抗体的分离纯化原理和测定优秀课件
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抗体的检测和纯化课件
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
• Protein A
• A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
•
Protein A--Sepharose CL24B 亲和层析法
的原理是,A 蛋白可与IgG上的Fc 段特异性地
结合,与小鼠IgG的各亚类表现为不同的结合
力,结合的强弱程度依次是: IgG2a > IgG2b >
IgG3 > IgG1 。A 蛋白的这种结合也是具有p
H 依赖性的,即可利用改变p H 及离子强度,纯
化与其结合较弱的IgG1。
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方法
1 腹水的处理 取腹水,在4 ℃,12 000g 条件下 离心15min ,以除去较大的凝块。
2 装柱 将1. 5g Protein A-Sep harose CL-4B 干 粉用6～7ml 三蒸水溶解,再用0. 02M ,p H 7. 4 的磷酸盐缓冲液(上样缓冲液) 浸泡15min ,然 后装入层析柱中。
一 饱和硫酸铵沉淀法
•
饱和硫酸氨沉淀是从溶液中分离蛋
白质的常用方法。这是一种比较原始，非
特异性分离技术。
•
饱和硫酸氨沉淀法难以得到高纯度
抗体的提取与纯化
(关键词：抗体；抗体的提取与纯化；盐析法；冷酒精沉淀法；DEAE-SephadexA-50柱层析纯化免疫球蛋白；SPA-SepharoseCL-4B 亲合层析纯化IgG；离子交换层析)精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2xml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
↓4℃，3h以上，使其充分沉淀离心（3000rpm）,20min,充上清，以xml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
↓置4℃3h以上，[此时，（NH4）2SO4的饱和度为33%]重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以0.02%mol/L pH7.4PBS溶解至xml装入透析袋。
↓对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意（参阅本章第二节）。
二、冷酒精沉淀法分离过程如下。
血清加3倍体积的蒸馏水，调节pH至7.7(±)冷却到0℃。
在激烈搅拌的条件下，加预冷的酒精（-20℃）到最终浓度为20%，保持在-5℃。
产生的沉淀（A），含有大多数种类的免疫球蛋白。
沉淀A悬浮于25倍体积的0.15～20mol/L NaCl溶液（冷）中，加有0.05mol/L醋酸调节pH到5.1，产生的沉淀（B），包括大部分的IgA 和IgM，IgG留在上清液内。
调节上清液的pH到7.4，加冷酒精（-20℃～-30℃）到最终浓度为25%，维持在-5℃。
所得到的沉淀（C）含有90%～98%IgG。
不同动物，IgG分离的条件和产量略有不同。
生化课件--抗原抗体的纯化
（二)亲水性离子交换剂 亲水性离子交换剂中的基质为一类天然的或 人工合成的化合物，与水亲和性较大，常用的 有纤维素、交联葡聚糖及交联琼脂糖等。 ① 纤维素离子交换剂 或称离子交换纤维素， 是以微晶纤维素为基质，再引入电荷基团构成 的。根据引入电荷基团的性质，也可分强酸性、 弱酸性、强碱性及弱碱性离子交换剂。纤维素 离子交换剂中，最为广泛使用的是二乙胺基乙 基(DEAE-)纤维素（弱碱性阴离子）和羧甲基 (CM-)纤维素（弱酸性阳离子）。（表3-6）
（一）原理
1、有机溶剂的介电常数比水小，加入有机溶剂后，整 个溶液的介电常数降低，带电的溶质分子之间引力 增强，使溶质分子相互吸引而聚集。 2、亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓 度，使溶质分子周围的水化层变薄，导致脱水而相 互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度。 （二）有机溶剂的选择 原则：水溶性好，沉淀效率高，毒性小，惰性，便宜 常用：乙醇、丙酮、甲醇等
离子交 换剂的 类型 强酸性 交换基 团 磺酸剂 -SO3H
阳离子交换剂 中强酸 性 磷酸基 -PO3H2 亚磷酸 基-PO2H2 弱酸性 羧基 -COOH 酚基 苯环-OH 强碱性
阴离子交换剂 中强碱 性 叔胺 -N(CH3)2 弱碱性 仲胺 -NHCH3 伯胺 -NH2
季氨基 N(CH3)3
优点：交换容量大，机械强度高，膨胀率小， 便宜； 缺点：结构紧密，大分子不易进出，疏水，大 分子易变性 适用于小分子的分离
(三)影响有机溶剂沉析的因素
1、pH 有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳定的 pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH，通 常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力。 2、温度 常温下物质结构松散，有机溶剂易渗入分子内部， 引起变性；降低温度可降低溶解度；且有机溶剂与水 混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较 低温度，一般在0℃以下，操作时要在冰盐浴中进行， 加入有机溶剂必须缓慢，并不断搅拌以免局部浓度过 浓。
