第二章基因工程的酶学基础
第二章基因工程的酶学基础内容一、概述二、限制性内切核酸酶三、DNA连接酶四、其他工具酶一、概述工具酶：在生物技术中常用的各种工具酶系指能用于DNA和RNA分子的切割、连接、聚合、反转录等有关的各种酶系统称为工具酶。
工具酶名称主要功能限制性内切核酸酶在DNA分子内部的特异性的restriction endonucleases 碱基序列内部进行切割DNA连接酶将两条以上的线性DNA分子或片段DNA ligase 催化形成磷酸二酯键连接成一个整体DNA聚合酶I通过向3’端逐一增加核苷酸以填补双链DNA分子上的单链DNA polymerase I 裂口，即5’→3’DNA聚合酶活性与3’→5’及5’→3’外切酶活性多核苷酸激酶催化将把一个磷酸分子加到多核苷酸链的DNA polymerase kinease 5’-OH末端上(接下表格)工具酶名称主要功能反转录酶以RNA分子为模板合成互补的cDNA链reverse transcriptaseDNA末端转移酶将同聚物尾巴加到线性双链或单链DNA分子的3’-OH DNA terminal transferase 末端或DNA的3’-末端标记dNTP碱性磷酸酶去除DNA,RNA,dNTP的5’磷酸基团BAP orCIAP核酸外切酶III 降解DNA3’-OH末端的核苷酸残基exonuclease III降解酶S1 降解单链DNA或RNA,产生带5’磷酸的单核苷酸或nuclease S1寡聚核苷酸，同时也可切割双链核酸分子的单链工具酶名称主要功能核酸酶Bal 31 降解双链DNA,RNA的5’及3’末端，nuclease Bal31Taq DNA聚合酶能在高温（72℃）下的单链DNA为模板，Taq DNA polymerase从5’→3’方向合成新生的互补链核糖核酸酶专一性降解RNARNase脱氧核糖核酸酶内切核酸酶，水解单链或双链DNA DNase二、限制性内切核酸酶1、限制性核酸内切酶的分类2、限制性核酸内切酶的命名原则3、限制性核酸内切酶的基本特征4、影响限制性内切酶的活性因素5、限制性核酸内切酶的应用1、限制性核酸内切酶的分类限制性核酸内切酶主要分成三大类：I类：能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割双链，但切割序列没有专一性，是随机的。
这类酶如Eco b、Eco k等。
----G AATTC--------CTTAA G----II类：能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。
这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的，是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。
----G AATTC--------CTTAA G----III类：有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。
它在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。
这类酶如Eco P I、Hin f III等。
----******--------******----限制内切核酸酶的识别序列特点I和III型酶识别序列特点：一般只具有内切酶和甲基化酶的活性； 且识别位点的不恒定等；不具备用来做工具酶。
限制内切核酸酶的识别序列特点II型酶识别序列特点：均有严格的识别特定核苷酸的序列；识别的核苷酸序列一般在4－8个碱基对； 大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式。
限制性核酸内切酶的命名现在采用的是1973年由Smith H.O.和Nathans D.提议的命名系统，限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。
现在通用的命名原则是：第一个字是细菌属名的第一个字母，第二、三个字是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字母；接下去是细菌株的第一个字母，用正体字母书写。
如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字I、II、III等来代表。
限制性内切核酸酶的命名Eco RI表示大肠杆菌属名第一个字母E ：表示种名头两个字母co ：表示株名R ：表示该菌中第一个被分离出来的酶。
I ：名称属名(大写)种名(小写）株名序数来源菌株EcoR I E co R I Escherichia coli R Hind IIIH in d III Haemaphilus influenzae Hind IIH in d II Haemaphilus influenzae Hind I H in d I Haemaphilus parainfluenzaeLurva 和Human （1952）以及Bertani 和Weigle （1953）发现了噬菌体λ的限制作用，即用一种λ噬菌体在一种宿主细胞中生长良好，但在另一种宿主细胞中生长很差，其原因在于它的DNA 受到后一种宿主的“限制”。
由此发现了限制-修饰系统。
3、限制性内切核酸酶的基本特征由宿主控制的限制与修饰作用50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象λ(B )λ(K )大肠杆菌B 大肠杆菌K114×10 —410 —4 E.O.P 成斑率efficiency of plating3、限制性内切核酸酶的基本特征由宿主控制的限制与修饰作用限制和修饰系统中的限制作用即指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制；而寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。
