脱氧核糖核酸酶
核酸的降解和核苷酸代谢
A-腺嘌呤
PHi O 2次黄2嘌呤
核糖
次腺黄苷苷
嘧啶的分解
HOHHβHH-氨OOO基OHO异HβHH-O丁丙H酸OOO氨HCHHNHHH酸OHOHOH2HO2N2ONHH+NH2NHON2ONHN3HCCHC3H乙CCCCHHH2H酸HOHHH3排代323HN3出谢22HNHA体。AHHDNHH乙β+外D-CNP酸H氨或OPHNA胸胞+基3尿2H进3++AD223腺异N嘧N嘧+H入DPHHC嘧丁NC啶有+H啶3P3+啶O酸HO2H机+C2H32酸+O+2
O
O P O CH2
O
O
PRPP: 5-磷酸核糖焦磷酸
O
O
O P O P O + Gln + H2 O
OH
OH O
O
PRPP
O
O P O CH2
O
O
NH2 + ppi + Glu
OH
OH
(3)5-磷酸核糖胺+Gly+ATP → 甘氨酰胺核苷酸+ADP+Pi
NH2 + Gly + ATP RP
NH2 CH2
黄苷 黄嘌呤
鸟苷酸 鸟苷
尿酸
嘧啶碱的分解
哺乳动物U、T可先还原为对应的二氢衍生 物再破环生成β-Ala及β-氨基异丁酸。
黄嘌呤
尿酸
OONHHH2
HNH
H
H核苷磷酸化酶
H O核糖-1-磷酸 22
脱氨基酶
HO H
H O NN 2 黄嘌呤氧化酶 OO2
NN HH
蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二脂酶属于外切酶。
酶工程第6章-脱氧核酶2012
图； 9.转染48h； 10. 转染60h； 11. 转染60h后的阴性对
照； 12. 转染72h。
利用核酶或脱氧核酶抑制有害基因的基本原理
对医疗应用来说最主要的还是寻找那些具 有切割特定RNA顺序的核酶，从而可以在体 内抑制某些有害基因。
基因治疗的概念出现在二十几年前，现在已 经在临床上得到了实际应用。基因治疗最早的临 床研究是1990年Blaese 等进行的对腺苷脱氨酶 (ADA)缺乏症的治疗，随后在对遗传病、病毒侵染、 肿瘤等疾病的治疗中得到广泛的应用。中国也是 开展基因治疗比较早的国家，1991年薛京伦等开 展了血友病B基因治疗的临床实验，并取得比较理 想的效果。
结构稳定。生理条件下DNA比RNA稳定106 倍，DNA的磷酸二酯键比蛋白质的肽键抗 水解能力要高100倍。
成本低廉、易于合成和修饰。 脱氧核酶具有催化效率高和高度专一性等
特性。
脱氧核酶(Deoxyribozyme，DRz)的分类
分类依据：借鉴国际酶学委员会对蛋白酶 的分类方法，将DRz 分成4 类:水解酶、转移 酶、合成酶和氧化酶 具有水解酶活性的DRz 1、作用于RNA 的DRz 主要包括水解RNA的“10-23”、“8-17”DRz。
手枪形脱氧核酶自我剪切作用机理
切割点
10
5‘ 20
3‘ C A
茎I(结合部位)
40
茎II (催化部位) 30
手枪形结构脱氧核酶的自身切割位点在第14nt处，其3’端约27个碱基对自身切割活 性的发挥至关重要。
“二分”型结构脱氧核酶
【精选】第六节 单链内切核酸酶
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二、 Bal 31核酸酶 Bal 31核酸酶的特性：
对单链DNA具有特异的内切酶活性，可从3'OH末端迅速降解DNA。 对于线性双链DNA分子，它表现为3'→5'端的 外切酶活性和5'→3'的外切酶活性，可有控制地 从3'末端和5'末端逐个水解除去单核苷酸，产生 缩短了的DNA分子。（注意：Bal 31的3'外切酶 活性约为它的单链特异性内切酶活性的20倍）
程度、RNA分子定位、确定内含子的位置、内含 子和外显子剪切位点的定位、转录起始位点与终 止位点的测定中，S1核酸酶都是十分有效的工具。
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S1核酸酶的活性可被PO43-、5'核苷、核苷 三磷酸、枸橼酸盐和EDTA抑制。然而，其在低 溶度的变性剂（如SDS、尿素甲酰胺）存在的条 件下稳定。
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Bal 31核酸酶的应用：
Bal 31核酸酶降解DNA需要Ca2+的存在，在 反应的不同阶段加入螯合剂—EGTA（乙二醇双β －氨基乙醚四乙酸）可使反应终止。
（1）用于确定DNA片段的限制酶图谱
使用Bal 31核酸酶降解待测DNA，在不同
反应时间取出反应物，用EGTA溶液中止反应。
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脱氧核糖核酸酶Ⅰ的应用：
在分子克隆中，DNA酶Ⅰ主要用于：与大 肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ联合参与切口平移法标记 DNA分子；在Mn2+存在下，随机裂合蛋白在DNA上的 精确结合位点；使用无RNase的DNase Ⅰ去 除转录产物中的模板DNA。
核酸的酶促降解和核苷酸代谢
11.1 核酸的酶促降解 11.2 核苷酸的分解代谢 11.3 核苷酸的生物合成
核苷
核苷酶
戊糖
核酸
核酸酶
核苷酸
核苷酸酶
磷酸
碱基
嘌
嘧
呤
啶
分
分
解
解
11.1 核酸的酶促降解
生物体内存在着多种降解核酸的酶类，称为核酸 酶(nuclease) ，它在核酸降解和周转中起着重 要作用。
11.1.2 脱氧核糖核酸酶
脱氧核糖核酸酶专一水解DNA，作用方式作为 内切酶，切断双链或单链，作为外切酶有 5→3切割或3→5切割。
例如牛胰脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅰ)，可切割 双链和单链DNA，产物为5-磷酸为末端的寡 核苷酸；牛脾脱氧核糖核酶(DNaseⅡ)降解 DNA产生3-磷酸为末端的寡核苷酸。
核苷经核苷酶(nudeosidase)作用分解为嘌呤碱 或嘧啶碱和戊糖。
分解核苷的酶有两类
①核苷磷酸化酶(nucleoside phosphorylase)广泛 存在于生命机体中，催化反应可逆；
②核苷水解酶(nucleoside hydrolase)主要存在 于植物、微生物体内，只作用于核糖核苷， 催化反应不可逆。
核酸酶分类
底物：脱氧核糖核酸酶(dexyribonuclease,DNase) ， 核糖核酸酶(ribonuclease, RNase) RNase
作用方式：核酸外切酶（exonuclease） 核酸内切酶（endonuclease）
11.1.1 核酸酶 11.1.1.1 外切核酸酶
外切酶作用于核酸链的一端，逐个水解下核 苷酸，是非特异性的磷酸二酯酶。为非特异 性磷酸二酯酶。
脱氧核糖核酸
脱氧核糖核酸由成千上万个脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸。
因含脱氧核糖而得名,简称DNA(见彩图)。
它是染色体的主要成分。
此外，真核生物的线粒体和叶绿体中也含有DNA，原核生物的质粒全由DNA构成。
在不含核糖核酸(RNA)的病毒和噬菌体中，其核酸都是DNA。
除了RNA病毒和噬菌体外，DNA是所有生物的遗传物质基础。
生物体亲子之间的相似性和继承性即所谓遗传信息都贮存在DNA分子中。
1944年O.T.埃弗里等人从带荚膜光滑菌落的?型肺炎球菌抽提出DNA,加到不带荚膜粗糙菌落的肺炎球菌培养基中，使后者转化为带荚膜光滑菌落的?型肺炎球菌，并证明这种转化能力不能为蛋白水解酶或核糖核酸酶破坏，但若用脱氧核糖核酸酶处理，就失去转化能力。
1952年A.D.赫尔希和M.蔡斯用同位素分别标记(32P标记DNA,35S标记蛋白质)的T2噬菌体感染大肠杆菌，发现只有DNA进入细菌体内,蛋白质则留在体外。
新生成的噬菌体也只含有32P而不带35S，进一步证实DNA是遗传信息的载体。
大小和形状最小的如病毒和噬菌体DNA，分子量d也在百万以上，大肠杆菌的DNA分子量为2.5×109,人的DNA为1.5×1012。
DNA的大小还可以所含碱基对数目和分子长度来表示，如猴肾病毒40的DNA含有5100碱基对,其分子长为1.7微米,即长度为1微米的DNA相当于3000碱基对,其分子量为3000×660或2×106(每一碱基对分子量以660计)。
DNA分子大多是线性，不分枝,如真核生物染色体中的DNA;有些是环状分子,如大肠杆菌的DNA，线粒体DNA，叶绿体DNA和一些病毒DNA等。