应用生物化学-抗体技术PPT课件
抗体技术的挑战
抗体生产成本高
01
由于抗体的大规模生产需要大量的细胞培养和纯化过程，因此
生产成本较高，限制了抗体的广泛应用。
抗体特异性问题
02
抗体的特异性是影响其应用的关键因素之一，如何提高抗体的
特异性是当前面临的重要挑战。
抗体稳定性不足
03
一些抗体在存储和运输过程中容易失去活性，影响其应用效果。
抗体技术的发展前景
生物制药
药物研发
抗体作为药物载体，可以用于药 物的定向输送，提高药物的疗效
和降低副作用。
免疫检测试剂
抗体可以用于制备免疫检测试剂， 如酶联免疫吸附试验（ELISA）、 免疫荧光等，用于检测生物体内
的物质。
单克隆抗体药物
利用杂交瘤技术制备的单克隆抗 体药物，具有高度特异性、低毒 性和长效性等特点，已广泛应用 于肿瘤、自身免疫性疾病等领域。
应用生物化学-抗体技术PPT 课件
• 引言 • 抗体的产生与种类 • 抗体技术的原理与流程 • 抗体技术的应用实例 • 抗体技术的挑战与前景 • 结论
01
引言
抗体的定义与特性
抗体
指免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异识别并结合抗原，发挥 免疫效应。
特性
高度特异性、结合力强、种类多 样。
抗体技术的历史与发展
历史
自19世纪末发现抗体以来，抗体技 术不断发展，经历了免疫学、单克隆 抗体技术、基因工程抗体等阶段。
发展
目前抗体技术已广泛应用于生物医药 、诊断、治疗等领域，为人类健康和 疾病治疗做出了巨大贡献。
抗体技术的应用领域
01
02
03
生物医药
用于药物研发、疾病诊断 和治疗，如肿瘤免疫治疗、 自身免疫性疾病治疗等。
实验 亲和层析纯化IgG PPT课件
2）上样：血清让胶床表面几乎不留液层，然后小心注入床面 中央~2ml稀释血清，待样液几乎全部进入胶床表面后，关止 水夹，室温下样品与填料结合15min。
实验步骤
1. Protein A纯化：
3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出 速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅 有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲 液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹， 。 4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积 洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水 夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出 速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1 毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液， 收集2倍柱体 积记为E2。 5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡 液5cv。
下面开始实验！
2.5ml
2.5ml
2.5 ml
4 ml
2.5ml
3.3 ml
10% SDS 100 μl
100 μl
100 μl
TEMED 10% AP
10 μl 10 μl 10 μl
100 μl 100 μl 100 μl
四、实验步骤
2.SDS-PAGE 纯度测定
3、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右， 之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速， 催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注 胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为 了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是 胶与水层之间形成清晰的界面。
特异性
许多IgGs 的Fc 片断 许多IgGs 的Fc 片断 特异的抗体 特异免疫球蛋白
实验步骤
1. Protein A纯化：
