DNA基因克隆及序列分析,英语翻译
14Recombinant DNA technology
1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂
1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉
一、重组DNA技术相关概念
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
技术水平： 分子克隆(molecular clone) 即DNA 克隆，基因克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物） 原意是指复制（copy）
~20 Kb DNA 片段
外源DNA与载体DNA混合
cos L ~20 Kb 外源 DNA 片段 R cos
连接反应
体外包装RNA通过逆转录合成总cDNA， 再与适当载体连接后转入受体菌，从而 得到含有某种生物体全部cDNA集合，称 为cDNA （ cDNA library）。
AATTC G A TCTAG
AATTC G
GATCT A
Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切
+
AATTC G
A TCTAG
T4 DNA连接酶 15º C
GAATTC CTTAA G A GATCT TCTAG A
① 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
反转录酶
多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针 在3´羟基末端进行同质多聚物加尾 切除末端磷酸基
1. 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其 周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用。
质粒 —— 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 可接合质粒如 F 因子(F factor)
（二）转化作用(transformation)
基因克隆技术名词解释
基因克隆技术名词解释基因克隆技术是指通过人工手段将一个生物体的基因从其源生物体中抽取并插入到另一个宿主生物体中的过程。
以下是一些基因克隆技术的常见术语的解释：1. DNA复制（DNA replication）：在细胞分裂或基因克隆过程中，DNA的双链被解开，通过酶的作用，在每个单链上合成一条新的互补链，从而产生两条完全相同的DNA分子。
2. 基因库（gene library）：基因库是一个储存基因序列的集合，通常通过将DNA分子从一个组织或生物提取出来，并将其插入到载体（如细菌或酵母）中来构建。
3. 重组DNA技术（recombinant DNA technology）：重组DNA技术是一种通过将不同来源的DNA片段连接到一起来生成新的DNA分子的方法。
这种方法可用于将特定基因插入宿主生物体的基因组中。
4. 基因放大（gene amplification）：基因放大是指通过体外复制方法制备大量特定DNA序列的过程，如聚合酶链式反应（PCR），从而获得足够量的DNA来进一步研究。
5. 基因表达（gene expression）：基因表达是指基因通过转录和翻译的过程产生功能性蛋白质的过程。
基因克隆技术可以用于将外源基因（来自其他物种）插入宿主生物体的基因组中，从而使宿主生物体表达该基因及其编码的蛋白质。
6. 表达载体（expression vector）：表达载体是一种DNA分子，其中包含了一个外源基因的表达序列，如启动子、转录终止子和转录调控元件等。
表达载体可以在宿主生物体中将外源基因表达出来。
7. 选择标记（selection marker）：选择标记是一种用于帮助筛选转化成功的宿主生物体的方法。
常用的选择标记包括耐抗生素基因，只有含有特定基因的宿主生物体才能在含有相应抗生素的培养基中生长。
8. 基因敲除（gene knockout）：基因敲除是指通过特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）来使宿主生物体中的特定基因失去功能。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
生物信息分析经常使用名词说明
生物信息分析经常使用名词说明生物信息学（bioinformatics）：综合运算机科学、信息技术和数学的理论和方式来研究生物信息的交叉学科。
包括生物学数据的研究、存档、显示、处置和模拟，基因遗传和物理图谱的处置，核苷酸和氨基酸序列分析，新基因的发觉和蛋白质结构的预测等。
基因组（genome)：是指一个物种的单倍体的染色体数量，又称染色体组。
它包括了该物种自身的所有基因。
基因（gene）：是遗传信息的物理和功能单位，包括产生一条多肽链或功能RNA所必需的全数核苷酸序列。
基因组学：（genomics)是指对所有基因进行基因组作图（包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱）、核酸序列测定、基因定位和基因功能分析的科学。
基因组学包括结构基因组学（structural genomics)、功能基因组学（functional genomics)、比较基因组学(Comparative genomics)宏基因组学：宏基因组是基因组学一个新兴的科学研究方向。
