第三章 转录
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第三章生物信息的传递上——转录
全酶（holo enzyme） =核心酶（core enzyme） + σ（西格马）因子
大肠杆菌RNA聚合酶由5个亚基所组成即α2ββ'σ。 全酶：大肠杆菌RNA聚合酶整个酶分子α2ββ'σ 核心酶： σ亚基解离后的其余部分α2ββ'
2020/8/15
β
α
ω
α
β ’
σ
图12-5 E.coli RNA聚 合 酶 的 亚 基 组 成
2、上游启动子元件（upstream promoter element，UPE）
●包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等。
CAAT：-70 - -80bp GGGCGG：-80 - -110bp
●作用：控制转录起始频率。
2020/8/15
2020/8/15
转录因子
● TBP
真
核 生 TAFs
-35 (R)
-10 (B)
+1 (I) RNA
R -35
B -10 I +1
Sextama Box
Pribnow Box Initiation
典型启动子的结构
转录起始点
编码链 模板链
启动子 Pr ibnow盒子
AACTGT
ATATTA
TTGACA
35
16-19bp
5-9bp
TATAAT
10
+1
• RNA包括hnRNA（不均一核RNA，heterogeneous nuclear RNA) 、 mRNA、 rRNA、tRNA、snRNA（小核 RNA,small nuclear RNA）和scRNA（小胞浆RNA，small cytosol RNA) ，它们均与遗传信息的表达有关。
大肠杆菌RNA聚合酶由5个亚基所组成即α2ββ'σ。 全酶：大肠杆菌RNA聚合酶整个酶分子α2ββ'σ 核心酶： σ亚基解离后的其余部分α2ββ'
2020/8/15
β
α
ω
α
β ’
σ
图12-5 E.coli RNA聚 合 酶 的 亚 基 组 成
2、上游启动子元件（upstream promoter element，UPE）
●包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等。
CAAT：-70 - -80bp GGGCGG：-80 - -110bp
●作用：控制转录起始频率。
2020/8/15
2020/8/15
转录因子
● TBP
真
核 生 TAFs
-35 (R)
-10 (B)
+1 (I) RNA
R -35
B -10 I +1
Sextama Box
Pribnow Box Initiation
典型启动子的结构
转录起始点
编码链 模板链
启动子 Pr ibnow盒子
AACTGT
ATATTA
TTGACA
35
16-19bp
5-9bp
TATAAT
10
+1
• RNA包括hnRNA（不均一核RNA，heterogeneous nuclear RNA) 、 mRNA、 rRNA、tRNA、snRNA（小核 RNA,small nuclear RNA）和scRNA（小胞浆RNA，small cytosol RNA) ，它们均与遗传信息的表达有关。
(整理)第三章转录课件
概述●基因表达包括转录（transcription）和翻译（translation）两个阶段。
●RNA分子来自DNA。
储存于DNA双链中的遗传信息通过转录酶促反应按照碱基互补配对的原则被转化成为单链RNA分子。
R N A转录合成的特点☐1、转录的不对称性☐2、转录的连续性☐3、转录的单向性☐4、有特定的起始和终止位点R N A转录合成的特点1、转录的不对称性●双链DNA分子中只有一条链作为RNA模板。
如果DNA的两条链均作为RNA模板，则每个基因必将产生两条互补的RNA。
而遗传学证明每个基因只合成了一条RNA链。
即使合成两条RNA链，其中也只有一条有功能。
事实上，在活体内只存在这两条RNA 链中的一条。
●如将双链DNA加热使之变性，再加入以此DNA为模板所合成的单链RNA，进行退火。
结果除复性的DNA双螺旋外，还形成了DNA-RNA杂种分子。
结果表明只有一条DNA 链被转录。
在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。
2、转录的连续性●RNA转录合成时，以DNA作为模板，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。