3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出 速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅 有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲 液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹， 。 4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积 洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水 夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出 速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1 毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液， 收集2倍柱体 积记为E2。 5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡 液5cv。
下面开始实验！
2.5ml
2.5ml
2.5 ml
4 ml
2.5ml
3.3 ml
10% SDS 100 μl
100 μl
100 μl
TEMED 10% AP
10 μl 10 μl 10 μl
100 μl 100 μl 100 μl
四、实验步骤
2.SDS-PAGE 纯度测定
3、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右， 之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速， 催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注 胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为 了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是 胶与水层之间形成清晰的界面。
特异性
许多IgGs 的Fc 片断 许多IgGs 的Fc 片断 特异的抗体 特异免疫球蛋白
第8章 抗体的制备及应用ppt课件
1 4
Ag
2 3
1 4
Ag 2
3
B1
B2
B3
B4
多克隆抗体
B3 B3 B3 B3
单克隆抗体
单克隆抗体的特点
特异性强，具有抗原结合位点的专一 性。（不是抗原的专一性！）
因结合位点的单一性，有时不易捕捉 抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产 生凝集反应或沉淀反应。
▪ 抗体的性质相同，容易纯化、标记。
1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为
该抗体的效价。 3.可进行任意稀释。
3) 如何免疫兔子
2000g(雌雄均可),健康,无病原（小鼠20g，大鼠200g） 基础免疫 • 0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原) • 0.5ml佛式完全佐剂(CFA)（小鼠0.2ml） • 制备抗原-佐剂乳化液 • 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射（注意
1、ELISA法；用ELISA法筛选对半抗原有亲和力的单 克隆抗体，然后大量培养,分析单克隆抗体的酶学活性。
2、酶学活性检测法：直接用反应底物检测细胞培养液 中抗体的酶活性。 3、短过渡态类似物法：以过渡态类似物中含有的必需 基团的基本结构单元做为筛选单克隆抗体的标准。对该 化合物亲和力越强的化合物,其催化效率越高
• 适合于IgM类抗体的纯化 (五聚体,分子量约800KD)
主要步骤
• 将腹水或血清处理后上柱，样品要浓； (可用G-200，柱子要长，80-100cm)
• 待样品入柱后,用缓冲液过柱； • 等量收集洗脱液,测定洗脱液的A280值。 • 收集第一峰。
特点 • 成本高，步骤较简单。
• 抗体回收率较高，分离条件缓和，抗 体活性不受影响。
Ag
2 3
1 4
Ag 2
3
B1
B2
B3
B4
多克隆抗体
B3 B3 B3 B3
单克隆抗体
单克隆抗体的特点
特异性强，具有抗原结合位点的专一 性。（不是抗原的专一性！）
因结合位点的单一性，有时不易捕捉 抗原，一株单克隆抗体与抗原不易产 生凝集反应或沉淀反应。
▪ 抗体的性质相同，容易纯化、标记。
1.周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 2.以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为
该抗体的效价。 3.可进行任意稀释。
3) 如何免疫兔子
2000g(雌雄均可),健康,无病原（小鼠20g，大鼠200g） 基础免疫 • 0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原) • 0.5ml佛式完全佐剂(CFA)（小鼠0.2ml） • 制备抗原-佐剂乳化液 • 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射（注意
1、ELISA法；用ELISA法筛选对半抗原有亲和力的单 克隆抗体，然后大量培养,分析单克隆抗体的酶学活性。
2、酶学活性检测法：直接用反应底物检测细胞培养液 中抗体的酶活性。 3、短过渡态类似物法：以过渡态类似物中含有的必需 基团的基本结构单元做为筛选单克隆抗体的标准。对该 化合物亲和力越强的化合物,其催化效率越高
• 适合于IgM类抗体的纯化 (五聚体,分子量约800KD)
主要步骤
• 将腹水或血清处理后上柱，样品要浓； (可用G-200，柱子要长，80-100cm)