II型限制性核酸内切酶种类：从各种不同的微生物中已经分离到的第二型限制性核酸内切酶就有2300多种以上。
识别序列：可以识别230种以上的DNA序列。
应用：这些发现与开发的II类限制性核酸内切酶都已成为生物技术应用中的重要工具酶。
II型酶识别序列特点绝大多数的II型限制性核酸内切酶都有严格的识别特定核苷酸的序列。
识别的核苷酸序列一般在4～8个碱基对，最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、9个、10个和11个核苷酸的。
大多数识别位点具有180度旋转对称的结构形式，即这些核苷酸对的顺序是回文结构。
II型酶识别序列特点----G AATTC--------CTTAA G----EcoR I 识别的核苷酸序列（1）在对称轴5 '侧切割产生5 '粘端5 '----NG ↓AATTCN----3'Eco RI 5'----NG AATTCN----3'3'----NCTTAA ↑GN----5'3'----NCTTAA GN----5'（2）在对称轴的3 '侧切割产生3 '粘端5 '----NCTGCA ↓GN----3'Pst I 5'----NCTGCA GN----3'3'----NG ↑ACGTCN----5'3'----NG ACGTCN----5'+++（3）在对称轴处切割产生平末端5 '----NCCC ↓GGGN----3'Sma I 5'----NCCC GGGN----3'+ 3'----NGGG ↑CCCN----5'3'----NGGG CCCN----5'有些来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端，这类限制酶称为同尾酶。
但两种同尾酶切割形成的DNA片段经连接后所形成的重组序列，不能被原来的限制酶所识别和切割。
5'----A3'----TCTAG GATCC----3'G----5'5'----A GATCT----3' 3'----TCTAG A----5'5'----G GATCC----3' 3'----CCTAG G----5'Bgl II Bam H I 5'----AGATCC----3'3'----TCTAGG----5'同裂酶（isoschizomers）通常将能切割同一靶序列的限制性核酸内切酶称为同裂酶。
同裂酶产生同样的切割，形成同样的末端。
如Hpa II和Msp I。
5'----C CGG----3'3'----GGC C----5'（star activity）在某些条件下，一种特异性识别顺序的限制性内切酶在酶切同一种DNA片段时会产生新的酶切位点而得到不同的酶解片段的酶活性则称为星号活性。
（star activity）实例：Eco R I在正常情况下，识别6个核苷酸顺序GAATTC，但在异常情况下，可识别4个核苷酸的顺序AATT，酶切产物能电泳鉴定出现的DNA条带数比正常情况下有增加。
产生星号活性的因素:甘油浓度过高。
在限制性内切酶的浓度与DNA数量的比值为50 U/μg DNA时，甘油的含量为7.5%（v/v）便能引起星号活性。
当应用酶浓度与DNA数量的比值为10 U/μg DNA时，甘油含量高于15%（v/v）或以上也会引起星号反应。
离子强度不适合。
产生星号活性的因素:阳性离子的变化。
如将反应体系中Mg2+改为Mn2+时可促使Eco R I、Hin d III产生星号反应。
溶液中pH的变化。
如用Eco R I酶解时，反应体系中的pH值由pH2.5升高到pH8.5时也会出现星号反应。
有机溶剂残留的影响。
生物体内DNA的甲基化现象：原核细菌胞内DNA通常只有2-10％是甲基化(发生在识别顺序的腺嘌呤N-6位上或胞嘧啶第五位残基上)真核生物只有胞嘧啶可能被甲基化(已经发现真核细胞中的甲基化作用与转录作用的调节、细胞分化、染色体结构、DNA修复和DNA重组等多种功能有关)。
研究甲基化作用的工具：限制性核酸内切酶可作为研究甲基化作用的工具，检测在特定基因或遗传结构有关的片段内发生甲基化作用的状况(如Hpa II只能分解未甲基化的CCGG顺序，但Msp I对已甲基化和未甲基化的CCGG都能进行酶解，因此根据这两种酶切结果，便能确定DNA中甲基化胞嘧啶的数量和位置) 。
限制性内切酶对DNA甲基化研究的实例:研究腺嘌呤的甲基化作用：可用Sau3AL, Dpn I和Mbo I 等三种酶分别酶切进行比较(因为Sau3AI可以酶解GATC和G Me ATC (表示腺嘌呤核苷酸甲基化)两种识别顺序，而Dpn I只能分解G Me ATC顺序，Mbo I仅分解GATC顺序)。
限制内切核酸酶活性的检测方法粗放法: 早期测定是根据酶切DNA后DNA溶液的粘度变化来确定酶的活性。
精确法：酶的活性的检测通过比较酶降解DNA 片段的程度精确的进行定量。
基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶
一般酶的反应条件： 温度：37℃ PH：7.2 DNA酶切反应
（控制反应时间）
时间：2小时
完全消化
部分消化
1/14/2019
苏州科技学院生物系
叶亚新
影响限制酶消化DNA的若干因素
双酶消化
反应条件相同：同时加到反应管，同时反应 对温度要求不同：先低温消化，再高温消化 对盐浓度要求不同：先低盐酶消化，再高盐酶 消化