●合成的RNA中，如只含一个基因的遗传信息，称为单顺反子；如含有几个基因的遗传信息，则称为多顺反子。
3、转录的单向性●RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为3'→5'，而RNA链的合成方向为5'→3'。
4、有特定的起始和终止位点●RNA转录合成时，只能以DNA分子中的某一段作为模板，故存在特定的起始位点和特定的终止位点，特定起始点和特定终止点之间的DNA链构成一个转录单位，通常由转录区和有关的调节顺序构成。
复制和转录的区别第二节原核生物R N A转录的起始(R N A T r a n s c r i p t i o n p r o m o t i o n i n p r o k a r y o t s)●无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括:模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止。
分子生物学：第3章RNA的转录习题和答案
第三章RNA的转录一、名词解释1．转录2．模板链（反义链）3．非模板链（编码链）4．不对称转录5．启动子6．转录单位7．内含子8．外显子9．sigma因子10．RNA编辑11．核酶12．gRNA 13．GU-AG规则14．转录后加工15．核内不均一RNA 16．RNA复制二、填空题1．由逆转录酶所催化的核酸合成是以_______为模板，以_______为底物，产物是_______。
2．RNA生物合成中，RNA聚合酶的活性需要_______模板，原料是_______、_______、_______、_______。
3．大肠杆菌RNA聚合酶为多亚基酶，亚基组成_______，称为_______酶，其中_______亚基组成称为核心酶，功能_______；σ亚基的功能_______。
4．用于RNA生物合成的DNA模板链称为_______或_______。
5．RNA聚合酶沿DNA模板_______方向移动，RNA合成方向_______。
6．真核生物RNA聚合酶共三种_______、_______、_______，它们分别催化_______、_______和_______的生物合成。
7．某DNA双螺旋中，单链5’… ATCGCTCGA … 3’为有意义链，若转录mRNA，其中碱其排列顺序为5’… _______… 3’。
8．能形成DNA--RNA杂交分子的生物合成过程有_______、_______。
形成的分子基础是_______。
9．DNA复制中，_______链的合成是_______的，合成的方向和复制叉移动方向相同；_______链的合成是_______的，合成的方向与复制叉方向相反。
10．一条单链DNA(+)的碱基组成A2l％、G29％，复制后，RNA聚合酶催化转录的产物的碱基组成是_______。
11．RNA聚合酶中能识别DNA模板上特定起始信号序列的亚基是_______ ，该序列部位称_______。
第3章 生物信息的传递(上)-转录
1. 增强子的定义
增强子(Enhancer)：
位于离转录起始点较远的位置上，具
有参与激活和增强转录起始功能的序列元
件。
2. 增强子的位置
Transcription is controlled by a promoter and enhancer
3. 增强子的作用特点
① 远距离效应
② 无方向性
③ 顺式调节
Lac启动子的-10区和-35区
3.3.2 启动子区的识别
一般认为，RNA聚合酶并不直接识别碱基 对本身，而是通过氢键互补的方式加以识别。 因此启动子功能既受DNA序列影响，又受其构 象影响。
应用：同一表达盒在基因组不同位置可 能有不同的转录强度。
3.3.3 RNA聚合酶与启动子区的结合
◆全酶识别启动子形成闭合二元复合物 ◆解链区开链形成开放二元复合物
Catalytic site resumes elongation
3.1.4 转录终止
当RNA链延伸到转录终止位点时，
RNA聚合酶不再形成新的磷酸二酯键， RNA-DNA杂合链分离，转录泡瓦解， DNA恢复成双链状态，而RNA聚合酶和 RNA链都被从模板上释放出来。
3.2 转录机器的主要成分
3.2.1 RNA聚合酶 3.2.2 转录复合物
RNA聚合酶在起始阶段的尺寸改变
3.3 启动子与转录起始
3.3.1 启动子区的基本结构 3.3.2 启动子区的识别
3.3.3 RNA聚合酶与启动子区的结合
3.3.4 -10区与-35区的最佳间距
3.3.5 增强子及其功能
3.3.6 真核生物启动子对转录的影响
3.3.7 转录的抑制