宏基因组学（又称元基因组学，环境基因组学，生态基因组学等），是研究直接从环境样本中提取的基因组遗传物质的学科。
传统的微生物研究依托于实验室培育，元基因组的兴起填补了无法在传统实验室中培育的微生物研究的空白。
蛋白质组学（proteomics）：说明生物体各类生物基因组在细胞中表达的全数蛋白质的表达模式及功能模式的学科。
包括鉴定蛋白质的表达、存在方式(修饰形式)、结构、功能和彼此作用等。
遗传图谱：指通过遗传重组所取得的基因线性排列图。
物理图谱：是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再依照重叠序列把片段连接称染色体，确信遗传标记之间的物理距离的图谱。
转录图谱：是利用EST作为标记所构建的分子遗传图谱。
基因文库：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA 或染色体DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而组成各个片段的无性繁衍系（克隆），在制备的克隆数量多到能够把某种生物的全数基因都包括在内的情形下，这一组克隆的整体就被称为某种生物的基因文库。
实验六 基因克隆及序列分析
实验六、基因克隆及序列分析1.目的片段回收取5 μl PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上检测，如果扩增产物大小与原来一致，在紫外灯管下用刀片切下目标带，然后用UNIQ-10 Column DNA Collection Kit 试剂盒（上海生工）进行回收。
具体回收过程如下：从琼脂糖凝胶中精确切下包含有目标片段的胶块，放入到1.5 ml离心管中，加入500 µl Binding Buffer II，50℃~60℃水浴锅中放置10 min，使胶彻底熔化，然后将熔化的胶溶液转移到套放于2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，8000 r/min离心1 min，倒去收集管中的废液，在UNIQ-10柱中加入500 µl Washing Solution，室温8000 r/min离心1 min，加入新鲜的Washing Solution重复一次，倒去收集管中的废液，室温12000 r/min离心15 s。
在UNIQ-10柱中加入Elution Buffer 30 µl（直接滴到过滤膜上），37℃放置2 min，放到一个新的1.5 ml离心管后离心收集（12000 r/min，1 min），所得溶液用于连接反应。
2 片段连接反应采用pGEM® -T Easy Vector试剂盒（Promega，A1360）进行目标片段的克隆。
取1.5 µl PCR产物，加入0.5 µl T4 DNA ligase，0.5µl T Easy Vector，2.5 µl ligation buffer，短暂离心收集，轻轻混匀，置于室温连接1-2 h后，放于4︒C冰箱过夜。
3大肠杆菌感受态细胞的制备及转化取保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5α菌液，首先在LB固体培养基上分离单克隆，然后挑一个单克隆进行液体培养过夜。
从中取1.0 ml菌液转接于装有100 ml LB液体培养基的250 ml三角瓶中，于摇床培养1.5~2 h（37℃，240 r/min），后转移至预冷的50 ml离心管中，冰浴10 min，低温离心10 min（4℃，4000 r/min）收集菌体，加入25 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2重悬培养物，冰浴20-30 min，4℃4000r/min离心10 min，去上清液，倒立晾干，再加2 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%的甘油）重悬细胞，分装于冰浴的0.5 ml无菌离心管中，放入-70℃冰箱保存。
生物工程知识：快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆
生物工程知识：快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆快速克隆技术——加速DNA序列分析和基因克隆随着生物技术的不断发展，分子生物学技术成为现代生命科学研究中的重要工具之一，通过对生物分子的研究，人们可以深入了解生命体的组成和运作方式，为解决人类和社会面临的诸多问题提供依据和解决途径。
其中，DNA序列分析和基因克隆是现代生命科学研究中最为基础和重要的研究方法之一。
而为了加速DNA序列分析和基因克隆，快速克隆技术应运而生。
快速克隆技术是一类利用高效的DNA重组技术将外源DNA序列导入宿主细胞，并产生可重现、高效、无需寻找突变位点的定向克隆方法。
它不仅缩短了基因克隆的时间，而且方便了对DNA序列的修饰。
快速克隆技术的主要优势在于，可以直接对目标DNA序列进行点突变、插入、删减等修饰，从而实现对基因功能的探究，为分子生物学研究提供有力手段。
快速克隆技术主要包括克隆扩增和重组克隆两种方法。
克隆扩增是一种在PCR反应中同时进行克隆扩增和定向作用的技术，通过使用末端限制性核酸内切酶和pCR®4-TOPO®克隆载体，可以实现PCR产物的快速克隆扩增。
重组克隆则利用了DNA重组酶的高效作用，在宿主细胞内完成DNA重组反应，将目标DNA序列在不损失信息的情况下导入到载体中，从而实现快速、准确、方便的基因克隆。
在快速克隆技术的应用中，需要注意一些技术要点。
