基因克隆酶学基础
基因克隆技术的基本步骤
基因克隆技术的基本步骤随着科技的不断发展，基因克隆技术越来越成为生命科学研究的重要手段。
在生命科学、医学等领域，基因克隆技术的应用十分广泛。
本文将介绍基因克隆技术的基本步骤。
一、选择载体DNA在基因克隆中，载体DNA是将外源DNA（待克隆DNA）转化进细胞的基础。
目前主要的载体DNA是质粒，其一般大小在1至20 kb之间。
质粒的选择应遵循以下几个原则：1. 合适的选体标识。
大多数载体都有一些明显的特征，例如特定的抗生素抗性或颜色，因此选择能够用于筛选的选体标识是基本原则之一。
2. 合适的克隆位点。
载体DNA上应具有克隆位点，以便将待克隆DNA插入到其中。
3. 可重复复制。
质粒必须带有在细胞内自我复制所必需的序列。
二、切割DNA通过限制性内切酶切割将待克隆DNA和载体DNA裂解成短的DNA片段。
这些片段在电泳时可以按照大小区分开，以便以后的克隆工作。
三、将外源DNA插入载体DNA外源DNA和载体DNA的连接需要使用DNA连接酶，如DNA ligase。
方法是将两个DNA片段的末端和连接起来形成一个完整的DNA分子。
连接成功后，形成了一个混合DNA。
由于载体的复制和传递，待克隆DNA也可以被大量复制。
四、将混合DNA转化进宿主细胞将混合DNA转化进宿主细胞是整个克隆过程中至关重要的一步，因为宿主细胞受到质粒的干扰，催化质粒遗传信息的传递与表达。
大多数质粒都需要在易感受性细胞中才能存在并复制。
宿主细胞的选择是非常重要的，有些宿主细胞对外源DNA的吸收和扩增效率非常高，充分利用每一个获得的外源DNA分子。
五、筛选克隆基因最后一步是克隆基因的筛选，筛选克隆基因需要具有合适的筛选方法。
常用的筛选方法是使用抗生素抗性，因为载体上通常带有抗生素基因，能够筛选那些携带载体克隆块的细胞。
克隆基因的筛选方法不止于抗生素抗性，还可以根据不同的克隆目标进行选择。
例如，当克隆目标是蛋白质时，可以使用融合蛋白法克隆兴趣的编码DNA，并利用其蛋白质结构的特点分离出融合蛋白。
基因克隆的基本原理和流程
基因克隆的基本原理和流程
基因克隆是一种技术，它使用质粒或DNA片段来复制一个特定的基因序列。
这种技术可以被用来产生大量相同的基因，以改变物种的表型特征，也可以用来研究有关基因的功能、结构和表达的有关信息。
基因克隆的基本原理是使用一种叫做酶切的酶，通过限制性内切酶将DNA片段分割成较小的片段，然后使用DNA 聚合酶将它们连接在一起。
这样，就可以生成几乎完全相同的DNA序列。
基因克隆的流程可以分为三个主要步骤：
1. 提取DNA：首先，由于想要克隆的基因位于一个细胞上，所以必须提取该细胞中的DNA。
常见的提取方法有水解法和溶剂提取法，其中水解法主要通过分解细胞壁和细胞质来提取DNA。
2. 克隆：其次，在提取出DNA后，使用限制性内切酶将DNA分割成较小的片段，然后使用DNA聚合酶将它们连接在一起。
3. 将克隆的DNA植入宿主：最后，将克隆的DNA植入一个宿主细胞，使其可以在宿主体内进行表达。
这里，一般会使用一种叫做质粒的DNA载体，它可以将克隆的基因植入宿主细胞中，从而使细胞获得克隆的基因。
基因克隆是一个复杂的流程，其中包括对基因的提取、克隆和植入宿主体等步骤，而且要完成克隆，还需要使用一系列不同的技术和工具，如限制性内切酶、DNA聚合酶和质粒等。
基因克隆技术在生物学、医学和农业等领域都有着重要的应用，它们已经成为研究基因功能、结构和表达的重要工具。
植物基因克隆的策略及方法
植物基因克隆的策略及方法首先，PCR是植物基因克隆的重要策略之一、PCR（聚合酶链反应）是一种体外复制DNA片段的方法，可以在短时间内扩增大量的特定DNA序列。
通过PCR可以快速准确地克隆植物基因。
PCR的基本原理是利用DNA 聚合酶酶学合成原理，在DNA片段两侧设计引物，将其与DNA片段的两侧结合，在适当的条件下进行DNA的聚合酶链反应，从而扩增目标基因。
PCR方法主要包括加热解性、引物连接、扩增和酶切等步骤。
其次，限制性酶切也是植物基因克隆的重要方法。
限制性酶切是指利用特定的限制性酶将DNA分子切割成特定序列的片段。
通过限制性酶切，可以将目标基因从植物DNA中剪切出来，然后进行进一步处理。
限制性酶切的基本原理是将特定的限制性酶加入反应体系中，该酶能识别和切割DNA的特定序列，从而将目标基因从DNA中剪切出来。
限制性酶切方法主要包括选择合适的限制性酶、反应条件的优化、酶切产物的回收和检测等步骤。
连接是植物基因克隆的另一种重要方法。
连接是指将目标基因连接到特定的载体DNA上，以便在目标植物中稳定地表达。
连接方法主要包括两个步骤：首先，需要处理载体DNA和目标基因的末端，以便它们能够相互连接；其次，利用DNA连接酶将载体和目标基因连接起来。
连接步骤中的处理涉及到DNA末端的修饰和处理，可以通过多种方法如限制性内切酶切割、引物扩增、酶切等进行。
最后，转化是植物基因克隆的最后一步。
转化是指将连接好的目标基因插入到目标植物的基因组中，使其能够在植物体内稳定表达。
转化的方法有多种，包括农杆菌介导的转化、基因枪转化、电穿孔转化等。