绝大多数DNA是双链,只有少数噬菌体和病毒DNA是单链，如ΦX174的DNA是环状单链分子。
碱基组成由脱氧腺苷酸、脱氧鸟苷酸、脱氧胸苷酸和脱氧胞苷酸等脱氧核苷酸所组成。
其中腺、鸟即腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G);胸、胞即胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)。
脱氧核糖核酸酶活力检测方法
脱氧核糖核酸酶活力检测方法编制说明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会《二О一五年国家标准制修订项目》，项目编号“-T-424”。
本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于2016年完成。
本标准起草工作组由中国标准化研究院、浙江工商大学、河北农业大学等单位共同组成。
二、标准制定的背景及意义核酸分解的第一步是水解核苷酸之间的磷酸二酯键，在高等动植物中都有作用于磷酸二酯键的核酸酶，其本质是蛋白质。
不同来源的核酸酶，其专一性、作用方式都有所不同。
有些核酸酶只能作用于核糖核酸（RNA），称为核糖核酸酶（RNase），有些核酸酶只能作用于脱氧核糖核酸（DNA），称为脱氧核糖核酸酶（DNase），核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶统称为核酸酶（Nuclease）。
脱氧核糖核酸酶是将单链或双链DNA同等程度地随机分解，生成具有5'-P 末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。
脱氧核糖核酸酶具有重要的功能，目前主要用途包括制备不含DNA的RNA样品；RT-PCR反应前RNA样品中去除基因组DNA等可能的DNA污染；体外T7, T3, SP6等RNA Polymerases催化的RNA 转录后去除DNA模板；DNase I Foot printing研究DNA-蛋白质相互作用；缺口平移（Nick translation）；产生DNA随机片段文库；细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照等。
脱氧核糖核酸酶I一般被认为是脱氧核糖核酸酶的典型代表，分子量约32 kDa。
由于脱氧核糖核酸酶具有重要的生理学作用，引起了国内外广泛的关注。
目前已经商业化生产和销售，但是作为脱氧核糖核酸酶的重要质量指标之一的酶的活力，根据文献调研显示相应的测定方法目前仍然没有形成统一的检测和分析标准，各生产和销售厂商对其活力的质量控制各自定义，同一种酶选用不同的活力测定方法结果显示大小差异显著。
这实际上已经成为脱氧核糖核酸酶产品可持续发展的瓶颈问题，给消费者造成了极大的不便。
核酸的降解和核苷酸代谢(1)
大肠杆菌核糖核苷酸还原酶R2亚基
IMP/GMP+PPi PCR(聚合酶链式反应) （5-磷酸核糖-1-焦磷酸） 肝、肾、胰、心、脑、肉馅、肉汁、沙丁鱼、鱼卵、小虾 PCR(聚合酶链式反应) 1 嘌呤核苷酸的生物合成 ④组成辅酶,如腺苷酸可作为NAD＋、NADP＋、FMN、FAD及CoA等的组成成分; 嘌呤核苷酸的补救合成2 第二类 含嘌呤中等的食物 (每100g食物含嘌呤75～100mg) 甲基丙二酸单酰辅酶A→琥珀酸CoA 一些微生物如乳酸杆菌、枯草杆菌等则以核苷三磷酸为还原底物。 （N10-CHO FH4） PCR：polymerase chain reaction 利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位、CO2等简单物质为原料。 3 脱氧核糖核酸酶(DNase) AMP + PPi IMP/GMP+PPi 利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位、CO2等简单物质为原料。 利用体内游离的碱基或核苷，反应较简单。 黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)
解 鸟苷酸 27mmol/L (4.
