蛋白质电泳操作步骤[1]

SDS-PAGE电泳操作步骤：

试剂配制：

（实验中采用均为分析纯）

（1）丙烯酰胺贮液（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）

丙烯酰胺贮液（T=30%，C=3%）

称取29.1 g丙烯酰胺和0.9 g甲叉双丙烯酰胺，用双蒸水溶解，定容至100 ml，过滤备用。(试剂有毒，操作中注意防护)

（2）浓缩胶缓冲液（1 mol/L Tris-HCl，pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）

6.06 g Tris溶解于35 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水定容至50 ml。

（3）分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）

18.16 g Tris溶解于75 ml双蒸水中，用浓盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水定容至100 ml。

（4）10% SDS

（5）10% 过硫酸铵（APS）：使用前新鲜配制，低浓度APS一般当天用当天配制，勿过夜使用。

（6）尿素

（7）TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)

（8）电极缓冲液(1×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）

0.025 mol/L Tris，0.192 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3

（9）电极缓冲液(2×) （棕色瓶中4℃储存，一般使用3-4次）

0.050 mol/L Tris，0.384 mol/L甘氨酸，0.1% SDS，pH 8.3

（10）样品缓冲液（pH 6.8）（4℃下棕色瓶中储存，试剂尽量勿存储过久）

1.6 ml浓缩胶缓冲液（pH 6.8）+ 4 ml 10% SDS + 0.6 g二硫苏糖醇(DTT) +

2.5 ml 87%甘油+0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释到20 ml.

（11）考玛斯亮蓝R-250染色方法：

a．固定液

20%三氯乙酸

b．脱色液

250 ml乙醇，80 ml冰醋酸，加水稀释至1000 ml。

c．染色液

称取0.29 g考玛斯亮蓝R-250溶于250 ml上述脱色液中

样品处理：

处理完样品应尽快使用，若存储，须于-20℃下。

○1.CytC酶解样

每管分别加入8 µl细胞色素C（20 mg/ml），10 ul 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）,1 µl 胰蛋白酶（细胞色素C：胰蛋白酶=50：1）。37℃水浴，2 h。立即放入-20 ℃冰箱冷冻保存备用。上样前加15μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min

○2.大肠杆菌蛋白

取10μІ工程菌种接入10nml LB液体培养基里，过夜培养12h，取出1ml菌液离心10000g/r，5min。弃上清，用1ml Tris-Hcl （pH 8.0 50mM）洗涤1-2次，后分别加入20μІ（pH8.0 5mM）、10μІEDTA，-20℃保存。上样前加入2μІ5%X，再加入50μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min

○3.CytC

15μІCytC加入15μІ上样BUFFER，75℃水浴5-10min

○4.低分子量肽标准

取8-10μІMaker（2mg/ml）,加入10μІ上样buffer，再加入5μІddH2O，75℃水浴5-10min

○5.SPI多肽的制备

Ⅰ材料及试剂（试剂均为分析纯）

纯大豆粉

木瓜蛋白酶（sigma P3250 500-2000AU/g）

正己烷

巯基乙醇

Tris-HCl缓冲液（0.03 M、pH 8.0）

0.2 M HCl

叠氮钠

考马斯亮蓝G250

标准牛血蛋白

Ⅱ制备方法

ⅰ.SPI制备：大豆分离蛋白的制备参照Iwabuchi 和Yamauchi [9]的方法, 具体步骤如下: 全脂豆粉加正己烷(1/5)室温下搅拌1 h脱脂，于3 000 g 离心5 min, 取沉淀反复脱脂两次, 于沉淀中加入15～20 倍含10 mM 巯基乙醇0.03 M、pH 8.0 的Tris-HCl 缓冲液, 室温搅拌1～2 h, 于20 ℃ 6 000 g 离心25 min,取

上清液,用0.2 M HCl 调节pH 至4.8, 置于冰箱下层冷沉过夜, 再于4 ℃9

000 g 离心20 min, 取沉淀分散于少量水中, 调节pH 至7.0, 搅拌1 h 充分溶解后于4 ℃下用含0.05 % 叠氮钠的蒸馏水透析2 d, 再用蒸馏水透析两次去叠氮钠, 冷冻干燥即得大豆分离蛋白(SPI)。（可能透析会损失掉一定量的多肽。）ⅱ.SPI蛋白含量测定：利用考马斯亮蓝蛋白含量测定法，根据牛血蛋白作出的标准蛋白曲线，测定SPI的蛋白浓度：（具体方法参见《生物化学实验原理和方法》P174）

标准蛋白曲线

1.160

0.2

0.4

0.6

0.8

11.2

1.4

00.010.020.03

0.040.050.06

蛋白浓度吸光度

测得1%（1mg/ml ）的SPI 吸光度为0.779，求得即在SPI 质量分数为1%的情况下，其蛋白浓度约为3mg/ml.

ⅲ.SPI 多肽制备：本实验采用木瓜蛋白酶水解SPI ，制取SPI 多肽。标准的酶解体系为溶于0.05 mol/L, pH8.0Tris-HCl 缓冲溶液的SPI 溶液(质量分数为2%),含质量分数为0.05%的叠氮钠,先于38℃下预热5 min,分别添加蛋白酶至750 AU/mL ，然后继续于反应温度下反应，反应时间也很影响SPI 多肽的产率，木瓜蛋白酶持续低温水解16小时也可以产生较多小肽。反应混合物可定期取样并分别加入X- PAGE 样品缓冲液终止反应(1: 1, v/v)。实验上样一般采用过夜酶解透析样(2%*5%)。上样前应将酶解样与样品缓冲液混合物水浴。

操作方法：

所制均为1.0mm 小板所需体积

（1）配制分离胶（16.5%T, 3%C ）：

丙烯酰胺贮液—3ml 分离胶缓冲液—1.5ml 尿素—2.16g 10%SDS —72μІ

（2）配制浓缩胶（4%T, 3%C ）

丙烯酰胺贮液—0.34ml 浓缩胶缓冲液—0.24ml ddH 2O —1.4ml 10% SDS —24μІ

（3）将上两步配制的分离、浓缩胶真空抽气15min ，同时配制10%过硫酸铵: