实验二 杀菌剂生物活性测定-生长速率法
09第二章 第三节 杀菌剂的生物测定方法
水溶性药剂、乳油稀释液或稳定的悬浮液（胶悬剂的稀释液）可用此
法，而WP由于是悬浮性差，不宜采用。 优点：操作简单迅速，无需特殊设备
缺点：药剂和孢子始终充分接触，与病害防治的实际相差很大，测得
的毒力往往偏高。
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
二、杀菌剂温室植株测定方法
针刺法测定农药对番茄灰霉病防治效果的活体试验
二、杀菌剂温室植株测定方法
对照（3d）
40%多菌灵WP1500×（3d）
一种植物精油1000×
针刺法测定农药对番茄灰霉病防治效果的活体试验
二、杀菌剂温室植株测定方法
盆栽法测定农药对小麦白粉病的防治效果
二、杀菌剂温室植株测定方法
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法
3、孢子悬浮液的准备
菌种
无菌水，搅匀
菌种悬浮液
二层纱布过滤 除去菌丝体及破碎培养基
离心 无菌水洗
洗净的孢子
调至浓度5000个/mL（10×10倍，35个孢子）
Байду номын сангаас
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法
3、孢子悬浮液的准备
菌种应是标准菌种，供试菌种应符合以下条件： ①菌种纯粹，在一般培养基上易大量产生孢子； ②多代繁殖不易产生变异； ③孢子个体较大，易于在显微镜下观察萌发情况；
④在分类上有一定的代表性，而且是重要的植物病害病原菌。
2、生长速率法
杀菌剂生物测定实验报告
多菌灵对小麦赤霉病病菌菌丝生长的毒力测定一、实验目的：掌握生长速率法的基本操作二、实验基本原理：琼脂平板培养法是在融化的培养基中加入一定浓度的杀菌剂，制成含梯度浓度药剂药剂的培养基平面，再在平面上接种病原菌。
以病原菌生长速率为指标评价药剂的毒力。
病原菌生长速率通常采用在一定时间内病原菌生长的菌落直径大小（即扣除接入病原菌菌落直径）表示，也可用菌落达到一定直径所需时间表示。
在测定中一定要同时设置不加药剂和只加药剂配置时的溶剂和助剂的空白对照，用于在计算毒力时溶剂和助剂对结果的影响。
该方法尤其适合在琼脂培养基上能够沿水平方向有一定生长速率且菌落接近于圆形的病原真菌或者在液体培养基中能够迅速培养的病原细菌。
三、实验步骤1，菌碟制备：以小麦赤霉病菌作供试菌株，取灭菌培养皿一套，分别加入已融化的马铃薯培养基17ml制成平板。
取已经活化的小麦赤霉病病原菌菌种一支，在培养皿中央分别接入赤霉病病原菌，置于25C恒温箱内倒赔84h后，用内径为5mm的打孔器沿菌落外周处打一周，制成菌碟。
2，含梯度浓度药剂平板的制备（1）药剂浓度处理设置处理药剂浓度为 0、0.125、0.25、0.5、1和2ppm，每处理3个重复。
（2）制备药剂母液用分析天平称取0.01g多菌灵原药，先加入到1ml 0.1mol/L盐酸水溶液中，再加9ml灭菌水，摇匀，制成1000ppm的母液（3）制备对照平板用量筒分别量取50ml培养基均匀家去到3个灭菌的培养皿中，制成对照平板（4）制备药剂浓度梯度在灭菌的三角瓶中用移液器先加入180ul母液，再用量筒1量取90ml培养基加入到三角瓶中，摇匀，用已灭菌的量筒2量取45ml摇匀然后加入到无菌培养皿中，制成2ppm的含药平板，并标注。
以此重复上述过程，制成1ppm、0.5ppm、0.25ppm、0.125ppm的含药培养基平板。
3，接菌、培养和结果调查用接种针分别在含药培养基平板中央接入菌碟（气生菌丝朝上），每皿一个菌碟，在25度恒温箱内倒置培养72h，采用十字交叉法测量每皿菌落的直径。
霉菌--生长速率法
菌落生长速率的表示方法 菌落达到一个给定的大小所需要的时间（天或小时） 在单位时间内菌落直径的大小