首先，对于目标DNA序列的选择需要仔细考虑，得到的DNA序列必须保持完整性，并且没有任何突变；其次，在重组克隆中，DNA重组反应必须充分进行，可以通过调节DNA浓度、DNA重组酶的用量和反应时间等因素来达到最佳反应效果；此外，对于载体的选择也非常重要，通常会选择T/A克隆载体，如pCR®4-TOPO®克隆载体，在克隆扩增反应中具有很好的适用性，而在重组克隆中，较常用的载体有pET-28a，pGEX等。
使用快速克隆技术进行基因克隆，需要进行单克隆鉴定。
硕士研究生分子生物学复习题答案
硕士研究生分子生物学复习JUJU一、名词解释1. 基因gene：是指核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位,是指贮存有功能的蛋白质多肽链或RNA序列信息及表达这些信息所必需的全部核苷酸序列.2. 基因组genome：是指细胞或生物体中,一套完整单倍体的遗传物质的总和.基因组的结构主要指不同的基因功能区域在核酸分子中的分布和排列情况,基因组的功能是储存和表达遗传信息.3. 基因家族gene family：是指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因.同一个家族的基因成员是由同一祖先基因进化而来.4. 假基因pseudogene：在多基因家族中,某些成员并不能表达出有功能的产物,这些基因称为假基因,用ψ表示.假基因与有功能的基因同源,原来也可能是有功能的基因,由于缺失、倒位或点突变等原因失去活性,成为无功能的基因,它们或者不能转录,或者转录后生成无功能的异常多肽.5. 质粒plasmid：是存在于细菌细胞质中的一类独立于染色体的遗传成分,它是由环形双链DNA组成的复制子.质粒DNA分子可以持续稳定的处于染色体外的游离状态,但在一定条件下又会可逆的整合到宿主染色体上,随染色体的复制而复制,并通过细胞分裂传递到后代.6. 基因超家族gene superfamily：是指一组由多基因家族及单基因组成的更大的基因家族.它们的结构有程度不等的同源性,可能是由于基因扩增后又经过结构上的轻微改变,因此它们可能都起源于相同的祖先基因.但是它们的功能并不一定相同,这一点正是与多基因家族的差别.这些基因在进化上也有亲缘关系,但亲缘关系较远.如免疫球蛋白超家族.7. 卫星DNAsatellite DNA：为非编码区串联重复序列.通常存在于内含子和间隔DNA内.重复次数从数次至数百次,甚至几十万次,串联重复单位从最短的2bp 起,长短不等.这类重复顺序组成卫星DNA的基础.可分为三类：大／小／微卫星DNA.8. 基因多态性：是指由于等位基因间在特定位点上DNA序列存在差异造成的,一般发生在基因序列中不编码蛋白质的区域和没有重要调节功能的区域.9. 操纵子operator：是阻遏蛋白识别与结合的一小段DNA序列,转录过程存在阻遏调控机制的基因中均含有这样的序列.操纵子紧接在启动子下游,通常与启动子有部分重叠.10. 顺式作用元件cis-acting elements：是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列.原核生物中主要是启动子、阻遏蛋白结合位点、正调控蛋白结合位点、增强子等.真核生物中包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等.11. 反式作用因子trans-acting elements：在真核生物中,基因特异性转录因子称为反式作用因子,这些因子通常是通过与增强子或上游启动元件结合而发挥作用.反式作用因子通过与通用转录因子及RNA聚合酶相互作用而刺激转录,这些相互作用促进前起始复合物的形成.12. 增强子enhancer：是一种较短的DNA序列,能够被反式作用因子识别与结合.反式作用因子与增强子元件结合后能够调控通常为增强临近基因的转录.增强子序列通常是数个形成一簇,位于转录起始点上游-100~-300bp处,但在基因之外或某些内含子中也有增强子序列.13. 启动子promoter：是RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列.启动子具有方向性,一般位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身并不被转录.也有一些真核生物启动子位于转录起始点下游,且可以被转录14. 载体vector：携带外源DNA进入宿主细胞,并在宿主细胞中进行无性繁殖或表达的小分子DNA. 这种DNA进入受体细胞后,可自主复制,或插入到基因组中,随受体细胞的基因组一起复制.载体上还常带有特定的药物抗性基因,便于筛选.按功能可分为克隆载体和表达载体,按来源可分为质粒、噬菌体、噬菌粒、粘粒、病毒和人工染色体载体等.15. 基因工程gene engineering：将基因进行克隆,并利用克隆的基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物,或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的方法及相关的工作统称为基因工程.／是在分子水平上,用人工方法提取或制备DNA, 在体外切割、拼接和重新组合,然后通过载体把重组的DNA分子导入受体细胞,使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达,生产出人们所需要的产物,或定向创造生物新性状,并使之稳定地传给下一代.16. PCRpolymerase chain reaction：聚合酶链式反应.