其中，农杆菌介导的转化是最常用的方法之一、农杆菌介导的转化是利用农杆菌作为载体将外源DNA导入到目标植物细胞中，通过农杆菌的自然寄生习性以及在植物细胞中特定的植物基因的活性表达，实现目标基因的稳定表达。
总的来说，植物基因克隆的策略和方法包括PCR、限制性酶切、连接和转化。
通过这些方法，可以快速准确地克隆植物基因，实现对植物遗传特性的改变和优化，为农业生产和植物遗传研究提供有力的技术支持。
关于基因克隆的相关研究
关于基因克隆的相关研究与PCR、qPCR等技术一样，作为分子实验室必备手段，分子克隆技术被广泛用于多样的基因功能研究。
所谓分子克隆指的是在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入宿主细胞内并获得持续稳定增殖能力和表达。
基因克隆技术的发展经历3个阶段，第一阶段为经典的T4 DNA 连接酶介导的TA克隆及粘性末端克隆，第二阶段为基于DNA修饰酶的LIC系列克隆，第三阶段为基于DNA重组酶的Gateway克隆及一步法克隆。
一、基于T4 DNA连接酶的克隆本系列克隆使用的酶类为：T4 DNA连接酶。
限制性内切酶：可以对目的片段和载体识别并切割出相同的粘性末端，用于碱基互补配对。
T4 DNA连接酶：可以催化目的片段和载体最后一位碱基上的5’磷酸基团和3’羟基形成磷酸二酯键，以实现将目的片段和载体连接成环状质粒。
根据是否使用限制性内切酶，可分为平末端克隆/TA克隆和粘性末端克隆。
二、基于DNA修饰酶的克隆方法本系列克隆使用的酶类为：T4 DNA聚合酶T4 DNA聚合酶具有3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性。
缺乏dNTP时，表现为3'→5'核酸外切酶活性，切割目的基因和载体，产生单链的DNA粘性末端；加入某一单独dNTP，3'→5'核酸外切酶活性和5'→3' DNA聚合酶活性平衡，掺入与切割动态平衡，切割终止。
因此，T4 DNA聚合酶为基础的克隆方法的关键是目的基因和载体间需要有一定数量的重叠序列。
三、基于重组酶的克隆方法Gateway克隆法——本系列克隆使用的酶类为：λ整合酶Int、λ切除酶Xis、大肠杆菌IHF因子。
该技术需要四个特异性重组位点（attB、aatP、attL、attR），引导发生两个特异性重组反应（BP反应和LR反应）。
BP反应：将目的基因克隆进入入门质粒。
第二章基因工程的酶学基础
第二章基因工程的酶学基础第二章基因工程的酶学基础第一节限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。
1. 来源原核生物。
2. 性质内切酶。
即在核酸分子链的内部制造切口的酶。
3. 功能自我保护作用。
细菌的限制和修饰系统（R/M体系）（1）限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。
（2）修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。
①Dam甲基化酶GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基②Dcm甲基化酶CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基二、限制性内切酶的类型目前鉴定出四种不同类型的限制性内切酶。
I 型限制性内切酶II 类限制性内切酶III类限制性内切酶Ⅳ类限制性内切酶1. I型限制性内切酶首先由M. Meselson和R. Yuan在1968年从大肠杆菌B株和K 株分离的。
如EcoB和EcoK。
（1）识别位点序列未甲基化修饰的特异序列。
EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC（2）切割位点在距离特异性识别位点约1000—1500 bp处随机切开一条单链。
（3）作用机理需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。
2. II类限制性内切酶首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。
分离的第一个酶是Hind Ⅱ（1）识别位点序列未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。
与DNA的来源无关。
各种限制酶的识别序列一般都具有回文结构(palindrome)各种限制酶的识别序列一般都具有回文结构(palindrome)正读与反读都相同。
以识别序列的中线为对称轴，左右两侧的碱基互补。
为便于书写，识别序列可以5?→3’走向的单链DNA表示。
基因克隆的基本理论及实验技术ppt课件
基因克隆的基本概念及理论知识 第二课时: 基因克隆的操作过程及注意事项
第三课时: 实验操作过程演示(录像)
第一课
基因克隆的基本概念及理论知识
基因克隆的定义：
1. 工具书上： 插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体 是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或