• 待样品入柱后,用缓冲液过柱； • 等量收集洗脱液,测定洗脱液的A280值。 • 收集第一峰。
特点 • 成本高，步骤较简单。
• 抗体回收率较高，分离条件缓和，抗 体活性不受影响。
抗体的检测和纯化(4)
• Protein A/G亲和层析 • 亲和层析是一种快速有效的生物活 性物质的纯化方法,它通过偶联蛋白对 目的蛋白选择性的吸收和分离,可取得 较高的纯化效果,且操作简便,广泛地应 用于实验室抗体纯化。由于产品价格昂 贵,使用成本较高,限制了它的运用
• Protein A • A 蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白,分 子量为42 KD ,有6 个不同的IgG结合位点。其 中有5 个位点对IgG的Fc 片段显示很强的特异 性亲和力,不同的位点独立地与抗体结合。但 IgA , IgM , IgE 也可能结合在配体上,当达到饱 和时,一个A 蛋白分子至少可以结合两个IgG分 子。A 蛋白对IgG有高亲和力和特异性,这一特 点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上 清中的单克隆抗体
精度纯化
• 目的：保证最终抗体产品纯度，能有效对 潜在的污染物，如宿主细胞蛋白 (HCP)、免 疫球蛋白、宿主DNA； • 对用于腹水生产抗体的刺激物、内毒素、 其它热原物质、培养液成分、层析凝胶析 出成分 (脱落的蛋白A配基) 进行去除；并能 有效的去除/灭活病毒。
建议的工艺
• 首先采用0.2-0.45 m的中空纤维膜技术进行 澄清 (Cell removal)； • 然后用protein-A或protein-B捕获，酸性条件 洗脱后直接pH 4.0病毒灭活； • 澄清过滤后再穿透方式上Capto Adhere； • 这一步离子交换之前或之后会有一步20nm 纳滤去病毒；最后50K膜超滤浓缩和洗滤进 行缓冲液置换。 • 有些抗体如果通过优化结果不甚满意，通 过增加一步Capto Q也基本上可以达到要求
目的：去除特定的杂质，如HCP、DNA、聚集 体和变体等。 常用的层析技术：CaptoAdhere、离子交换、 疏水层析等。
详细介绍抗体的分离纯化
12/12/2016
离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团
，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂
。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。
22
阳离子交换反应：R-A- H+ + Y+ —R-A- Y+ + H+
阴离子交换反应：R-B+ OH- + X- —R-B+ X- + OH-
10
12/9/2016
影响离心法的因素
离心机的种类、离心方法、离心介质以及密度梯度 （一）离心速度 低速离心一般用离心速度，即转子每分钟的转数表示，如5000r/min等。 高速离心和超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示，如60000×g等。 相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值。即：
一、盐析法
在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过 程称为“盐析”。
增加盐浓度能够增强蛋白间的疏水相互作用,疏水性的不同导致了一个选择性沉淀。
优点：①成本低，不需要昂贵的设备；
②操作简便，安全；
③对许多生物活性物质具有稳定作用；
④对pH、温度要求不严格。
缺点：分离效果有限
14
12/9/2016
常用的沉淀剂
沉淀剂 硫酸铵 右旋硫糖苷
使用的典型条件
样品类型
备注
下文有叔
大于1mg/ml蛋白, 特别使免疫球蛋 白
用于稳定的蛋白,不会变 性,上清可以直接 上到 HIC（疏水层析柱）,减少了脂蛋白 含量
加入0.04 ml of 10% 右旋硫糖苷和1 ml of 1 M 可用于高脂蛋白的样品,例如腹水
详细介绍抗体的生产制备ppt课件
半抗原－载体连接方法：常用物理法和化学法。
物理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微孔吸附半抗原；
化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上。
16
四）免疫佐剂
某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特 异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂 (immunoadjuvant)，简称佐剂。
抗血清的效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常 用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类） 抗原所产生的抗体，可用双向扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。 而后者则粗糙得多。
24