鲤鱼、贝壳类、鳗鱼、熏火退、猪肉、小牛肉； IMP/GMP+PPi
痛风的药物治疗：别嘌呤醇
脱氨酶
通常是在核苷二磷酸水平上发生还原反应；
次黄嘌呤 黄嘌呤
AMP + PPi 一些微生物如乳酸杆菌、枯草杆菌等则以核苷三磷酸为还原底物。
黄嘌呤 第四类 含嘌呤很少的食物
②储存能量,三磷酸核苷酸尤其是ATP是细胞的主要能量形式，一些活化的中间产物，如UDP葡萄糖，亦含有核苷酸成分;
• 第三类 含嘌呤较少的食品(每100g食物含嘌呤<75mg) – 龙虾、蟹 ；火腿、羊肉、鸡；麦片、面包、粗粮 ； – 芦笋、四季豆、菜豆、菠菜、蘑菇、干豆类、豆腐
生物化学_09 核酸降解和核苷酸的代谢
IMP转变为GMP和 转变为GMP （3）IMP转变为GMP和AMP
2、 补救途径
(利用已有的碱基和核苷合成核苷酸) (1) 磷酸核糖转移酶途径（重要途径）
核苷磷酸化酶
嘌呤核苷 + 磷酸 腺嘌呤 + 5-PRPP
次黄嘌呤(鸟嘌呤) 磷酸核糖转移酶
嘌呤碱 + 戊糖-1-磷酸 AMP + PPi
腺嘌呤磷酸核糖转移酶
基因组DNA 基因组 不被切割
限制—修饰的酶学假说 限制 修饰的酶学假说 1968年，Meselson 和Yuan发现了 型限制性核酸内切酶 年 发现了I型限制性核酸内切酶 发现了 1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了 年 和 从流感嗜血杆菌中分离纯化了 第一个II型限制性核酸内切酶 第一个 型限制性核酸内切酶Hind II 型限制性核酸内切酶
（2）尿嘧啶核苷酸的合成 ）
天冬氨酸转氨甲酰酶 二氢乳清酸酶
乳清苷酸焦磷酸化酶／Mg2+ 二氢乳清酸脱氢酶
乳清苷酸脱羧酶
（3） 胞嘧啶核苷酸的合成
尿嘧啶核苷三磷酸可直接与NH3（细菌）或Gln（动物） 细菌） 尿嘧啶核苷三磷酸可直接与 （动物） 反应，生成胞嘧啶核苷三磷酸。 反应，生成胞嘧啶核苷三磷酸。
二、脱氧核糖核酸酶
只能水解DNA磷酸二酯键的酶。 只能水解DNA磷酸二酯键的酶。 DNA磷酸二酯键的酶 牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ） 牛胰脱氧核糖核酸酶（DNaseⅠ）： 可切割双链和单链DNA 降解产物为3 DNA， 可切割双链和单链 DNA， 降解产物为 3’ - 磷酸 为末端的寡核苷酸。 为末端的寡核苷酸。 限制性核酸内切酶： 限制性核酸内切酶： 细菌产生的、能识别并特异切割外源DNA DNA特定 细菌产生的 、 能识别并特异切割外源 DNA 特定 中的磷酸二脂键( 序列中的磷酸二脂键 对碱基序列专一） 序列中的磷酸二脂键(对碱基序列专一）的核酸内 切酶。 切酶。
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本章小结
核苷酸的水解、嘌呤碱和嘧啶碱的分解代谢； 嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成过程以及脱氧
核糖核苷酸的合成。
6
N
15
7
8C
24
3
9
N
甘氨酸4,5,7 一碳单位
Gln（酰胺基） N5,N10-次甲基四氢叶酸
不是先合成嘌呤环，而是核糖与磷酸先合成磷酸核 糖，然后逐步由谷氨酰胺、甘氨酸、一碳基团、 CO2及天冬氨酸掺入碳原子或氮原子形成嘌呤环。
特点：
①在PRPP的基础上, 逐步加上简单原料而形成嘌 呤核苷酸(11步反应)；
本章要求