是在DNA聚合酶、模版DNA、引物和4种dNTP存在的条件下进行的体外酶促DNA合成反应,是在体外特异性扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的一种方法.／其原理是依据细胞中DNA半保留复制机理,DNA在不同温度下变性、复性的特性,人为控制温度高温变性、低温退火、中温延伸循环多次后使目的基因得到扩增.17. RNAiRNA interference：RNA干涉,是指外源性的dsRNA所致的细胞内有效的和特异性的基因封闭.其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解,产生干扰小RNAsiRNA,这些siRNA与同源的靶RNA互补结合,特异性酶降解靶RNA,从而抑制、下调基因表达.已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法.／是指在生物体细胞内,dsRNA引起同源mRNA的特异性降解,因而抑制相应基因表达的过程.是一种转录后水平的基因沉默,在生物体内普遍存在.／指在生物体细胞内,外源性dsRNA酶切产生siRNA引起同源mRNA的特异性降解,因而抑制相应基因表达的过程. 是一种转录后水平的基因沉默,在生物体内普遍存在外源性dsRNA被一种叫DICER的dsRNA内切酶剪切产生siRNA,其可识别靶mRNA分子并使其被相应的核糖核酸酶切割成片段,从而抑制正常基因的表达,正常时生物体内不会有RNAi现象,只有在外源性RNA导入的情况下会发生.18. 分子杂交nucleic acid hybridization：是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基酸对原则形成双链的过程.19. 基因诊断gene diagnosis：是以DNA和RNA作为诊断材料,通过检查基因的存在、缺陷或异常表达,对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程.其基本原理是检测DNA或RNA的结构变化与否,量的多少及表达功能是否正常,以确定被检查者是否存在基因水平的异常变化,以此作为疾病诊断的依据.20. 基因治疗gene therapy：是应用基因或基因产物,治疗疾病的一种方法.狭义的说,基因治疗是把外界的正常或治疗基因,通过载体转移到人体的靶细胞,进行基因修饰和表达,改善疾病的一种治疗手段.21. miRNAmicroRNA：是真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20～25nt.成熟的miRNA是由较长的初级转录产物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的,随后组装进RNA诱导的沉默复合体,通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA,并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻译.／长度约20-25个碱基对的非编码单链RNA,通过与 mRNA3'UTR互补的机制结合到mRNA上,抑制其转录或直接导致其降解,从而抑制基因表达.有高等生物基因组编码,在物种进化中相当保守.miRNAs的表达具组织特异性和时序性,在细胞生长和发育过程的调节中起多种作用22. 反义RNAanti-sense RNA：其碱基序列正好与mRNA互补,从而可与mRNA配对结合形成双链,抑制mRNA作为模板进行翻译.23. 转染transfection：指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程.24. 转化transformation：是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞,并使之获得新的表型的过程.转化现象在自然界普遍存在,是常见的基因转移方式之一.25. 基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程,合成特定的蛋白质,进而发挥其特定的生物学功能和效应的全过程.但并非所有基因表达过程都产生蛋白质,rRNA、tRNA编码基因转录生成RNA的过程也属于基因表达.26. 限制性核酸内切酶restriction endonuclease：是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列,并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶. 27. 基因组学genomics：指对所有基因进行基因组作图包括遗传图谱、物理图谱、转录图谱,核酸序列分析,基因定位和基因功能分析的一门科学.包括结构基因组学、功能基因组学、比较基因组学.28. 蛋白质组学proteomics：是对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白群体的研究,它是指从整体角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成分、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域.蛋白质组学的研究技术体系包括：样品制备,双向聚丙烯酰胺凝胶电泳,蛋白质的染色,凝胶图像分析,蛋白质分析,蛋白质组数据库等.