放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原（放射 性核素标记）混合，孵育24h后，测定其结合率（用液体闪烁 计数仪测定Ag*－Ab或游离Ag*）。通常以结合率为50%的血清 稀度为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1： 15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由 抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间， 所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起 注意。
22
（二）免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间 隔等因素。
1、免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态 和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。 2、免疫途径与免疫间隔时间
免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免 疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。
17
1、佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类：
①无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等
②生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰 阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；
物理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微孔吸附半抗原；
化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上。
16
四）免疫佐剂
某些物质与抗原一起或先于抗原注入机体，可增强机体对该抗原的特 异性免疫应答或改变免疫应答类型，此类物质称为免疫佐剂 (immunoadjuvant)，简称佐剂。
抗血清的效价：就是指血清中所含抗体的浓度或含量。效价测定的方法常 用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。某些由大分子（如蛋白类） 抗原所产生的抗体，可用双向扩散等方法测定。前者测定的效价极为精确。 而后者则粗糙得多。
24
放射免疫法： 以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原（放射 性核素标记）混合，孵育24h后，测定其结合率（用液体闪烁 计数仪测定Ag*－Ab或游离Ag*）。通常以结合率为50%的血清 稀度为效价。如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1： 15000，则该血清的效价就是1：15000。抗血清的效价，除由 抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间， 所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起 注意。
22
（二）免疫方法
选定动物后，在免疫过程中应考虑免疫剂量、免疫途径、免疫次数、免疫间 隔等因素。
1、免疫原的剂量：免疫原的接种剂量按免疫原性的强弱、动物的个体状态 和免疫时间来确定。首次免疫时，剂量不宜过大，以免产生免疫麻痹。 2、免疫途径与免疫间隔时间
免疫途径通常有皮内、皮下、肌肉、静脉、腹腔、淋巴结等，视不同的免 疫方案而异。对于不易获取的宝贵抗原可采用淋巴结免疫法。
17
1、佐剂的种类
佐剂一般包括以下几类：
①无机佐剂：如氢氧化铝、明钒等
②生物性佐剂：如结核分枝杆菌、卡介苗、小棒状杆菌、百日咳杆菌、革兰 阴性杆菌内毒素、霍乱毒素的B亚单位、胞壁酰二肽和细胞因子等；
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•
硫酸铵浓溶液的pH常在4.5—5.5之间，市售
的硫酸铵还常含有少量游离硫酸，pH往往在4.5
以下，需用氨水调节其pH至7.0左右。
(三)盐析时需注意的问题
• 1. 盐的饱和度
• 盐的饱和度是影响蛋白质盐析的主要因素， 不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离 几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由低 到高逐渐增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离 心分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种 蛋白质沉淀。如用硫酸铵盐析分离血浆蛋白， 当饱和度达20％时，纤维蛋白原首先析出；饱 和度增至28％—33％时，优球蛋白析出；饱和 度达33％—50％时，球蛋白析出；饱和度大于 50％以上时，清蛋白析出。免疫球蛋白常在饱 和皮为33％开始析出。
• 可依据抗体的特性进行分离纯化： 据蛋白质疏水性的差异，以盐析的方法