熟悉核苷酸的水解、嘌呤碱和嘧啶碱的分 解代谢；
熟悉嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成过程 以及脱氧核糖核苷酸的合成。
一、核酸的酶促降解 1.核酸酶(nuclease)：降解核酸中的磷酸二酯
键的酶。
分类：
按照底物：脱氧核糖核酸酶(DNase) 核糖核酸酶(RNase)；
按照作用方式：核酸外切酶（exonuclease） 核酸内切酶（endonuclease）
通常核糖核苷酸的还原是在核糖核苷二磷酸水平进 行；氢供体为NADPH。
NDP
NDP还原酶，ATP,Mg 2+
（d）NDP
还原型硫氧还蛋白
dADP,dGDP,dCDP 氧化型硫氧还蛋白 均可通过此途径合成
NADP+
NADPH + H+
胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的合成 两个步骤： 由尿嘧啶核苷酸还原形成尿嘧啶脱氧核糖核苷酸； 尿嘧啶环经甲基化转变成dTMP。
位磷酸与其相邻核苷酸C-5’位所形成的磷酸酯键。 RNase T1：特异性作用于鸟嘌呤核苷酸的C-3’位
磷酸与其相邻核苷酸C-5’位所形成的磷酸酯键。 RNase U2：特异性作用于嘌呤核苷酸的C-3’位磷
酸与其相邻核苷酸C-5’位所形成的磷酸酯键。
二、核苷酸分解代谢
1.核苷酸的分解
由核苷酸酶催化，水解为核苷及无机磷酸。
非特异性的核苷酸酶，能作用于一切核苷酸。 而特异性强的核苷酸酶只能水解3-核苷酸或 5-核苷酸。
2.核苷的分解
核苷经核苷酶(nudeosidase)作用分解为嘌 呤碱或嘧啶碱和戊糖。分解核苷的酶有两类：
①核苷磷酸化酶：催化可逆反应。
②核苷水解酶：只作用于核糖核苷，催化反 应不可逆。
3.嘌呤碱的分解
H2O
-丙氨酸 +NH3+CO2
H2O
-脲基丙酸
T的分解产物是NH3、CO2和-氨基异丁酸。
三、核苷酸的合成代谢
补救途径
从头合成
核苷 碱基
核糖、氨基酸、CO2、NH3 核糖核苷酸
辅酶
脱氧核苷
脱氧核苷酸
RNA
核苷酸合成的两条途径
DNA
1. 嘌呤核苷酸的合成
CO2
Asp
一碳单位 N10-甲酰 四氢叶酸
（1）脱氧核糖核酸酶(DNase) 特异性水解DNA和切断磷酸二酯键的酶类。
5’
DNase I
3’ 5’
DNase Ⅱ 3’
3’,5’-磷酸二酯键
限制性内切酶： 只作用于双链 DNA，只在特定 核苷酸序列处切 开核苷酸之间的 连接键。
（2）核糖核酸酶(RNase) 切断RNA中的磷酸二酯键的内切酶。 RNase I：特异性作用于RNA中嘧啶核苷酸的C-3’
NH 2
N
N H
腺嘌呤
A
N
G
鸟嘌呤
N
脱氨酶
排出体外
（人和灵长类等）
脱氨酶
次黄嘌呤氧化酶 黄嘌呤氧化酶
次黄嘌呤
黄嘌呤
尿酸（醇式和酮式）
尿酸酶
尿囊酸酶
尿素
尿囊酸
尿囊素酶
（其他哺乳动物等）
尿囊素
鱼类和两栖动物
某些硬骨鱼
4.嘧啶碱的分解
NH 2
NH3
N
N
O
H
C
胞嘧啶脱氨酶
O NH
还原 二氢尿嘧啶
N
O
H
U
（开环）
②IMP是重要的中间产物，AMP、GMP的前体。
2. 嘧啶核苷酸的合成
Gln
Asp CO2
先利用小分子化合物合成嘧啶环，再与磷酸核糖 结合成乳清酸核苷酸； 先合成尿嘧啶和尿苷酸（UMP），再转化成其他 嘧啶类核苷酸。
3.脱氧核糖核苷酸的合成
由核糖核苷酸还原得到；
由核苷酸还原酶系催化，包括硫氧还蛋白、硫氧还 蛋白还原酶、核糖核苷酸还原酶。