／是指对在一定时间内或某一特定环境条件下,细胞、组织或有机体内所表达的所有蛋白质即蛋白质组进行系统的、总的研究的一门学科.旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式和功能模式,内容包括鉴定蛋白质表达、存在方式、结构、功能的互相作用方式等,它不同于传统的蛋白质学科,是在生物体或其细胞的整体蛋白质水平上进行的,从一个机体或一个细胞的蛋白质整体活动来揭示生命规律.包括表达蛋白质组学和细胞图形功能蛋白质组学.29. 顺反子cistron：编码单条多肽链的一个遗传功能单位,即转录单位.有单顺反子和多顺反子.／即是由结构基因转录出的、并作为模板与核蛋白体结合、指导蛋白质合成的一类RNA分子.在真核细胞中一种mRNA分子只能翻译出一种蛋白质,为单顺反子.在原核细胞中一种mRNA分子可翻译出多种蛋白质,为多顺反子.二、问答题1. 真核生物基因组结构特点. P351结构基因：真核生物的结构基因是不连续的,编码氨基酸的序列被非编码序列打断,因而被成为断裂基因.编码序列之间的序列称为内含子,被隔开的编码序列称为外显子.2顺式调控元件：是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的DNA序列.包括启动子、上游启动子元件、增强子、加尾信号和一些反应元件等.3基因家族：是指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因.同一个家族的基因成员是由同一祖先基因进化而来.根据基因家族同源性程度的不同可以分为以下几型：①基因序列相同；②基因序列高度同源；③基因序列不同,编码产物具有同源功能区；④基因序列不用,编码产物具有小段保守基序；⑤基因超家族.4假基因：在多基因家族中,某些成员并不能表达出有功能的产物,这些基因称为假基因,用ψ表示.假基因与有功能的基因同源,原来也可能是有功能的基因,由于缺失、倒位或点突变等原因失去活性,成为无功能的基因,它们或者不能转录,或者转录后生成无功能的异常多肽.5重复序列：真核基因组存在大量重复序列,除了编码rRNA、tRNA、组蛋白及免疫球蛋白的结构基因外,大部分重复序列是非编码序列.根据出现频率不同可分为：高度重复序列、中度重复序列、单拷贝序列.6真核生物基因组中的转座子：是一些可以移动的遗传因素.7端粒：真核生物基因组染色体DNA为线性分子,其末端存在一种特殊的结构形式,称为端粒.该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的复合体,只存在于真核细胞染色体末端.其在染色体的定位、复制、末端保护以及控制细胞寿命等方面起重要作用.8非编码序列：占基因组90%以上,编码序列小于DNA总量的5%.9为单基因结构,转录产物为单顺反子.10有多复制起点,每个复制起点大小不一.2. 真核生物和原核生物基因组结构的异同点. P35①真核基因组远远大于原核生物的基因组.②真核基因具有许多复制起点,每个复制子大小不一.原核基因只有一个复制起点.每一种真核生物都有一定的染色体数目,除了配子精子和卵子为单倍体外,体细胞一般为双倍体,即含两份同源的基因组,而原核基因组则是单拷贝的.③真核基因都是由一个结构基因与相关的调控区组成,转录产物为单顺反子monocistron,即一分子mRNA只能翻译成一种蛋白质.原核基因具有操纵子结构,即由几个功能相关的结构基因串联在一起,连同它们的调控序列组成一个转录单位.转录产物为多顺反子.④真核生物基因组中含有大量重复顺序,而原核生物基因组除rRNA、tRNA基因外,重复顺序不多.⑤真核生物基因组内非编码的顺序占90%以上.基因中非编码顺序所占的比例是真核生物与细菌、病毒的重要区别,且在一定程度上也是生物进化的标尺.⑥真核基因是断裂基因,即编码序列被非编码序列分隔开来,基因与基因间的非编码序列为间隔DNA,基因内非编码序列为内含子,被内含子隔开的编码序列则为外显子.而原核基因是连续的.⑦功能相关的基因构成各种基因家族,它们可串联在一起,亦可相距很远,但即使串联在一起的成簇的基因也是分别转录的.⑧真核生物基因组中也存在一些可以移动的遗传因素,这些DNA顺序并无明显生物学功能,似乎为自己的目的而组织,故有自私DNA之称,其移动多被RNA介导如哺乳动物及人类基因组中的逆转座子,也有被DNA介导的如果蝇及谷类中的DNA 转座子.1、原核结构基因无重叠现象,即同一部分DNA序列不编码两种蛋白质2、原核具有编码同工酶的基因3、原核DNA分子中有多种功能的识别区域,如复制起始区与终止区、转录启动区与终止区等,这些区域往往具有特殊序列,并含有反向重复序列.3. 人类基因组的组织结构特点.P371人类基因组的重复序列：按组织结构和分布特点分类①反向重复序列：是指两个顺序相同的拷贝在DNA链上呈反向排列.人类基因组中约含5%的反向重复序列,散布于整个基因组中,常见于基因组的调控区内,可能与复制转录的调控有关.②串联重复序列：特点是具有一个固定的重复单位,该重复单位头尾相连形成重复顺序片段,约占人类基因组10%.A.编码区串联重复序列：如组蛋白基因、5sRNA基因等,其意义在于快速大量合成相应基因的mRNA.B.非编码区串联重复序列：其通常存在于间隔DNA和内含子内,是组成卫星DNA的基础.③散在重复序列：除串联重复和反向重复序列之外的所有重复序列,不论重复次数多少,都可归在散在重复序列.根据重复序列的长度可分为短散在核元件和长散在核元件.2人类基因组中的DNA多态性：DNA多态性是指发生在DNA水平的多态性.在人类漫长的进化过程中,由于染色体结构的改变、DNA突变、重组、交换以及转座子的插入等,使得除了单卵双胞得个体外,没有两个个体的DNA组成是完全相同的.