生长速率法常用的菌种 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 小麦纹枯病菌（Rhzoctonia solani ） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella） 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）
6
7
五、实验数据及其处理 纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径 抑菌率（%）=[(对照菌落纯生长量-处理菌落纯生长量/ 对照纯生长量]×100%
8
50%多菌灵对苹果腐烂病菌的抑制作用(生长速率法)
菌落直径（mm）
药 剂
浓度（mg/L）
浓度 对数
ⅠⅡ
ⅢⅣ
平均
ห้องสมุดไป่ตู้
抑制 （%）
机 率 值
9
机率值
6 y = 0.9624x + 2.8171
大家好
1
实验十 杀菌剂的生物测定--生长速率法
2
一、实验目的 学习并掌握杀菌剂的生物测定方法之一--生长速率法
二、实验原理 生长速率法是杀菌剂毒力测定的常规方法之一，适用于不 长孢子而菌丝生长较快的真菌，是通过菌落生长的速度快 慢来衡量药剂的毒力大小 生长速率法又叫含毒介质法，它是将供试药剂与培养基混 合，以培养基上菌落的生长速度来衡量化合物的毒力大小。 一般多用于那些不产孢子或孢子量少而菌丝较密的真菌
4
三、试剂和仪器设备 高压灭菌锅、超净工作台、酒精灯、接种针、纱布、吸 管、消毒培养皿、打孔器、无菌小烧杯 PDA培养基 病原菌（苹果腐烂病菌） 供试杀菌剂(多菌灵)
实验二 杀菌剂生物活性测定-生长速率法
实验二杀菌剂生物活性测定-生长速率法一、实验原理将不同浓度的药液与融化的培养基混合，制成带毒培养基平面，在平面上接种病原菌，以病菌生长速度的快慢来判定药剂毒力的大小。
病菌生长速率可用两种方法表示：①一定时间内菌落直径的大小；②菌落达到一定直径所需的时间。
二、实验目的通过本试验要基本掌握杀菌剂室内（离体）活性的生物测定操作技术，掌握杀菌剂毒力回归曲线的制作及LC50的求解。
三、实验材料1．供试药剂：70%甲基托布津2．供试病原菌：苹果炭疽病菌3．马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基（PDA）配方：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂粉10g（或琼脂条18g）；自来水1000 mL；pH自然偏酸（5-6）制作方法：选择质量较好的马铃薯，削皮，去芽眼，切成薄片，称取200g，加自来水1000mL，煮沸后改小火煮30min（直至马铃薯片呈半透明状），然后用4层沾湿纱布过滤，滤液用水补足至1000mL。
再加入琼脂10g，用玻棒搅拌使其溶解（可适当加热）后加入葡萄糖20g，搅匀，再补足水1000 mL，最后分装于试管（用于接斜面）或三角瓶（250mL三角瓶盛约150mL培养基），用无菌封口膜封好灭菌备用。
采用湿热灭菌法，121℃下保持30min。
4、实验器材：φ90cm的培养皿（72个），PDA培养基，1mL移液管（10个），酒精灯，10mL具塞刻度试管（10个），接种针（4个），超净工作台（2台）。
四、方法与步骤1．菌种准备实验室准备有菌源，在生测前一个星期请自行转接。
对菌种的要求：病原菌应容易培养，菌丝生长快速、整齐，产生孢子缓慢；菌丝最好在培养基平面上呈平伏放射状生长（有利于结果的测量）。
在φ90cm的培养皿中，倒入约10-15mL PDA。
从培养皿或者斜面培养基上取一块病菌，放在培养皿中间，于26℃下培养（3-7d）备用。
2．药液准备将供试药剂70%甲基托布津用无菌水分别稀释成800、400、200、100、50、25mg/L 六个浓度的药液。
杀菌剂的毒力测定和
但近代随着新型内吸杀菌剂的发展，对杀菌剂的生物筛选
逐渐由经典的离体筛选趋向活体筛选。 因为它不仅模拟田间实际，同时可以防止那些在离体平板 上无效，而必须在植物活体上方显示活性的化合物漏筛。 但活体筛选涉及的因素较多，对寄主植物、试验条件要求