3.3.1 启动子区的基本结构
《RNA转录》课件
第一节 基本概念
PART ONE
转录(transcription):是指以DNA为模板，在依赖于DNA的 RNA聚和酶催化下，以4中rNTP（ATP、 CTP、GTP和UTP）为原料，合成RNA 的过程。
在有些病毒中，RNA也可以指导合成RNA。
若 干 基 本 概 念 是基因表达的第一步，也是最关键的一步。 以Double Strand DNA中的一条单链作为转录模板 (杂交实验所证实)
有义链 (sense strand) [又称编码链 coding strand]: 指不作模板的DNA单链
2、RNA聚合酶的进入位点
Sextama 框（Sextama Box） -35序列，RNA聚合酶的松弛（初始）结合位点， RNA聚合酶依靠其σ亚基识别该位点 —识别位点（R位点） 大多数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45 重要性:很大程度上决定了启动子的强度 （RNApol 的σ因子） 位置在不同启动子中略有变动
01
RNApol的一个适合位点到达－10序列区域，诱导富
02
含A·T的Pribnow 框的“熔解”， 形成12－17bp的泡状
03
物，同时酶分子向－10序列转移并与之牢固结合
04
开放型启动子复合物使RNApol聚合酶定向
05
两种复合物均为二元复合物（全酶和DNA ）
06
12～17bp
c. 在开放型的启动子复合物中，RNApol的I位点和E位点的 核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（ β 亚基） 三元复合物形成 +1位多为CAT模式,位于离开保守T 6~9 个核苷酸处
反义链 (antisense strand) [又称模板链 template srand] : 指作为模板进行RNA转录的链
第三章 RNA的转录机制
（coding strand）
不对称转录（asymmetric transcription）
5/ 3/
3/ 不对称转录： 1、RNA分子上只有一条可转录 2、模板链并不总是在同一单链上 RNA合成方向：5/→3/
5/
DNA 5´……G G A G T A C A T G T C …3´（编码链，+, ） 3´……C C T C A U G U A C A G …5´（模板链，-，） ↓（转录） 5´…… G G A G U A C A U G U C ……3´ ↓（翻译） mRNA
第3章 生物信息的传递---从DNA到RNA（转录）
本章主要内容
1、转录是基因表达的中心环节 2、转录涉及的酶与过程 3、转录后的加工
转录（transcription）
以DNA为模板，在RNA聚合酶（RNA
polymerase）的作用下合成mRNA，将遗传信息从
DNA分子上转移到mRNA分子上，这一过程称为转 录。
尿苷酸的缺失和添加 1986.R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时
发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸， 1990年在高等动物和病毒中也发现了编辑现象。
锥虫coxII 基因的编辑
T UAUAUGUUUUGUUGUUUAUUAUGUGAUUAUGGUUUUGUUUUUUAUUGGUAUUUUUUAUAUUUA UUUAAUUUGUUGAUAAAUACAUUUUAUUUGUUUGUUAAUUUUUUUGUUUUGUGUUUUUGGUU TT TTTT UAGGUUUUUUUGUUGUUGUUGUUUUGUAUUAUGAUUGAGUUUGUUGUUUGGUUUUUUGUUUU TT TTTT UUGUGAAACCAGUUAUGAGAGUUUGCAUUGUUAUUUAUUACAUUAAGUUGGUGUUUUUGGUUC 图 13-44 锥虫 (T.brucei) coxⅡ基因的部分 RNA 顺序。很多 U(红色)在 DNA 中未编码，而另一些在 DNA 中编码的 T(紫色)在 mRNA 中被删除了。(参考 B.Lewin:《GENES》 Ⅵ,1997，Fig31.16)
转录基本知识
三：RNA合 成过程
起始
双链DNA 局部解开
启动子 （promoter)
RNA聚合酶
终止子 (terminator)
磷酸二酯
键形成
55
离开
延长阶段
5 解链区到达
基因终点 5
终止阶段
5
3 3 3
5 RNA
3
1 起始：RNA聚合酶识别起始区