1/14/2019 苏州科技学院生物系 叶亚新
四．限制酶的特点
３）对称性—双对称 EcoRI 5’-G A A T T C-3’ 3’-C T T A A G-5’ ４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外 ５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ 2. 末端种类 １）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸 Pst I 5’-CTGCAG-3’ 5’-CTGCA G-3’ 3’-GACGTC-5’ 3’-G ACGTC-5’ ２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸 EcoRI 5’-GAATTC-3’ 5’-GOH PAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ 3’-CTTAAP HOG-5’
1/14/2019
苏州科技学院生物系
叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的特 异性可能发生变化，结果一种限制酶酶 切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC----AATT
1/14/2019 苏州科技学院生物系 叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGG N’ N’N’N’N’ CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起 ２）富含ＧＣ
基因工程教学大纲
基因工程教学大纲课程简介：基因工程技术是现代生物技术的核心技术。
以生物化学、微生物学、细胞生物学、遗传学、分子生物学等学科为基础，引入工程学的概念，通过周密的设计，进行精确的实验操作，高效率地达到目的。
本课程主要为本科生讲述基因工程技术中的基本原理和设计思路以及一些常用的实验方法。
教学目的：通过对基因工程的系统学习，使本科生对这门已经对社会经济发展产生了巨大影响，并已被誉为本世纪最具发展潜力的学科之一的新兴起的学科有所了解，清楚它的基本原理和工作思路，适应社会对高新技术的要求，为毕业生走向社会参加相关领域的生产和科研或报考研究生进行相关课题研究打下基础。
教学基本要求：基因工程是建立在生物化学、微生物学、细胞生物学、遗传学；分子生物学的基本原理和知识的基础之上的应用性科学。
所以要求学生有扎实的上述课程基础。
在听课的过程中随时复习所涉及的分子生物学基本原理，对没有听懂的知识点及时提问，以免影响对后面知识点的理解与掌握。
在课程结束前要求每位学生在课余查阅相关的文献资料，并写一篇专题报告。
对讲述本门课程的教师要求有比较丰富的基因工程研究实践经验和阅读大量的相关参考书和科研文献，认真备课，根据基因工程技术的发展及时更新讲稿或课件。
课程基本内容及学时分配：绪论（introduction to genetic engineering ）（2 学时）本章要点：掌握基因工程的含义和基因工程诞生的理论基础与技术突破。
了解基因工程的发展和在社会生产中的应用。
第一节基因工程的诞生一、基因工程的定义二、基因工程诞生的理论基础三、基因工程诞生的技术突破四、基因工程的诞生五、基因工程的特征六、基因工程的主要操作内容第二节基因工程的安全性一、基因工程的安全隐患二、重组DNA 研究的安全准则第三节基因工程的应用一、基因工程在农业生产中的应用二、基因工程在工业中的应用三、基因工程在医药上的应用四、基因工程在环境保护中的应用第四节基因工程技术的商业化发展一、商业投资支持现代生物技术研究二、基因工程商业化特点第一章基因操作的主要技术原理（4 学时）本章要点：掌握DNA 提取、DNA 电泳、分子杂交、PCR 扩增和DNA 序列测定的技术原理。
1 基因工程的酶学基础
④ DNA模板
dNTPs 5’ 3’
-OH
（3）用DNA聚合酶I 制备探针
① 核酸探针（probe） 能够同某种被研究的核酸序列特异 性结合的，带有标记的寡聚核酸分 子。
三、DNA聚合酶在基因工程中的用途 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 DNA聚合酶I (PolI) DNA聚合酶II (PolII) DNA聚合酶 III (PolIII) 参与DNA 的复制 参与DNA 的修复
大肠杆菌DNA聚合酶 I 主要用来制备带放射性标记的DNA探针。
（1）大肠杆菌DNA聚合酶I的性质
2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。 如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如 EcoRI）。
3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同 的限制与修复系统，用罗马字母表示。 如EcoR I，EcoR V。
四、影响限制性内切酶活性的因素
1. DNA的纯度
DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙 醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 如何解决？ ①纯化DNA ②加大酶的用量 ③延长保温时间 ④ 扩大反应体积（ >20l）
与DNA的来源无关。
（2）切割位点 识别位点处。 切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：
EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ EcoR V 5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’ 产生平齐末端
加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM
第三节 DNA聚合酶
一、基因工程中常用的DNA聚合酶 1.大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T4 DNA聚合酶 4. T7 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶
第二章 基因工程的载体和工具酶_PPT幻灯片
9 沉淀溶于20μl TE（含RNase A 20μg/ml），37℃水浴 30min以降解RNA分子，-20℃保存备用。
溶液 I
50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-HCl / 10 mM EDTA，pH 8.0
5 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色 絮状沉淀，可在冰上放置3-5min。
6 加入450μl的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心 12000g × 10min
7 小心移出上清于一新微量离心管中，加入2.5倍体积预冷的 无水乙醇，混匀，室温放置2-5min，4℃离心12000g×15min
开环双螺旋 （OC构型）
线状双螺旋 （L构型）
（二）质粒DNA的制备
分离质粒的方法有多种，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析 柱过滤法等。
目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括 培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA 分开及除去蛋白质和RNA。
碱变性法质粒提取的原理
在pH值12.0～12.5范围内时，线性的DNA会被变性而共 价闭合环状质粒DNA却不会被变性。
在pH值介于12.0 -12.5这个狭窄的范围内，线性DNA双螺旋结构 解旋变性。共价闭合环状质粒DNA的氢键会断裂，但两条互补链 彼此相互盘绕，紧密地结合在一起
溶液III
3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸（pH4.8）
加入后就会有大量的沉淀，是因为SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸 钾（potassium dodecylsulfate, PDS），PDS是水不溶的，因此发生了沉 淀；高浓度的盐(3 M醋酸钾) ，使得沉淀更完全；溶液III加入并混合均 匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点
第二章基因工程工具酶
M．HpaI C mCGG
HpaI C CGG 相同
2. E.coli 的dam、dcm甲基化酶
这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相 应的限制修饰系统。
Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺 嘌呤 N6 位置上引入甲基。 G mATC
Dcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入 甲基。 C mCAGG C mCTGG
DNA重组 限制酶（物理）图谱绘制 突变分析（RFLP分析） 限制酶的部分酶切与完全酶切
第二节 甲基化酶 （Methylase）
一、甲基化酶的种类与识别序列 二、甲基化对限制酶切的影响
原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一 员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。
3’-C T T A A G-5’ ►有些限制酶的识别序列不对称
AccBSⅠ C C G ↓ C T C
GGC↑GAG
►有些限制酶可识别多种序列
AccⅠ G T M K A C
CAKMTG
►有些限制酶识别的序列呈间断对称， 对称序列之间含有若干个任意碱基。
AlwNⅠ C A G N N N C T G
3. 哺乳动物的甲基化酶
该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化， 其甲基化反应与DNA复制、基因转录 等过程有关。
4. E.coli中依赖于甲基化的限制修饰系统
E.coli 中至少有 3 种依赖于甲基化的 限制系统 mcrA、 mcrBC 和 mrr ，它们
识别的序列各不相同，但只识别经过甲基 化的序列，都降解由 CpG 甲基化酶（M
在识别位点 下游 24-26bp
限制反应与甲基 化反应
分开的反应
互斥
《基因工程》第二章工具酶
•5’……G*A-A-T-T- C……3’ •3’……C- T- T-A-A*G……5’
PPT文档演模板
《基因工程》第二章工具酶
讨论:下面的序列中可能含有多 少个潜在的酶切位点?