较高，如光照、湿度、温度，为控制病原菌与寄主相互作用的
条件，必须有适合的温室，费工耗资都较大。 离体测定能反映化合物毒力的本质和程度，方法简便，为 研制新农药不可缺少，但它存在有一点缺点，应该和温室活体 的盆栽试验结合起来。
过试验确定其药效的好坏，经济效益的高低，
也就是说，田间试验是确定一种药剂在生产 上有无实用价值的主要方法。 田间实验的具体方法可参考《农药药效 试验的设计与分析》一书，防治效果可用以 下公式计算。
一，活性效应显现较快，缺点是有时与活体测
定结果不一致，有时会漏筛或误筛，如用粉锈
宁处理大麦白粉病菌，离体测定不仅分生孢子
能萌发且能形成吸器，但此药在活体上却表现
高效。所以初筛手段不采用平板法，采用盆栽
法，即病原---寄主植物组合法。
2．盆栽方法
在温室内进行的，具体方法随各种不同病害
而异，例：小麦赤霉病采用分生孢子 --- 幼苗
抑制百分率=50%，机率值=5
将 5 代入回归方程，然后求其反对数，即
LD-P-Line（剂量对数---机率值直线）。
ED50 可以作为多种药剂对同一病菌等效剂 量的毒力比较，在一定的范围内可以用它来 衡量一种药剂对病原菌毒力的大小，但不能 做为田间防治的实际指标。
三、田间试验
室内筛选的药剂必须进行田间试验，通
（3）生长速率测定法
即在琼脂培养基中加入药液，冷凝后接
菌的方法，用木塞钻孔器切取正常培养基上
杀菌剂的毒力测定方法
生长速率测定法注意事项：
1）带毒培养基的制作
应先加药液再加培养基（1：9）； 对一些受热易分解的药剂则要待培养基 冷却到50度左右时再加入。
2）接种病原菌
如果是菌丝接种，打孔制作菌饼时 取材要从种菌皿的外缘开始，避免使用 中心区的菌丝。
如果是孢子液接种，用接种针蘸取 孢子液后，在带药培养基上划一直线。
6 扩散法
原理：在已接种的培养基上加少量的 抗菌物质，使其接触培养基和病原菌，经 一定时间培养后，接触部分的周围由于抗 菌物质的扩散，而产生抑菌圈（或抑菌 带），其大小与药剂浓度有关系，以此来 比较杀菌剂的毒力大小。
此法主要用于抗生素的效价测定。
农用抗生素的效价
效价是衡量抗生素有效成份和质量好坏的 一个指标。
药剂抗菌力也即药剂毒力。
5 气体效力测定
原理：有些杀菌剂具有挥发性，且有杀 菌特性，在测定这类杀菌剂毒力时，可将麦 芽汁-琼脂培养基置于皿底内，冷凝后接种病 原菌孢子，然后盖上皿盖并倒过来使底成 “盖”，使盖成“底”，并将杀剂菌剂置于 “底”内，放到适于病菌孢子发芽生长的环 境中培养一定时间后观察。
如：嘧啶胺类化合物在室内，以 100ug/ml对灰霉病菌孢子没有抑制作用； 300ug/ml对菌丝生长也不能抑制； 1ug/ml的浓度在田间使用时，却能很好 的防治灰霉病。
药剂与病菌的作用关系
传统的：以其“毒力”抑制或杀死病菌。一 般是一致的。
病菌
药剂
环境
新类型的杀菌剂：
影响病菌的致病过程； 影响寄主的抗病性；
即在各处理组的调查孢子总数中增加调查 孢子数量，增加的数量根据对照组孢子萌发 率换算出来。
如：CK孢子萌发率达98%时，在调查处理 组时，拟定调查数量为100时，此时就要调查 102个，并对其不萌发孢子数减去2，然后计 算孢子萌发率。
生长速率法
抑制病原真菌菌丝生长实验——生长速率法一、实验目的学习并掌握杀菌剂的生物测定方法之一—生长速率法。
二、实验原理生长速率法又叫含毒介质法，它是将供试药剂与培养基混合，以培养基上菌落的生长速度来衡量化合物的毒力大小。
一般多用于那些不产孢子或孢子量少而菌丝较密的真菌。
三、实验仪器与设备电子天平（感量0.1mg），生物培养箱，培养皿，移液管或移液器，接种器，卡尺，高压灭菌锅，超净工作台，酒精灯，纱布，打孔器等四、实验材料（1）供试农药通用名：戊唑醇(Tebuconazole)，化学名：(RS)-1-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-3-(1H-1,2,4三唑-1-基甲基)戊-3-醇。