转录起始需解决两个问题： 1. 必须准确地结合在转录模板的起始区域。 2. DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的
rRNA不单独存在，它与蛋白质结合为核蛋白体，分为 大小亚基，存在于粗面内质网与胞浆中。核蛋白体是 蛋白质生物合成的场所。
snRNA 参与RNA 剪辑
复制和转录的区别
转录是基因表达的中心环节
转录是以 DNA为模板合成RNA, 并且只是以单股DNA 为模板，因此具有不 对称性；
用以转录的单链DNA, 称为模板链, 与复制不同，转录是局部的,从启动 子开始到终止子结束,为一个转录单位;
原核生物的RNA聚合酶 原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成， 即2'。 亚基与转录起始点的识别有关，在转录合成开 始后被释放；余下的部分（2'）被称为核心 酶，与RNA链的聚合有关。
原核生物RNA聚合酶的核心酶和全酶
核心酶 (core enzyme)
全酶 (holoenzyme)
8.电泳：核苷酸、核酸均可以进行电泳，泳动速度 主要由分子大小来决定，因此，电泳是测定核酸分 子量的好方法。
紫外分光光度计 A260/A280和 A260/A230的含义
A260nm是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至 1.0。
03转录及调控-3
（一）真核生物基因表达的特点
1. 细胞的全能性 2. 基因表达的时间性和空间性 3. 转录和翻译分开进行
4. 初级转录产物要经过转录后加工修饰
5. 部分基因多拷贝
6. 不存在操纵子结构 真核生物的mRNA是单顺反子mRNA
(monocistronic mRNA)
胚胎期
ε
胚胎期 δ2 Hb Grow1
原核生物以负调控为主： 原核生物染色质没有核小体结构，DNA没有遮蔽，
催化转录的RNA聚合酶很容易发现启动子，其基 因表达的调节很容易通过阻遏蛋白实现。 负调控提供了一个非常保险的机制：即使调节系 统失灵，蛋白质照样可以合成。很多原核操纵子 （元）系统，原核基因调控普遍涉及特异阻遏蛋 白参与的开、关调节机制。
Transcription
mRNA 5′
3′
1
2
3
Translation
Proteins
1
2
3
3.转录和翻译偶联进行；
4.mRNA翻译起始部位有特殊的碱基序列—SD序 列，共有序列为AGGAGG； 5.原核生物基因表达调控主要在转录水平，即对 RNA合成的调控。
通常有两种方式： (1) 起始调控，即启动子调控 (2) 终止调控(衰减子调控)
转录终止调控方式 ： A.依赖ρ因子的终止调控
噬菌体
B.不依赖ρ因子的终止调控
• 依赖mRNA3′末端转录终止子
• 衰减子介导的转录终止
色氨酸操纵子的表达调控
1.色氨酸操纵子的结构 色氨酸操纵子（tryptophan operon，trp operon）
负责色氨酸合成的操纵子，由启动子和操纵基因 区组成，该操纵基因区控制一个编码色氨酸生物合 成需要的5种蛋白的多顺反子mRNA的表达。
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需RNA引物
不需要引物
特点
半保留复制
不对称转录
RNA合成的检测
• TCA(三氯醋酸)沉淀法：反应体系包括 DNA模板，RNA聚合酶，NTPs，用放射 性同位素至少标记一种NTP前体，保温一 段时间以后加入TCA，RNA不溶于TCA而 生成沉淀，而反应各组分不形成沉淀，然后 用滤纸过滤，在滤纸上的放射性强度和合成 的RNA量成正比。
复制和转录的异同点
相同点： 1.以DNA为模板 2.合成新链的方向均为5’→3’
3.都需要依赖DNA的聚合酶
4.遵守碱基互补配对规则
不同点 模板 原料 聚合酶
复制 两股链均作为模板 dNTP DNA聚合酶
转录 模板链作为模板 NTP RNA聚合酶
mRNA, tRNA, rRNA
产物
引物
子代DNA双链
RNA合成的起始
一般情况下，转录起始复合物可以进入两 条不同的反应途径： 合成并释放2-9个核苷酸的短RNA转录物， 即所谓的流产式起始； 尽快释放σ亚基，转录起始复合物通过上游 启动子区并生成由核心酶、DNA和新生 RNA所组成的转录延伸复合物。
转录延伸复合物较为稳定，可长时间与 DNA模板结合而不解离。只有在遇到转 录终止信号时，RNA聚合酶才停止加入 新的核苷酸，RNA-DNA杂合物解离， 释放转录产物并导致聚合酶本身从模板 DNA上脱落。
大肠杆菌RNA聚合酶核心酶单独合成RNA
a
b’