人类基因组多态性都是按孟德尔规律遗传的,具有体细胞稳定性和种系稳定性,因此可用它们作为染色体上疾病基因座位的遗传标记.①基因多态性：是由于等位基因间在特定位点上DNA序列存在差异造成的.②限制性片段长度多态性：是指突变、重排、单个核苷酸的插入或缺失可使DNA 顺序发生改变,其中有些可能造成限制酶切位点的增加、缺失或易位,致使DNA分子的限制酶切位点数目、位置发生改变.用限制酶切割不用个体基因组时,所产生的限制性片段的数目和每个片段的长度不同.③串联重复序列多态性：是以相同的核心序列按首尾相连的形式串联排列在一起形成一段特殊的序列的重复次数有较大变化.为DNA序列长度多态性.主要发生在小卫星和微卫星DNA.④单核甘酸多态性：是指基因组内特定核苷酸位置上存在不同的碱基,其中最少的一种在群体中的频率不低于1%.4. 原核生物基因表达调控机制.P78原核生物基因的转录和翻译偶联,mRNA降解快、半衰期短.原核生物基因表达调控主要在转录水平,其次是翻译水平.有两种方式：起始调控启动子调控和终止调控衰减子调控,转录是通过负调控因子和正调控因子进行复合调控的.以大肠杆菌E.coli为例介绍.1）转录起始调控的主要模式：①σ因子控制特定基因的表达：不同的σ因子可以竞争结合RNA聚合酶,RNA聚合酶的核心酶与不同σ因子组成的全酶识别不同基因的启动子.②乳糖操纵子的转录调控：在大肠杆菌的许多操纵子中,基因的转录不是由单一因子调控的,而是通过负调控因子和正调控因子进行复合调控的.细菌通常优先以葡萄糖作为能源,葡萄糖代谢产物能抑制细胞腺苷酸环化酶和激活磷酸二酯酶的活性,结果使细胞内的cAMP水平降低.葡萄糖耗尽时,细胞内cAMP水平升高,即可通过CAP调控其它操纵子的表达.E.coli的乳糖操纵子有Z、Y、A三个结构基因,编码β-半乳糖甘酶、乳糖透酶和半乳糖甘乙酰化酶,结构基因上游有一个启动子P和一个操纵子O.启动子上游有一个CAP蛋白的结合位点.启动子、操纵子和CAP结合位点共同构成乳糖操纵子的调控区.I基因是调节基因,编码产生阻遏蛋白.阻遏蛋白为四聚体,每个亚基相同.在没有乳糖的条件下,阻遏蛋白能与操纵子结合.由于操纵子与启动子有部分重叠,阻遏蛋白与操纵子结合后,抑制结构基因的转录.但是阻遏蛋白的抑制作用并不是绝对的.乳糖存在时,乳糖经透酶作用进入细胞,经β-半乳糖甘酶催化,转变成半乳糖和葡萄糖,同时催化一小部分乳糖转变成异乳糖.异乳糖作为诱导剂与阻遏蛋白结合,使阻遏蛋白构象发生改变,导致阻遏蛋白与操纵基因的解聚,引起结构基因的转录.lac操纵子中的lac启动子是弱启动子,RNA聚合酶与之结合的能力很弱,只有CAP结合到启动子上游的CAP结合位点后,促进RNA聚合酶与启动子的结合,才能有效转录.在这种调控中,CAP起正调控作用.乳糖操纵子的转录起始由CAP和阻遏蛋白两种调控因子来控制,可因葡萄糖和乳糖的存在与否而有4种不同的组合.A.葡萄糖存在、乳糖不存在：此时无诱导剂存在,阻遏蛋白与DNA结合,而且由于葡萄糖的存在,CAP也不能发挥正调控作用,基因处于关闭状态.B.葡萄糖和乳糖都不存在：在没有葡萄糖的情况下,CAP可以发挥正调控作用.但由于没有诱导剂,阻遏蛋白的负调节作用是基因仍然处于关闭状态.C.葡萄糖和乳糖都存在：乳糖的存在对基因的转录产生诱导作用.但由于葡萄糖的存在使细胞cAMP水平降低,cAMP-CAP复合物不能形成,CAP不能结合到CAP 结合位点上,转录仍不能启动,基因处于关闭状态.D.葡萄糖不存在、乳糖存在：此时CAP可以发挥正调控作用,阻遏蛋白由于诱导剂的存在而失去负调控作用,基因被打开,启动转录.1阻遏蛋白的负性调节：在没有乳糖的条件下,阻遏蛋白能与操纵序列O结合,抑制了RNA聚合酶与启动子P的结合,从而抑制酶与启动子的结合,使乳糖操纵子处于阻遏状态.2CAP的正性调节：分解代谢基因激活CAP分子内存在DNA和CAMP结合位点,当没有葡萄糖使,CAMP浓度升高,CAMP与CAP结合,CAMP－CAP复合物结合于CAP结合位点,提高了乳糖操纵子的转录活性.3不同生长条件下的协调调节：是指LAC操纵子阻遏蛋白的负性调节与CAP的正性调节机制协调合作.CAP不能激活被阻遏蛋白封闭的基因转录,反之没有CAP的存在来加强转录活性,即使阻遏蛋白从操纵子上解离,基因仍无转录活性.具体以下4种情况.③阿拉伯糖操纵子的转录调控④色氨酸操纵子的转录调控⑤DNA片段倒位对基因表达的调控转录终止的调控：分为依赖p因子和不依赖p因子的终止调控,核糖体也参与转录终止.2）翻译的可调控性及调控方式：①SD序列对翻译的影响A.SD序列的顺序及位置对翻译的影响不同的SD序列有一定的差异,因而翻译起始效率不一样.SD序列的核心序列是六个嘌呤AGGAGG,SD序列与核糖体小亚基中16S rRNA 3’端的互补序列配对结合,使起始密码子定位于翻译起始部位.SD1、SD2、SD3的序列可以不同,SD1/ORF1,SD2/ORF2,SD3/ORF3的AUG和SD 之间的距离也不同.核糖体以不同的效率结合不同的SD和起始翻译.SD序列位于起始密码子AUG上游8～13个碱基处,不同的开放阅读框上游的SD序列与起始密码子之间的距离是不同的,这使得起始密码子在翻译起始部位定位的精确度不同,因而翻译的起始效率也不相同.此外,某些蛋白质与SD序列的结合也会影响mRNA与核糖体的结合,从而影响蛋白质的翻译.不同的SD序列有一定的差异,因而翻译起始效率不一样.SD序列与起始密码子之间的距离,也影响mRNA翻译效率.核糖体以不同的效率结合不同的SD和起始翻译. 不同的开放阅读框上游的SD序列与起始密码子之间的距离是不同,这使起始密码子在翻译起始部位定位的精确度不同,因而翻译的起始效率也不同. B. mRNA二级结构隐蔽SD序列的作用在某些mRNA分子中,核糖体结合位点在茎环中,使核糖体无法结合,只有破坏茎环结构,核糖体才能结合.