（2）供试病菌试验真菌应选择在人工固体培养基上菌丝能沿水平方向、有一定生长速率且周缘生长较整齐的真菌，如番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solani）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）和番茄早疫病菌（Alternaria solani）等。
（3）其他实验材料PDA培养基五、实验步骤1.药剂配制戊唑醇（98%原药）溶于丙酮配成5000ppm母液。
设计5个系列浓度，有机溶剂最终含量不超过2%。
2.药剂处理在无菌操作条件下，根据实验处理将预先融化的灭菌培养基定量加入无菌三角瓶中，从低浓度到高浓度依次定量吸取药液，分别加入上述三角瓶中，充分摇匀。
然后倒入直径为9cm的培养皿中，制成相应浓度的含药平板。
实验设不含药剂的处理作空白对照。
3.接种将培养好的病原菌，在无菌条件下用直径为4mm的灭菌打孔器，自菌落边缘切取菌饼，用接种针将菌饼接种于含药平板中央，盖上皿盖，皿盖朝下，将培养皿置于适宜温度的培养箱中。
六、结果调查与统计分析根据空白对照培养皿中菌的生长情况调查病原菌菌丝生长情况。
用卡尺测量菌落直径，单位为mm。
每个菌落用十字交叉法垂直测量直径各一次，取其平均值。
杀菌剂生物测定技术
一、供试菌种
供试病原菌要求
在分类上有一定代表性，最好是重要的农 业植物病害的病原菌， 而且容易培养， 多代繁殖不易产生变异。
常用的供试菌种
番茄灰霉病菌（Botrytis cintrea） 番茄早疫病菌（Alternaria solani） 辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici） 苹果轮纹病菌（Physalospora berengeriana） 苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata） 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 葡萄黑痘病菌（Elsinoe ampelina） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）
特别是为某一特定病害寻求有效的防治药剂时， 实际上不可能对供试菌进行选择，但以水平扩散 法作生物定量测定，如抗菌素效价测定，则必须 对供试菌有如下的要求：
对被测定的药剂有适当的敏感性，抑菌圈界 限明显
培养容易，生长迅速不易为杂菌污染 不易 发生变异
容易作成接种菌液（菌丝体或孢子悬浮液）
菌种有较强的耐热能力
三、杀菌剂室内主要生测方法
孢子萌发法 含毒介质培养法
叶碟法
管碟法 滤纸片法 孔碟法 生长速率法 最小浓度法
抑菌圈法
1.孢子萌发法
孢子萌发法是历史最悠久而广泛被采用 的 杀 菌 剂 毒 力 测 定 方 法 。 早 在 1807 年 。 Prevost 就采用此法，后经不少学者改进， 使之日趋规范、合理。
接菌饼， 若不能生 长，此浓 度是最低 抑制浓度
划线接细菌， 不能生长， 此浓度为最 低抑制浓度
3.叶碟法
叶碟法比较简易，能在室内进行，比孢子萌 发法和含毒介质培养法接近生产实际，可看作 是盆栽试验的过渡阶段。
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实验二杀菌剂生物活性测定-生长速率法
一、实验原理将不同浓度的药液与融化的培养基混合，制成带毒培养基平面，在平面上接种病原菌，以病菌生长速度的快慢来判定药剂毒力的大小。
病菌生长速率可用两种方法表示：①一定时间内菌落直径的大小；②菌落达到一定直径所需的时间。
二、实验目的通过本试验要基本掌握杀菌剂室内（离体）活性的生物测定操作技术，掌握杀菌剂毒力回归曲线的制作及LC50的求解。
三、实验材料
1．供试药剂：70%甲基托布津
2．供试病原菌：苹果炭疽病菌
3．马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基（PDA）