Active center cleft
a
w
b
真核生物RNA聚合酶 真核生物中有3类RNA聚合酶，其结构比 大肠杆菌RNA聚合酶复杂，它们在细胞核 中的位置不同，负责转录的基因不同，对 α-鹅膏覃碱的敏感性也不同。 真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所 组成，相对分子质量超过5×105。
RNA聚合酶
rNTP+XTP
DNA， Mg2+
（NMP）n-XTP+nPPi
④ 聚合反应需要Mg2+或Mn2+离子。 ⑤ 不需要任何引物。RNA聚合酶缺乏3’→5’ 外切酶活性，所以没有校正功能。
RNA或RNA-DNA双链杂合体不能 作为模板。 原核和真核生物的RNA聚合酶虽然都 能催化RNA的合成，但在其分子组成、 种类和生化特性上各有特色。
–35区 –10区 ……T85T83G81A61C69A52……T89A89T50A65A100……
典型原核启动子的四大要素
• -10区：是一个6碱基保守序列（常以-10为中心） TATAAT，有助于DNA的解链，称为Pribnow 盒或者TATA盒 • -35区：是另一个6碱基保守序列（常以-35为中 心）TTGACA • 转录起始位点：+1号位，通常是嘌呤，其序列通 常为CAT • -10区与-35区的间距：大约16-19bp，小于 15bp或者大于20bp都会降低启动子活性
σ因子不仅增加聚合酶对启动子的亲和力，还并与启 动子区的特异性序列相结合
因子
σ70
基因
rpoD
功能
广泛
-35区
TTGACA
间隔 （bp）
16-18
-10区
TATAAT
σ32
σ54
rpoH
rpoN
热休克 TCTCNCCCT 13-15 CCCCAT TGAA NTA
• 体外转录实验表明，用核心酶催化转录时 RNA聚合酶对模板链和起始位点的选择都 有很大的随意性。
• 核心酶与DNA有一定的亲和力，来自蛋白 质的碱性基团与DNA磷酸根之间的静电引 力，是一种与DNA序列无关的非特异性结 合，称为松弛结合。
σ因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区 DNA序列的亲和力，酶底结合常数提高103倍， 酶底复合物的半衰期可达数小时甚至数十小时。 σ因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异 性位点的结合常数降低104倍，使酶底复合物的 半衰期小于1秒。
图3-6 大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区
原核生物启动子的共同序列
在真核生物基因中，Hogness等发现类似 Pribnow区的Hogness区，在转录起始点 上游–25～–30 bp处，保守序列为 TATAAA，也称TATA区。在起始位点上游– 70～–78 bp处还有另一段共同序列 CCAAT，称为CAAT区（CAAT box）。
功能 识别起始点，稳定全酶 转录的特异性
亚基 β ' β σ α
α，β，β’和σ亚基分别由rpoA，rpoB，rpoC和 rpoD编码 另外一个重要的亚基NusA
α亚基可能与核心酶的组装及启动子 识别有关，并参与RNA聚合酶和部分 调节因子的相互作用。
T4噬菌体感染大肠杆菌后对α亚基的 一个精氨酸残基进行ADP糖基化修饰， 造成RNA聚合酶全酶对启动子亲和力 降低。
3.2.启动子与转录起始 大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相 互作用主要包括启动子区的识别、 酶与启动子的结合及σ因子的结合 与解离。
3.2.1 启动子区的基本结构
• 启动子（promoter）：是位于基因上游，与 RNA聚合酶识别、结合模板并起始转录紧密相关的 一段DNA序列。启动子一般包括识别、结合和起始 三个部位。 • 转录起点（start point）：是指与新生RNA链第 一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为嘌呤 • 转录单元（transcription unit）:一段从启动子 开始至终止子结束的DNA序列。 • 转录子：两个或者两个以上的连续的基因转录在一 个mRNA分子中，这些基因所组成的复合单位称为 转录子。
RNA合成步骤
1.模板识别 2.转录起始 3.转录的延伸
4.转录的终止
大肠杆菌RNA聚合酶