•1
•2
•3
•4
•5
•GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAG
A
•6
PPT文档演模板
《基因工程》第二章工具酶
•一、DNA限制性内切酶 •二、甲基化酶 • 三、分子克隆过程中所需要的另一些酶
Hale Waihona Puke PPT文档演模板《基因工程》第二章工具酶
•（一）DNA聚合酶 •（二）RNA聚合酶 •（三）反转录酶 •（四）核酸外切酶 •（五）核酸酶S1
•（六）DNA酶 •（七）RNA酶 •（八）连接酶 •（九）末端转移酶 •（十）碱性磷酸酶
•1．大肠杆菌DNA聚合酶（E.Coli DNA polymerase）主要有3种 作用：
•①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA，填 补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空隙。 •②3’→5’的外切酶活性。消除在聚合作用中掺入的错误核苷酸。
•③5’→3’外切酶活性。切除受损伤的DNA。
PPT文档演模板
•DNA 甲基化酶普遍存在于原核和真核生物中， 能将 S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或者 是胞嘧啶上。
《基因工程》课程教学大纲
《基因工程》课程教学大纲课程名称：基因工程课程类别：专业主干课适用专业：生物技术考核方式：考试总学时、学分：32 学时 2 学分其中实验学时：0 学时一、课程教学目的通过对本门课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理、常用技术和工作思路，了解基因工程技术的应用及发展趋势，为进一步学习有关专业课及参加相关领域的生产和科研工作奠定基础。
二、课程教学要求本门课是以遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等学科为基础的学科，要求学生有扎实的上述课程基础。
本课程的主要内容包括: 基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程等。
要求学生掌握基因工程的基本原理和常用方法与技术，了解该领域的研究动态与发展方向。
课程的基本内容随着本学科的发展而调整并限定其广度和深度，在保证达到一定培养规格的前提下，考虑学生的接受能力和学习负担，同时注意本课程和其它相关课程的相互联系与衔接，防止疏漏和不必要的重复。
三、先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学。
四、课程教学重、难点教学重点：基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
教学难点：目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
五、课程教学方法与教学手段以教师讲授为主，要求教师认真备课，熟悉本课程的基本内容以及该学科的最新发展趋势，以合适的形式进行教学，提倡采用多媒体作为辅助教学手段；学生可以通过阅读相关的英文资料了解本学科的研究状况与发展方向，也可以阅读一些感兴趣的参考资料，训练其针对所感兴趣的问题进行深入探讨的能力。
六、课程教学内容第一章概述（1学时）1．教学内容（1）基因工程的概念；（2）基因工程的发展和历史；（3）基因工程的研究意义。
2．重、难点提示（1）重点：基因工程的概念；（2）难点：基因工程的基因原理及在生物工程中的地位。
第二章基因工程载体和工具酶
溶菌控制基因 晚期控制基因 DNA合成控制基因
cos
阻遏基因 早期控制基因
阻遏基因 重组基因
删除与整合基因
l - DNA
头部合成基因 尾部合成基因
COS 3’ 5’ TCCAGCGGCGGGG
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CCCGCCGCT 3’ COS
第二章基因工程载体和工具酶
λ-DNA载体的构建：删除重复的酶切位点
Plasmid plink 322
l 在pBR322基础上改建，增加了一个多接头 （polylinker），即增加了多克隆位点。
l 全长 3.8 kb
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第二章基因工程载体和工具酶
Plasmid plink 322
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第二章基因工程载体和工具酶
pUC 质粒(University of California)
第二章基因工程载体和 工具酶