红霉素抗性的细菌编码一种红霉素甲基化酶,该酶使核糖体23S mRNA上特定位点的一个腺嘌呤甲基化,阻止红霉素的结合.红霉素通过该位点结合于核糖体,抑制蛋白质合成.②mRNA的稳定性许多细菌mRNA降解速度很快,细菌的生理状态和环境因素都会影响mRNA的降解速度.细菌mRNA的降解是由核酸内、外切酶共同完成的.③翻译产物对翻译的调控：如核糖体蛋白的调控、翻译终止因子RF2调节自身的翻译.1．核糖体蛋白：核糖体蛋白合成的控制主要是在翻译水平.每个操纵子转录的mRNA所编码的蛋白质中都有一种蛋白或两种蛋白形成的一个复合物可以结合到多顺反子上游的一个特定部位,阻止核糖体结合和起始翻译.2．翻译终止因子RF2调节自身的翻译：RF2 识别终止密码 UGA 和 UAA,RF1 识别终止密码 UAG 和 UAA.④小分子RNA的调控作用1．调整基因表达产物的类型2．低水平表达基因的控制5. 真核生物转录水平的基因表达调控机制.P89。
基因操作原理名词解释
第一章1. Gene manipulation基因操作。
将在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒，质粒或其它载体系统中，再整合到特定的宿主中，从而形成一种新的可连续繁殖的有机体。
2. Interrupted genes间断基因。
序列中间插入有与氨基酸编码无关的DNA 间隔区，使一个基因分隔成不连续的若干区段。
我们称这种编码序列不连续的基因为间断基因。
3 .Promotor启动子。
DNA 分子可以与RNA 聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。
4. Subcloning亚克隆。
当初始克隆中的外源DNA 片段较长，含有许多目的基因以外的DNA 片段时，在诸如表达、序列分析和突变等操作中不便进行，将目的基因所对应的一小段DNA 找出来，这个过程叫“亚克隆”。
第二章1.Restriction and modification限制和修饰。
宿主特异性地降解外源遗传物质（DNA）的现象称为限制。
外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。
2. Matched ends匹配末端。
识别位点为回文对称结构的序列，经限制酶切割后，产生的相同的，互补的末端称为匹配粘端，亦即粘性末端（cohesive end）。
3. Blunt ends平末端。
在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链，产生的没有碱基突出的末端称为平末端。
4. Isoschizomer ：同裂酶。
识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
5. Isocaudiners ：同尾酶。
来源不同、识别序列不同，•但产生相同粘性末端的酶。
6.Site preferences ：位点偏爱。
某些限制酶对同一介质中的不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称为位点偏爱。
7.Star activity 星星活性。
在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
8. Nicking enzyme 切口酶。
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热和酸应力条件下脂环酸芽孢杆菌Dnak基因克隆和序列分析
DNA基因克隆及序列分析。
通过兼并PCR基因组扩增获得了大约1300bp的基因片段，然后子克隆到PMD-18T载体上测序。
BLAST基因组数据库搜索表明，此PCR产物的序列共享原核热休克蛋白70 DNAK基因，与来自脂环酸芽孢杆菌LAA1伴侣蛋白的DNAK基因的同源性是最高的（92%）。
通过基因组步移技术测定DNAK 基因（基因组数据库登录号HQ893543），包含1854bp完整的开放阅读对话框（ORF），编码617个氨基酸。
推知的氨基酸序列与来自A. acidocaldarius LAA1 (86%)的DNAK基因表达的伴侣蛋白的相似性最高，与来自Bacillus tusciae,Paenibacillus sp.Y412MC10,Thermosinus carboxydivorans, Brevibacillus brevis 的 A. acidocaldarius 的相似性分别为83%, 77%, 76%,75%。
没有检测到信号肽。
预测分子量是(Mw)是66.2KDa，等电点（pI）是4.82.
氨基酸序列比对和主题搜索结果显示，在这个基因中有3个域：N末端核苷酸结合域(NBD, aa 1–360)类似于肌动蛋白ATP酶结构域，它包括三个保存位点(-I-D-L-G-T-T-N-S-, -V-F-D-L-G-G-G-T-F-D-V-S-I-L-,和V-I-L-V-G-G-S-T-R-I-P-A-V-Q-E) ，它可能与ATP绑定和激活有关；aa 360–517组成C-末端底物结合域(SBD);aa- 484–617组成的C-末端子域，它可能和底物的结合和释放有关。
脂环酸芽孢杆菌在不同的培养温度下DNAK基因的表达。
脂环酸芽孢杆菌生长的温度范围从20°C - 60°C，最适生长温度为45-50°C。