• 大肠杆菌RNA聚合酶全酶由五 种类型的六条亚基构成，即 α2ββ’ωσ，成为全酶。 • σ亚基与转录起始点的识别有关， 而在转录合成开始后被释放， 余下的部分α2ββ’ω被称为核心酶， 与RNA链的聚合有关。 • 在核心酶中，ββ’两个亚基构成 了聚合酶的催化中心，原核和 与模板 DNA 真核生物中的这两个亚基在序 结合 起始和催化合成 列上具有同源性。
RNA聚合酶、DNA、新生 RNA构成稳定的三元复合物 （stable ternary complex）
真核生物的转录起始较为复 杂。目前已知RNA聚合酶Ⅱ 至少有七种不同的蛋白辅助 因子参与转录起始复合体的 形成。这些蛋白因子被称为 转录因子（transcriptional factor，TF）。TF包括 TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD， TFⅡE，TFⅡF，TFⅡH， TBP等。
启动子功能的研究方法----启动子的突变
科学家又从噬菌体的左、右启动子PL及PR和 SV40启动子的–35 bp附近找到了另一段共 同序列：TTGACA。
现已证实大部分启动子都存在这两段共同序列， 即位于–10 bp处的TATA区和–35 bp处的 TTGACA区，它们是RNA聚合酶与启动子的 结合位点，能与σ因子互相识别而具有很高的 亲和力。
表3-2 真核细胞中三类RNA聚合酶特性比较
线粒体RNA聚合酶只有一条多肽链，是 已知最小的RNA聚合酶之一。
叶绿体RNA聚合酶比较大，结构与细菌 的RNA聚合酶相似。
• 和原核生物一样，真核生物RNA聚合酶也 需要有蛋白质辅助因子的协助。非洲爪蟾的 RNA polIII在转录5S RNA的时候，需 要一种分子量为37kDa的蛋白质因子
Confers additional specificity
上游元件（UP-element）为RNA聚合酶 提供另一个作用位点从而增强DNA与RNA 聚合酶的结合
另一类σ70 的启动子缺少-35区，但是 在-10区上游含有一个额外的-10元件
由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心， 它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的 两个大亚基有同源性。 β亚基是RNA聚合酶的催化亚基，能与模 板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相 结合。
利福平和链霉素能够抑制转录，前者抑 制RNA合成的起始，后者抑制RNA链的 延伸。
离体实验中，肝素（heparin）能抑制 转录，肝素与β’亚基紧密结合， β’亚基 是碱性最强的亚基，肝素是一种酸性的 粘多糖，它与DNA竞争与β’亚基从而妨 碍β’亚基与有意链的结合。
replication
3. 1. 2 转录机器的主要成分 1. RNA聚合酶(DDRP)
• 真核和原核细胞内都存在有DDRP，迄今发现的DDRP 的有以下特点： • ① 以双链DNA为模板 • ② 需要4种NTP作为底物，DNA与RNA之间遵循碱基 互补原则，A=U，T=A，C=G。 • ③ 催化RNA链的起始、延伸和终止，RNA链的延伸方 向是5’→3’ ，NTP加到新生RNA链的3’ 端，形成磷酸 二酯键。
RNA聚合酶亚基
prokaryotic a
b’ b
a w eukaryotic
RPB3
相同颜色代表两物种 RNA聚合酶的同源亚 基
RPB2
RPB11
RPB6
RPB1
2.转录复合物
RNA聚合酶与启动子可逆性 结合形成封闭复合物 （closed complexes）
DNA解链形成开放性复合物 （open complexes）
原核生物的启动子
The distance is conserved
1. σ70含有可识别的-35区和-10区
2. 不同启动子在-35区和-10区含有保守序列
-35区和-10区的保守序列
• 启动子区含有的序列越接近保守序列，启动 子越强（为什么？） • 启动子的强弱程度由规定时间内能够起始转 录的多少决定
RNA聚合酶是原核生物转录过程的核心部 分。除了RNA聚合酶外，转录还需要其他 一些蛋白质辅助因子。例如转录终止时的释 放因子（ρ 因子）和抗终止因子等。 σ因子习惯上作为RNA聚合酶的组成成分， 实际上也是一种辅助因子。
不需要引物
特点
半保留复制
不对称转录
RNA合成的检测
• TCA(三氯醋酸)沉淀法：反应体系包括 DNA模板，RNA聚合酶，NTPs，用放射 性同位素至少标记一种NTP前体，保温一 段时间以后加入TCA，RNA不溶于TCA而 生成沉淀，而反应各组分不形成沉淀，然后 用滤纸过滤，在滤纸上的放射性强度和合成 的RNA量成正比。