配方：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂粉10g（或琼脂条18g）；自来水1000 mL；pH自然偏酸（5-6）制作方法：选择质量较好的马铃薯，削皮，去芽眼，切成薄片，称取200g，加自来水1000mL，煮沸后改小火煮30min（直至马铃薯片呈半透明状），然后用4层沾湿纱布过滤，滤液用水补足至1000mL。
再加入琼脂10g，用玻棒搅拌使其溶解（可适当加热）后加入葡萄糖20g，搅匀，再补足水1000 mL，最后分装于试管（用于接斜面）或三角瓶（250mL三角瓶盛约150mL培养基），用无菌封口膜封好灭菌备用。
采用湿热灭菌法，121℃下保持30min。
4、实验器材：φ90cm的培养皿（72个），PDA培养基，1mL移液管（10个），酒精灯，10mL具塞刻度试管（10个），接种针（4个），超净工作台（2台）。
四、方法与步骤
1．菌种准备
实验室准备有菌源，在生测前一个星期请自行转接。
对菌种的要求：病原菌应容易培养，菌丝生长快速、整齐，产生孢子缓慢；菌丝最好在培养基平面上呈平伏放射状生长（有利于结果的测量）。
在φ90cm的培养皿中，倒入约10-15mL PDA。
从培养皿或者斜面培养基上取一块病菌，放在培养皿中间，于26℃下培养（3-7d）备用。
2．药液准备
将供试药剂70%甲基托布津用无菌水分别稀释成800、400、200、100、50、25mg/L 六个浓度的药液。
800mg/L药液的配制：称取1g药剂，用无菌水溶解后，定容至875mL。
称取20mg药剂，用无菌水溶解并定容至17.56mL。
3．打制菌饼
在超净工作台上，用直径0.4cm打孔器（预先醮75%乙醇灼烧3次以灭菌）在培养好的供试菌种菌落外缘切下带菌培养基块-菌饼，这种来自菌落外缘的菌饼在新的培养基上生长速度的差异较小。
4．带药培养基的制备
采用混毒法制备带药培养基。
将培养基于微波炉中溶化（约需7-10min）。
从低浓度到高浓度顺序处理。
用1mL移液管吸取1mL药液放入10mL刻度试管中，然后将热好的培养基（要冷却至50℃左右）倒入试管至10mL刻度，振荡混匀，立即倒入培养皿、放平，冷却后即成薄厚均匀的平板。
所有浓度处理设三个重复。
以无菌水代替药液作对照。
注意事项：
①配制药液及浇制带毒培养基的一切用具均应事先灭菌，操作最好在无菌室内进行，以防污染； ②在设计药剂浓度时应考虑到药液和热培养基混合对药液的稀释及对培养基的稀释（如药液加入后将培养基稀释过多，则培养基不能凝固），一般以1mL 药液加入9mL 热培养基为宜，这样的比例不会影响培养基的凝固而药剂的真实浓度被稀释了10倍；
③对一些挥发性强的或易受热分解的药剂，应注意培养基的温度，最好冷至45-50℃左右再将药液加入；
④药液和培养基必须保证在凝固前充分混匀。
热的带毒培养基倒入培养皿内应保持水平，否则将会造成皿内带毒培养基厚薄不匀，产生误差。
5．接菌饼
用接种针或消毒的镊子将菌饼反向（有菌丝的一面向下和培养基贴合）移植到带毒的培养基上。
每浓度药液处理重复3次（3个培养皿），每个培养皿最好是在中心放置1个菌饼。
也可以在直径9cm 的培养皿中呈三角形放3个菌饼，但应注意病菌的生长速度及3个菌饼的间距和它们离皿壁的距离，否则得不到圆的菌落。
6．检查结果及统计
一般培养3d 即可检查，对于生长缓慢的菌种可适当延长培养时间。
每个菌落用直尺以十字交叉法测量两个直径，每菌饼两个数据，可根据实际情况，取菌饼长短直径量取数据，取其平均值代表菌落大小。
根据以下公式计算菌丝生长抑制率：
菌落生长直径（mm ）=两次直径平均值—4.0（菌饼直径）
五、作业
将供试药剂的离体活性测定结果记入表中，以浓度的对数值为横坐标，以生长抑制率的机率值为纵坐标，求出供试药液对供试病原菌菌丝生长的毒力回归方程、抑菌中浓EC 50，并完成实验报告。
%
100⨯-=
对照菌落生长直径
处理菌落生长直径
对照菌落生长直径菌丝生长抑制率。