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2020/12/10
第二章基因工程载体和工具酶
本章目录
l 2.1 载体 l 2.1.1 质粒载体 l 2.1.2 噬菌体载体 l 2.1.3 其他载体
l 2.2 工具酶 l 2.2.1 限制性核酸内切酶 l 2.2.2 DNA聚合酶和Klenow大片段 l 2.2.3 DNA连接酶 l 2.2.4 碱性磷酸酶 l 2.2.5 末端脱氧核苷酸转移酶
噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状 l Λ基因组三个区域：
左侧：包括外壳蛋白基因，20kb 中间区：18kb 右侧：复制及裂解基因，12kb
λDNA+外源DNA之和必须在39-53kb之间，所以可插入7-21kb的外源片
PPT文档演模板
第二章基因工程载体和工具酶
第二章 基因工程工具酶2
二、DNA片段连接的方法 片段连接的方法
1．连接反应一般在灭菌的 ．连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。 离心管中进行。 离心管中进行 2．10µl体积反应体系中：取载体 ． 体积反应体系中： 体积反应体系中 取载体50-100ng，加入一 ， 定比例的外源DNA 分子（一般线性载体 分子（一般线性载体DNA分 定比例的外源 分 子与外源DNA分子摩尔数为 ∶1～5∶1），补足 分子摩尔数为1∶ ～ ∶ ）， ），补足 子与外源 分子摩尔数为 ddH2O 至8µl。 。 3．轻轻混匀，稍加离心，56℃水浴 ．轻轻混匀，稍加离心， ℃水浴5min后，迅速 后 转入冰浴。 转入冰浴。 4．加入含 ．加入含ATP的10×Buffer 1µl，T4 DNA连接酶合 的 × ， 连接酶合 适单位， 补至10µl，稍加离心，在适当 适单位， 用ddH2O 补至 ，稍加离心， 温度（一般14-16℃）连接 温度（一般 ℃ 连接8-14hr。 。
*******
探针（ 探针（probe） ）
探针：用来探知被测物存在的小 用来探知被测物存在的小DNA或RNA叫做 用来探知被测物存在的小 或 叫做 探针。 探针。 标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标 记物。 分子杂交：探针DNA或RNA与被测物的互补结合 叫做分子杂交（molecular hybridization）
(c) 5‘ 3’ (d) 5‘ 3’ (e)
5‘ 3’
*
3‘ (d) polⅠ 将 32P标记的核苷酸 Ⅰ 标记的核苷酸 5’ 参入取代被移去的核苷酸 (e) 重复 重复(c)(d) 的步骤 ， 缺口 3‘ 沿 5’-3’ 方 向 移 动 ， 形 成 32P标记的核苷酸合成的 5’ 标记的核苷酸合成的 DNA链 链
2酶工程酶学基础PPT课件
COOH
丙酮酸
D－乳酸
.
31
绝对专一性
绝对专一性的另一个典型例子是天门冬氨酸氨裂合酶 [ EC 4.3.1.1 ] ,此酶仅 仅作用于L-天门冬氨酸，经过脱氨基作用生成延胡索酸（反丁烯二酸）及其 逆反应：
COOH
|
CH2
HOOC－C－H
|
天门冬氨酸氨裂合酶
||
H－C－NH2 ============= |
直接有关的部位。
结合基团
专一性
活性部位
必需基团
催化基团 催化性质
维持酶的空间结构
.
25
.
26
.
27
.
28
四、酶催化作用的特点
与非酶催化剂相比，酶具有如下显著特性 1、催化专一性强 2、催化作用效率高 3、催化作用条件温和
.
29
1.酶的催化专一性强
一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进 行某种类型的反应
.
7
第 3 大类，水解酶(Hydrolases)
催化各种化合物加水分解的酶称为水解酶。其反应通 式为：
AB ＋ H2O ＝ AOH ＋ BH 该大类酶的系统命名是先写底物名称，再写发生水解 作用的化学键位置，后面加上“水解酶”，例如，核 苷酸磷酸水解酶，表明该酶催化反应的底物是核苷酸， 水解反应发生在磷酸酯键上。
该大类酶的系统命名为“底物-裂解的基团-裂合酶”，如 L-谷氨 酸 1-羧基-裂合酶，表明该酶催化L-谷氨酸在 1-羧基位置发生裂 解反应。
推荐名是在裂解底物名称后面加上“脱羧酶” （ decarboxylase）、“醛缩酶”（aldolase）、“脱水酶” （dehydratase）等，在缩合反应方向更为重要时，则用“合 酶”( synthase) 这一名称。如谷氨酸脱羧酶（L-谷氨酸 ＝ γ-氨 基丁酸 ＋ CO2），苏氨酸醛缩酶（ L-苏氨酸＝ 甘氨酸 ＋ 乙 醛），柠檬酸脱水酶（ 柠檬酸 ＝ 顺乌头酸 ＋ 水），乙酰乳酸 合酶（ 2-乙酰乳酸 ＋ CO2 ＝ 2-丙酮酸）。