复制和转录的异同点
相同点： 1.以DNA为模板 2.合成新链的方向均为5’→3’
3.都需要依赖DNA的聚合酶
4.遵守碱基互补配对规则
不同点 模板 原料 聚合酶
复制 两股链均作为模板 dNTP DNA聚合酶
转录 模板链作为模板 NTP RNA聚合酶
mRNA, tRNA, rRNA
产物
引物
子代DNA双链
RNA合成的起始
一般情况下，转录起始复合物可以进入两 条不同的反应途径： 合成并释放2-9个核苷酸的短RNA转录物， 即所谓的流产式起始； 尽快释放σ亚基，转录起始复合物通过上游 启动子区并生成由核心酶、DNA和新生 RNA所组成的转录延伸复合物。
转录延伸复合物较为稳定，可长时间与 DNA模板结合而不解离。只有在遇到转 录终止信号时，RNA聚合酶才停止加入 新的核苷酸，RNA-DNA杂合物解离， 释放转录产物并导致聚合酶本身从模板 DNA上脱落。
大肠杆菌RNA聚合酶核心酶单独合成RNA
a
b’
Active center cleft
a
w
b
真核生物RNA聚合酶 真核生物中有3类RNA聚合酶，其结构比 大肠杆菌RNA聚合酶复杂，它们在细胞核 中的位置不同，负责转录的基因不同，对 α-鹅膏覃碱的敏感性也不同。 真核生物RNA聚合酶一般有8-14个亚基所 组成，相对分子质量超过5×105。
RNA聚合酶
rNTP+XTP
DNA， Mg2+
（NMP）n-XTP+nPPi
④ 聚合反应需要Mg2+或Mn2+离子。 ⑤ 不需要任何引物。RNA聚合酶缺乏3’→5’ 外切酶活性，所以没有校正功能。
RNA或RNA-DNA双链杂合体不能 作为模板。 原核和真核生物的RNA聚合酶虽然都 能催化RNA的合成，但在其分子组成、 种类和生化特性上各有特色。
–35区 –10区 ……T85T83G81A61C69A52……T89A89T50A65A100……
典型原核启动子的四大要素
• -10区：是一个6碱基保守序列（常以-10为中心） TATAAT，有助于DNA的解链，称为Pribnow 盒或者TATA盒 • -35区：是另一个6碱基保守序列（常以-35为中 心）TTGACA • 转录起始位点：+1号位，通常是嘌呤，其序列通 常为CAT • -10区与-35区的间距：大约16-19bp，小于 15bp或者大于20bp都会降低启动子活性
σ因子不仅增加聚合酶对启动子的亲和力，还并与启 动子区的特异性序列相结合
因子
σ70
基因
rpoD
功能
广泛
-35区
TTGACA
间隔 （bp）
16-18
-10区
TATAAT
σ32
σ54
rpoH
rpoN
热休克 TCTCNCCCT 13-15 CCCCAT TGAA NTA
• 体外转录实验表明，用核心酶催化转录时 RNA聚合酶对模板链和起始位点的选择都 有很大的随意性。
• 核心酶与DNA有一定的亲和力，来自蛋白 质的碱性基团与DNA磷酸根之间的静电引 力，是一种与DNA序列无关的非特异性结 合，称为松弛结合。
σ因子可以极大地提高RNA聚合酶对启动子区 DNA序列的亲和力，酶底结合常数提高103倍， 酶底复合物的半衰期可达数小时甚至数十小时。 σ因子还能使RNA聚合酶与模板DNA上非特异 性位点的结合常数降低104倍，使酶底复合物的 半衰期小于1秒。
图3-6 大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区
原核生物启动子的共同序列
在真核生物基因中，Hogness等发现类似 Pribnow区的Hogness区，在转录起始点 上游–25～–30 bp处，保守序列为 TATAAA，也称TATA区。在起始位点上游– 70～–78 bp处还有另一段共同序列 CCAAT，称为CAAT区（CAAT box）。
功能 识别起始点，稳定全酶 转录的特异性
亚基 β ' β σ α
α，β，β’和σ亚基分别由rpoA，rpoB，rpoC和 rpoD编码 另外一个重要的亚基NusA
α亚基可能与核心酶的组装及启动子 识别有关，并参与RNA聚合酶和部分 调节因子的相互作用。
T4噬菌体感染大肠杆菌后对α亚基的 一个精氨酸残基进行ADP糖基化修饰， 造成RNA聚合酶全酶对启动子亲和力 降低。
3.2.启动子与转录起始 大肠杆菌RNA聚合酶与启动子的相 互作用主要包括启动子区的识别、 酶与启动子的结合及σ因子的结合 与解离。
3.2.1 启动子区的基本结构
