回收率应考察高、中、低3 个浓度的提取回收率。其结果应一致、精密和可重现。

7、质控样品质控（QC）样品系将已知量的待测药物加入到生物介质中配制的样品，用于质量控制。

8、质量控制应在体内样品分析方法验证完成之后开始测试未知体内样品，每个样品一般测定一次，必要时进行复测。每个分析批均应建立相应的标准曲线，并随行测定高、中、低3 个浓度的QC 样品，每个浓度至少双样本。并应均匀分布在未知样品测试顺序中。当一个分析批中未知样品数目较多时，应增加各浓度QC 样品数，使QC 样品数大于未知样品总数的5%，QC 样品数的增加以组（高、中、低 3 个浓度）为单位。QC 样品测定结果的可接受标准为：偏差应小于15%，低浓度点偏差应小于20%，最多允许1/3 不在同一浓度的QC 样品结果超限。如QC 样品测定结果不符合上述要求，则该分析批未知样品测试结果作废。浓度高于ULOQ 的未知体内样品，应采用相应的空白介质稀释后重新测定。

9、测试结果

应详细描述所用的分析方法，引用已有的参考文献，提供每个分析批的标准曲线、质控样品及未知样品的测试结果及计算过程。还应提供全部未知样品分析的色谱图，包括全部相关的标准曲线、质控样品的色谱图，以供审查。

体内药物分析的特点：