在这项研究中，脂环酸芽孢杆菌DSM 3922T在45°C中活跃培养16小时，分别在20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C和60°C繁殖生长。
根据观察脂环酸芽孢杆菌在温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C和55°C正常生长。
在55°C和30°C生长时，分别繁殖8小时和10小时时达到对数生长期。
然而，在培养温度为20°C，25°C或者60°C时，芽孢生长及其缓慢，与其他处理组像比较很难进入指数生长期。
值的注意的是，在繁殖温度为20°C，25°C和60°C 时没法收集到足够的细菌ＲＮＡ用于分离和表达分析。
如图２所示，ＤｎａＫ在培养温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C 和55°C的基本表达情况。
在脂环酸芽孢杆菌最适生长温度(40–55°C),其表达水平相对稳定。
在较低的温度下，30°C和35°C,Ｄｎａｋ的表达大幅升高。
这表明Ｄｎａｋ可能参与脂环酸芽孢杆菌对不良环境的适应。
在热应力条件下脂环酸芽孢杆菌DNAK的表达。
在实验中，热应力加在45°C 繁殖生长到指数生长期摇瓶菌悬液内的细菌上，然后置于温度分别为70°C, 80°C, 90°C的恒温浴内。
在80°C和 90°C时，开始10分钟内，细菌正常生长，15分钟后细胞开始破裂。
随着热应力的继续，有明显的细胞裂解和细胞凋亡的进一步加剧。
在80°C,和90°C时仅仅热应力持续5分钟和10分钟，提取的RNA适合做进一步分析，热冲击15分钟或更长时间，提取的RNA严重退化，不能用于ＲＴ－ＰＣＲ分析。
当孵育温度70°C热冲击，所有的时间范围内细菌维持正常生长，全部的RNA被分离用于ＲＴ－ＰＣＲ检测。
正如图３所示，以70°C的热冲击温度，与对照在不孵育的脂环酸芽孢杆菌相比，ＤＮＡＫ的表达水平在孵育５分钟增加了４０％，长时间的热冲击，表达水平下降，与对照的相比２５分钟孵育的细菌ＤＮＡＫ表达水平提高了３０％，当热休克在80°C和90°C时，与对照相比，在5分钟内细菌的DNAK表
达水平高速增加70%和15%。
有人指出，随着热冲击温度的上升，DNAK表达水平上升，这显示了脂环酸芽孢杆菌对耐热性可能与DNAK有关。
酸性条件下脂环酸芽孢杆菌DNAK基因的表达。
正如图所示，在酸胁迫条件下，Dnak的表达水平在1小时内迅速增加，直到5小时大幅下降。
DnaK的表达水平高于开始在酸胁迫条件下（对照组），在半小时和一小时内表达为对照组的2.5倍和3.3倍。
随着酸胁迫的继续，Dnak的表达水平在2小时内下降到40%，在3小时时为对照组最小量的8%，这表明，Dnak基因可能调节脂环酸芽孢杆菌的的耐酸性。
讨论
Hsp70是已知的进化上最保守的蛋白质。
包括Dnak，Hsc66， Hsc62。
热休克蛋白70家族被发现在原核生物体内,Dnak被广泛的分析。
作为一个组成型的伴侣蛋白，可以上调热休克在高温条件下，他对蛋白质的折叠和细胞存活，生长至关重要。
像其热休克蛋白70家族中的蛋白质，Dnak包含两个域：弱ATP酶活性N-末端域，底物结合域，可以结合肽和其他热休克蛋白调节ATP酶活性。
Dnak 响应温度能力涉及的合作伴侣蛋白为GrpE，在热休克温度下，它经过可逆的结构性变化，改变Dnak成为高亲和力状态。
虽然在几个物种中Dnak已经被测序，但在其表达水平和耐热性的关系上还没有在所有这些全部细节中直接测试。
蛋白质组学分析显示，在酸应激反应方面，Dnak是Lactobacillus casei Zhang.细菌中几个蛋白之一，这些蛋白质的mRNA和蛋白质的表达水平都大幅攀升。
另外Singh et al.使用基因中断技术的研究表明在Staphylococcus aureus的Dnak 对压力的耐受性也发挥着重要作用。
在自然条件下，脂环酸芽孢杆菌被发现在土壤和热酸性环境中如温泉，引起水果和果汁行业微生物学家的关注，主要是因为他能引起果汁腐败和巴氏杀菌。
有个合理的推想是脂环酸芽孢杆菌生长在不好的环境如巴氏杀菌的环境中时，热休克蛋白发挥着关键作用。
不过，据我们所知，以前还没有直接评论这方面研究的论文。
我们通过基因组步移技术首次克隆脂环酸芽孢杆菌Dnak基因，然后在高温和酸性条件下应用定量RT-PCR技术来衡量Dnak基因的表达水平。
结果表明，当脂环酸芽孢杆菌的培养温度低于最适生长温度时，Dnak的表达水平大幅增加，这表明Dnak对细菌在持续应力条件下生存起作用。
当用能引起热冲击的条件对待细菌时，Dnak的表达水平快速增加并在5分钟内达到最高。
（比对照组高0.4倍）一定程度的上调被认为与热冲击温度正相关。
当用pH=0.1的酸处理细菌时，Dnak的表达水平也提高很快，在30分钟内达到对照组的2.5倍以上。
我们的研究结果显示Dnak在调控脂环酸芽孢杆菌耐热耐酸性中的作用和其他细菌中的报告相同。
Dnak上调的时间和模式强烈表明Dnak在生物体生活在如巴氏杀菌操作过程的突然或持续应力条件中发挥着作用。
应当指出的是Dnak的表达水平在应力条件下也经历着波动，譬如持续的应力条件，特别是酸性条件下。
已知的是Dnak与其他热休克蛋白和肽相互影响。
这表明对于脂环酸芽孢杆菌在应力条件下的反应涉及一个更为复杂的网络，其中Dnak起着关键作用。
然而，脂环酸芽孢杆菌耐热和酸性的机理仍然不清楚，需要进一步研究。
在应力条件下，Dnak的表达水平说明不规则的变化引起应力的继续，特别是在酸性条件下。
我们都知道德是Dnak和其他热休克蛋白和肽相互作用，这意味着有Dnak的调控。
这是一个更复杂的机制参与脂环酸芽孢杆菌对应力条件下的作用。
致谢：这项工作是由中国教育部博士基金的部分资助。