• 启动子（promoter）：是位于基因上游，与 RNA聚合酶识别、结合模板并起始转录紧密相关的 一段DNA序列。启动子一般包括识别、结合和起始 三个部位。 • 转录起点（start point）：是指与新生RNA链第 一个核苷酸相对应DNA链上的碱基，通常为嘌呤 • 转录单元（transcription unit）:一段从启动子 开始至终止子结束的DNA序列。 • 转录子：两个或者两个以上的连续的基因转录在一 个mRNA分子中，这些基因所组成的复合单位称为 转录子。
RNA合成步骤
1.模板识别 2.转录起始 3.转录的延伸
4.转录的终止
大肠杆菌RNA聚合酶
• 大肠杆菌RNA聚合酶全酶由五 种类型的六条亚基构成，即 α2ββ’ωσ，成为全酶。 • σ亚基与转录起始点的识别有关， 而在转录合成开始后被释放， 余下的部分α2ββ’ω被称为核心酶， 与RNA链的聚合有关。 • 在核心酶中，ββ’两个亚基构成 了聚合酶的催化中心，原核和 与模板 DNA 真核生物中的这两个亚基在序 结合 起始和催化合成 列上具有同源性。
RNA聚合酶、DNA、新生 RNA构成稳定的三元复合物 （stable ternary complex）
真核生物的转录起始较为复 杂。目前已知RNA聚合酶Ⅱ 至少有七种不同的蛋白辅助 因子参与转录起始复合体的 形成。这些蛋白因子被称为 转录因子（transcriptional factor，TF）。TF包括 TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD， TFⅡE，TFⅡF，TFⅡH， TBP等。
启动子功能的研究方法----启动子的突变
科学家又从噬菌体的左、右启动子PL及PR和 SV40启动子的–35 bp附近找到了另一段共 同序列：TTGACA。
现已证实大部分启动子都存在这两段共同序列， 即位于–10 bp处的TATA区和–35 bp处的 TTGACA区，它们是RNA聚合酶与启动子的 结合位点，能与σ因子互相识别而具有很高的 亲和力。
表3-2 真核细胞中三类RNA聚合酶特性比较
线粒体RNA聚合酶只有一条多肽链，是 已知最小的RNA聚合酶之一。
叶绿体RNA聚合酶比较大，结构与细菌 的RNA聚合酶相似。
• 和原核生物一样，真核生物RNA聚合酶也 需要有蛋白质辅助因子的协助。非洲爪蟾的 RNA polIII在转录5S RNA的时候，需 要一种分子量为37kDa的蛋白质因子
Confers additional specificity
上游元件（UP-element）为RNA聚合酶 提供另一个作用位点从而增强DNA与RNA 聚合酶的结合
另一类σ70 的启动子缺少-35区，但是 在-10区上游含有一个额外的-10元件
由β和β’亚基组成了聚合酶的催化中心， 它们在序列上与真核生物RNA聚合酶的 两个大亚基有同源性。 β亚基是RNA聚合酶的催化亚基，能与模 板DNA、新生RNA链及核苷酸底物相 结合。
利福平和链霉素能够抑制转录，前者抑 制RNA合成的起始，后者抑制RNA链的 延伸。
离体实验中，肝素（heparin）能抑制 转录，肝素与β’亚基紧密结合， β’亚基 是碱性最强的亚基，肝素是一种酸性的 粘多糖，它与DNA竞争与β’亚基从而妨 碍β’亚基与有意链的结合。
replication
3. 1. 2 转录机器的主要成分 1. RNA聚合酶(DDRP)
• 真核和原核细胞内都存在有DDRP，迄今发现的DDRP 的有以下特点： • ① 以双链DNA为模板 • ② 需要4种NTP作为底物，DNA与RNA之间遵循碱基 互补原则，A=U，T=A，C=G。 • ③ 催化RNA链的起始、延伸和终止，RNA链的延伸方 向是5’→3’ ，NTP加到新生RNA链的3’ 端，形成磷酸 二酯键。
RNA聚合酶亚基
prokaryotic a
b’ b
a w eukaryotic
RPB3
相同颜色代表两物种 RNA聚合酶的同源亚 基
RPB2
RPB11
RPB6
RPB1
2.转录复合物
RNA聚合酶与启动子可逆性 结合形成封闭复合物 （closed complexes）
DNA解链形成开放性复合物 （open complexes）
原核生物的启动子
The distance is conserved
1. σ70含有可识别的-35区和-10区
2. 不同启动子在-35区和-10区含有保守序列
-35区和-10区的保守序列
• 启动子区含有的序列越接近保守序列，启动 子越强（为什么？） • 启动子的强弱程度由规定时间内能够起始转 录的多少决定
RNA聚合酶是原核生物转录过程的核心部 分。除了RNA聚合酶外，转录还需要其他 一些蛋白质辅助因子。例如转录终止时的释 放因子（ρ 因子）和抗终止因子等。 σ因子习惯上作为RNA聚合酶的组成成分， 实际上也是一种辅助因子。