将抗体与其他蛋白分开；据抗体带有电荷 的不同，用离子交换，电泳等技术分离….. 按分离方法： 沉淀、盐析、膜技术、电泳、色谱等。其 中只有电泳和色谱法可以将抗体精细分离 即纯化。
一、盐析法
• （一）原理
•
蛋白质的溶解度在一定范围内随盐的浓度变
抗体的分离纯化原 理和测定
第一节 抗体的分离纯化
• 无论是将抗体用于研究还是用于检测 或临床治疗，均需对抗体进行分离与纯化。
• 分离：将抗体从其存在的体液或培养液 中分离出来并加以初步纯化。
• 纯化： 提高分离出来的抗体的纯度，并 将其中的杂质控制在所需的低水平。对治 疗性抗体尤为重要。
分离纯化的方法
• 2．截留分子量
•
超滤膜的另一基本性能是标称截留分子量。
它的定义是指溶液中被截留的溶质中最小的分子
量。对于“截留分子量”这个指标，不应做机械
式的理解。例如，使用截留分子量5万的膜时， 分子量68万的牛血清白蛋白也可通透过去。这是
因为，一方面，膜上的孔的大小是不均匀的，一
般情况下，有一个孔径分布。另一方面，由于分
• ②蛋白质分子呈球形者其截留特性优于呈 线性者。因此，应注意厂家给出的截留分 子量是何种物质为样品所测定。一般情况 下，裁留率顺序为 ：球蛋白>支链高聚物> 直链(线型)高聚物。
• ③厂家给出的截留分子量是以单一蛋白质 (或水溶性大分子)为样品所测定的。但是， 实际样品往往极为复杂，如体系中有多种 蛋白质存在时，膜的特性会因为浓差极化 现象、‘‘凝胶层的形成”以及样品间形 成复合物等现象而有所改变。
二、膜分离技术
• 可以形象地将膜分离技术比喻成以多 孔膜进行过滤或过筛子的过程。在实际操 作时，由于膜上的孔很小，需使用一定的 压力，才能将含有待分离物质的液体驱动 通过分离膜，使具有不同分子量的物质或 通过膜、或截留于膜上而得到分离。有多 种膜技术可用于抗体的分离与纯化。
• 但最基本的是使用超滤膜。超滤膜的孔径 在1—100nm之间，其截止到分子量的范围 为几百至一百万，所需的驱动压力在0.1— 1.0MPa左右。
子的形状不同且分子链具有柔性，分子量相同的
线型分子和球型分子的透过率是不同的，线型分
子更容易透过。通常，厂家给出的截留分于量指
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的是截留率90％时，相对应的蛋白质(或其它水
溶性高聚物)的分子量。在实际使用时应注意以 下几个问题：
• ①一般超滤膜的截留分子量曲线多呈S形 (如图8-1)。S形透过率曲线的线性部分越陡， 则截留性能亦越佳。
质分子相互聚集而沉淀。盐析法就是根据不同蛋
白质在一定浓度的盐溶液中溶解度不同面达到彼
此分离的方法。
（二）盐的选择
• 蛋白质盐折常用中性盐，主要有硫酸铵、硫 酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最 广的是硫酸铵，其优点是温度系数小，溶解度大 (25℃时饱和溶解度为4.1mol/L，即767g/L)。在不 同饱和度的硫酸铵溶液内，不同蛋白质依次析出， 而且硫酸铵价廉易得，分段效果好，不容易引起 蛋白质变性。
化而变化。在低盐浓度下溶解度随着盐浓度升高
而增加，当盐浓度达到一定水平时，其溶解度又
以不同程度下降并先后析出。其原理是由于蛋白
质分子的极性基团有着静电引力，当水中加入少
量盐类时，盐类离子与水分子对蛋白质分子上的
极性基团的影响，使蛋白质在水个溶解度增大。
但盐浓度增加到一定程度时，水的活度降低，蛋
白质表面的电荷被中和，水化膜破坏，致使蛋白
(一)超滤膜的基本性能
• 作为膜分离材料，超滤膜的基本性能可 以用透水率和截留分子量加以表征。
• 1．透水速率 在一定的驱动压力下，单 位面积的膜在单位时间里所能透过的水的 量称为该膜的进水率(Jf)。
• 式中Jf为进水率，ρ为渗透系数，ΔP为压力 差， Δπ是料液的渗透压差，ι是透过水流通 道的长度，它正比于膜的厚度。通常情况 下，由于Δπ很小，所以可以忽略不计、此 时，透水率可简化表达为
• 即透水率与操作压力成正比，与膜厚呈反 比。由于膜在使用过程中会发生污染和孔
结构的改变，因而在使用过程中，其透水
率会逐渐发生变化。所以定义其初始运水 量Qz和稳定透水量Qs之比为稳定系数Sm， 即
• 一般情况下，Sm=0.6-0.8, 不同规格和品种 的膜的透水率相差很大。同时，不同的操 作条件与参数，也会对实际透水量产生影 响，这些参数包括操作压力、料液流速、 温度以及料液的性质等。一般情况下，在 膜使用的开始和结束时，可以实际测定一 下透水率。当透水率已经降低时，应考虑 将其清洗并再生，以恢复其透水率。
• 4．温度
• 出于高浓度的盐溶液对蛋白质有一定保 护作用，盐析操作一般可在室温下进行， 但在使用某些中性盐进行盐析时，温度对 盐溶解度的影响比较明显。
• 5. 脱盐
• 蛋白质用盐析沉淀分离后，常需脱盐 才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析。 通过透析袋内外的离子交换，最后使透析 袋内溶液的盐浓度与外界相一致。当然， 也可以使用凝胶过滤或超滤的方法除盐。
• 2. pH 在等电点时，蛋白质溶解度最 小．容易沉淀析出。因此，盐析时除个别 特殊情况外，pH常选择在被分离的蛋白质 等电点附近。
• 3. 蛋白质浓度 在相同盐析条件下，蛋白 质浓度越高越易沉淀，高浓度虽对沉淀有 利，但浓度过高，也容易引起其它蛋白质 的共沉淀，因此，必须选择适当浓度，尽 可能避免共沉淀作用的干扰。