PCR扩增 5’ 3’ 3’ 5’ 启动子区序列
基因的编码区及启动子区序列必须通过 连接到质粒上构建成重组表达载体，然 后进行目的片段扩增及功能研究。
什么是质粒（Plasmid）？
质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细 胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用 来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因 工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很 小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。
4969 bp
AMP+
真核表达载体
PCMV
EGFP
pCMV-EGFP
4749 bp
Neo/Kan-R SV40 polyA
目的蛋白表达载体中的表达盒
启动子（Promoter） 基因编码蛋白序列（CDS） 转录终止信号区（CDS）
基因克隆是将DNA或基因组的DNA片段嵌入 克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞，
质粒的重要特征
（1） 是染色质外的环形双链DNA分子； （2）能自主复制，是能独立复制的复制子；
（3）质粒对宿主生存并不是必需的；
（4）质粒上常带有耐抗生素基因； （5）质粒DNA上有多个酶切位点。
限制性核酸内切酶
基因克隆1
一互补示意图：
+
-peptide
C-terminus of -galactosiase
X-gal
C-terminus of -galactosiase
X-gal
2.根据重组子的结构特征筛选
快速裂解菌落鉴定分子大小
重组子的分子量较大（适用于插入片段较大的 重组子）
内切酶图谱鉴定
重组子与非重组子的内切酶图谱不同。
RNA来源：新鲜组织或细胞
DNA提取方法：常规苯酚-氯仿方法、试剂盒方法---； Isolation Genomic DNA
Genomic DNA
凝胶电泳：
是一大类技术，被用于分离不同物 理性质（如大小、形状、等电点等）的 分子。凝胶电泳通常用于分析用途，但 也可以作为制备技术。
该技术操作简便快速，可以分辨用 其它方法（如密度梯度离心法）所无法 分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌 入染料溴化乙啶(EB)染色,在紫外光下 至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而 可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此 外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的 DNA条带,用于以后的克隆技术操作。
蓝白斑筛选(一互补)
载体: LacZ的调控序列和N端146个氨基酸残基的编码 序列(受体)。
宿主菌: 染色体DNA含有LacZ的C 端编码序列(供体) 。
-互补 分解生色底物X-ga1(5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷 )产生蓝色。外源DNA片段插入质粒的多克隆位点后，带有重组子的 细菌形成白色克隆。
导合成一种功能肽链或RNA分子。
克隆(Cloning) 指用无性繁殖的方法产生一组遗传上相
同的细胞和生物群体的过程。
基因克隆(gene cloning)：利用无性繁殖的方法获得
基因克隆的原理
基因克隆的原理
基因克隆是指通过重组DNA分子来复制或复制特定基因的过程。
它的原理涉及利用DNA重组技术从一个生物体中提取目
标基因，并将其插入到另一个宿主生物体的基因组中。
以下是基因克隆的基本原理和步骤：
1. 提取目标基因：从一个生物体的DNA中提取目标基因。
这
可以通过多种方法实现，如聚合酶链式反应（PCR）或酶切和连接技术。
2. 槽融合：使用合适的酶将目标基因与质粒DNA或其他载体DNA相连接。
这些质粒DNA通常是经过改造的DNA分子，
包含有关目标基因的所需信息，如启动子、激活子和选择性标记。
3. 转化宿主细胞：将重组质粒DNA导入到宿主细胞中。
这可
以通过多种方法实现，如电穿孔、化学转化或基因枪。
宿主细胞通常是细菌或酵母等单细胞生物。
4. 选择性筛选：使用特定的标记或抗生素等方法筛选出已经成功转化的宿主细胞。
这有助于确保目标基因已经被插入到宿主细胞的基因组中。
5. 复制和表达：将含有目标基因的宿主细胞进行培养和繁殖，以实现大规模的基因复制。
通过适当的培养条件和诱导剂等方法，目标基因可以被表达出来，并产生所需的功能蛋白或产物。
总的来说，基因克隆基于DNA重组技术，利用质粒DNA或其他载体DNA将目标基因导入宿主细胞的基因组中。
这种方法使得科学家能够通过修改和复制基因，研究基因功能、制备蛋白质或生产其他有用的化合物。